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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
Follistatin 基 因 编 码 的 卵 泡 抑 素（follistatin，
FST）是一种富含半胱氨酸的单链糖蛋白，因其对
卵泡刺激素有较强的抑制作用，又称其为促卵泡素
（FSH）抑制蛋白。FST 基因含 6 个外显子（exon）
和 5 个内含子（intron），全长约 6 000 bp，其中最后
一个外显子编码了氨基酸前体的 C 末端，在后期的
加工修饰过程中，能形成羧基末端截去 27 个氨基酸
的同系物［1，2］。在功能上，长期以来仅知是一种辅
助生殖调节的调节激素，近年来研究表明，FST 在
垂体、肾上腺、骨髓、肾、脂肪、骨骼肌和胰腺等
多种组织器官中广泛表达［3，4］，在胚胎发育、红细
收稿日期 ：2013-12-02
基金项目 ：国家生猪产业体系岗位科学家项目（CARS-36）
作者简介 ：孙亚蒙，男，博士研究生，研究方向 ：动物遗传育种与繁殖 ；E-mail ：symbuster_1986@163.com
通讯作者 ：刘娣，女，教授，博士生导师，研究方向 ：动物遗传育种与繁殖 ；E-mail ：liudi1963@163.com
敲减 FST 基因对猪成纤维细胞中相关基因表达的影响
孙亚蒙1  张冬杰2  汪亮2  张旭1  尹雪1  刘娣1，2
（1. 东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030 ；2. 黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨 150086）
摘 要 ： 旨在获得敲减 FST 基因的猪胎儿成纤维细胞，并探讨对相关基因表达的影响。将构建成功并鉴定准确的发夹 RNA
真核表达载体 FR1-shRNA 利用脂质体转染至猪胎儿成纤维细胞中，并进行 G418 筛选，获得稳定转染细胞株，并利用 Real-time
检测了相关基因表达的变化。结果表明，在稳定转染的细胞株中，FST 基因的表达受到显著抑制，结果导致了 ActivinR Ⅱ A、
Myostatin 和 Bmp4 基因的表达出现下调趋势，并且极显著地降低 MyoD 基因的表达。
关键词 ： 卵泡抑素（FST） RNA 干扰 猪胎儿成纤维细胞 相关基因
FST-related Genes Expression in FST Gene Knock-down Pig Fetal
Fibroblast Cells
Sun Yameng1 Zhang Dongjie2 Wang Liang2 Zhang Xu1 Yin Xue1 Liu Di1，2
（1. College of Animal Sciences and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030 ；2. Research Institute of Heilongjiang
Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150086）
Abstract:  In order to obtain FST gene knock-down pig fetal fibroblast cells and investigate the effects of related gene’s expression, the
short hairpin RNA eukaryotic expression vectors for FST was constructed and transfected into pig fetal fibroblast cells. After screened with G418,
transfected stable cell clones were obtained, and Real-time PCR was used to detect FST-related genes change in gene’s expression. The results
showed that in stably transfected cell lines, FST gene expression was significantly inhibited, then resulting in the expression of ActivinR Ⅱ A,
Myostatin and Bmp4 downward trend, and the expression of MyoD gene very significantly reduced.
Key words:  Follistatin（FST） RNA interference Porcine fetal fibroblast cells Related gene
胞生成［5］、神经细胞分化［6］、促进骨骼肌发育［7］
等方面发挥多种生物学作用。
RNA 干扰技术（RNAi）因其设计简单，操作性
强，并能高效特异地抑制靶基因的特点，近年来发
展迅速，并成功应用于包括人在内的多种物种的基
因功能研究和基因治疗等领域［8］。本研究通过 RNAi
技术，利用 shRNA 载体获得稳定抑制 FST 基因表达
的猪胎儿成纤维细胞系，并检测抑制 FST 基因表达
后对 ActR Ⅱ A、MSTN、Bmp4 和 MyoD 四个基因表
达的影响，旨在为 FST 基因的功能研究提供一定的
试验基础和理论依据。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期112
1 材料与方法
1.1 材料
RNA 干扰载体 pSilencer4.1-CMV neo 购自北京
欧比特公司 ；大肠杆菌感受态菌株 DH5α，购自原
平皓生物 ；限制性内切酶、dNTP、DL2000 Marker、
rTaq、氨苄青霉素等均购自宝生物工程（大连）有
限公司 ；FST 蛋白抗体和猪 β-actin 蛋白抗体购自
TransGen Biotech ；蛋白 Marker、蛋白抽提试剂盒、
BCA 蛋白定量试剂盒均购自康为世纪 ；SYBR Green
PCR Master Mix（5 mL）购自 ABI ；DMEM 培养基、
LipofectamineTM2000 购自 Invitrogen。
1.2 方法
1.2.1 猪 FST 基因干扰载体的构建 根据 GenBank
登录号为 NM_001003662.1 提供的 mRNA 序列，将
FST 基因完整编码区序列输入 ABI 公司的在线网站
进行干扰靶序列的设计与筛选。最终选择了 3 条
干扰序列，FR1 ：5-GATCCGCCTACTGTGTGACATG-
TATTCAAGAGATACATGTCACACAGTAGGCTTA-3 ；
FR2 ：5-GATCCCCTACTGGGCAGATCTATTTTCAA-
GAGAAATAGATCTGCCCAGTAGGTTA-3 ；FR3 ：5-
GATCCCCTCAAGGCCAGATGTAAATTCAAGAGATT-
TACATCTGGCCTTGAGGTTA-3，序列两端分别引入
BamH Ⅰ和 Hind Ⅲ酶切位点，以试剂盒所提供的与
猪的任何一个基因序列无同源性的非特异性质粒作
为阴性对照，同时合成其对应的互补链，退火、连接，
构建成功的质粒通过测序验证其准确性。
1.2.2 猪胎儿成纤维细胞的培养 选取 35 d 的胎猪，
无菌条件下剪去头、尾和内脏，用含高浓度双抗的
PBS 将预处理的组织漂洗 5 遍，将组织块剪成 1 mm3
的小块，向培养皿中加入 0.25% 胰蛋白酶的消化液
37℃消化 40 min，每隔 10 min 摇匀一次，消化后，
收集消化液，用 200 目灭菌的细胞筛过滤，收集滤
液以 1 000 r/min 离心 15 min，弃上清，将沉淀重悬
于 37℃预温的完全培养基中，然后进行常规的细胞
培养和传代，或冷冻保存。
1.2.3 细 胞 的 转 染 及 筛 选 将 转 化 成 功 的 FST-
shRNA 干扰质粒和阴性对照质粒进行去内毒素的抽
提和纯化，当细胞生长汇合至 80%-90% 时，使用
LipofectamineTM 2000（Invitrogen）将上述质粒进行转
染，其中质粒与脂质体的比例为 8 μg 质粒 ：20 μL
脂质体。同时设置一个正常培养的空白对照组。当
转染至 72 h 时，细胞用 400 μg/mL 的 G418 筛选 2 周，
直至空白组细胞完全死亡，然后使用 200 μg/mL 的
G418 维持培养。
1.2.4 Real-time 和 Western blot 方 法 筛 选 干 扰 序
列 提取各组细胞的 RNA，利用 Invitrogen 的反转录
试剂盒进行反转录。根据 FST 基因 mRNA 设计的引
物：上游 FST1：5-TGAGGGAAAGTGTATCAAAGC-3；
下 游 FST2 ：5-CTCGGTGTCTTCTGAAATGG-3。 同
时 使 用 猪 GAPDH 基 因 做 内 参， 对 FST 基 因 进 行
Real-time 检测。
收集各组细胞，制备裂解液，离心提取蛋白，
BCA 试剂盒对提取的蛋白定量，上样、转膜、封闭、
抗体孵育、压片。对 FST 基因的干扰效率进行鉴定。
1.2.5 实时荧光定量（Real-time）PCR 检测相关基
因的表达 收集试验组、阴性对照组和空白组细胞，
提取细胞的总 RNA，反转录，对各个基因的表达进
行 Real-time PCR 鉴定。Real-time PCR 的反应体系为：
反转录得到的 cDNA 模板 0.8 μL，10 μL SYBR Green
荧光染料 MIX，ddH2O 7.6 μL，上、下游引物各 0.8
μL。Real-time PCR 程 序 为 ：95℃ 10 min ；95℃ 30
s，60℃ 1 min，40 个 循 环 ；95℃ 1 min，55℃ 30 s，
95℃ 30 s。自动生成 Ct 值，以 GAPDH 为内参，2-ΔΔCt
法对结果进行校正，各基因的相对表达量重复 3 次，
取平均值。相关引物序列及参数见表 1。
1.2.6 数据分析 不同分组试验数据用 SPSS 16.0
软件进行分析，每个试验组至少 3 次重复，结果用
x
-
±s 表示。
2 结果
2.1 重组质粒的序列鉴定
重组质粒构建完成后，送至 Invitrogen 进行测
序，结果表明所有质粒序列均正确无误，分别命名
为 FR1-shRNA、FR2-shRNA 和 FR3-shRNA。
2.2 FST基因干扰效率检测
将筛选得到的稳定转染的试验组、阴性对照组
和空白组细胞分别提取总 RNA 和蛋白，进行比较分
析，实时荧光定量 PCR（图 1）和 Western blot（图
2）的结果表明，FR1-shRNA 组中，FST 基因的表达
2014年第6期 113孙亚蒙等 ：敲减 FST 基因对猪成纤维细胞中相关基因表达的影响
水平显著低于其他各组，提示 FR1-shRNA 稳定转染
的猪胎儿成纤维细胞中，FST 基因的表达受到抑制。
核发挥作用，首先要与Ⅱ型受体（ActivinR Ⅱ A 或
ActivinR Ⅱ B）结合，在猪胎儿成纤维细胞中，FST
的过表达能够使 ActivinR Ⅱ A 基因的表达量上调［10］，
而本研究中 FST 基因的抑制导致了 ActivinR Ⅱ A 基
因表达呈现下调趋势，揭示了二者之间的表达存在
正相关的关系。
TGF-β 超家族由一类结构和功能相似的多肽生
长因子亚家族组成，大量试验结果表明，Follistatin
能够通过与 TGF-β 超家族共有 β 亚单位与之结合，
从而拮抗其生物活性。Myostatin（MSTN）是已知的
最强的骨骼肌生长抑制物，骨形态发生蛋白（Bmp4）
不仅能诱导骨的形成，同时还对动物生殖系统的生
殖发育有重要的调节作用［11］。MSTN 和 Bmp4 都是
TGF-β 超家族的成员，FST 基因的过表达能够引起
二者表达量的下调［10］，而 FST 基因抑制表达也同样
引起二者表达量出现下调趋势。其具体的相互作用
机制还需进一步的研究。
生肌决定因子（MyoD）是脊椎动物成肌过程
的主要调控基因，对骨骼肌和肌细胞的形成和分化
起重要的调控作用［12］。Matzuk 等［13］发现，敲除了
FST 基因的小鼠出生时肌肉重量减少，这一结果与
本研究的结果相符，FST 基因的表达抑制使得 MyoD
的表达出现了极显著的下调，说明除了通过竞争性
地结合 MSTN 以外，FST 对骨骼肌发育的促进作用
表 1 引物序列及参数
引物名称 引物序列（5-3） 产物（bp） 退火温度（℃） 参考序列
ActR Ⅱ A GTTGCTGTGAGGGCAGTATGTGTGGTCCTGGGTCTTGAGTTG 234 60 NM_001204765.1
Myostatin AATGGTCATGATCTTGCTGTAACCTTGGTGTGTCTGTTACCTTGACTTCTA 87 60 NM_214435.2
Bmp4 TTCCTGGTAACCGAATGCTGATGGATGACGGCGCTCTTGCT 234 60 NM_001101031.1
MyoD GCGTGCAAACGCAAGACCGGGCAGCCGCTGATTCG 138 60 U12574.1
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
FR1-shRNA FR2-shRNA FR3-shRNA NC
FS
Tส
ഐⲴ
⴨ሩ
㺘䗮
䟿
*
FST
1 2 3 C NC
β-actin
* 代表差异显著
图 1 各 RNA 干扰组和阴性对照组中 FST 基因 Real-time
鉴定结果
1-3 ：分别为 FR1-shRNA、FR2-shRNA 和 FR3-shRNA 干扰质粒组 ；C ：空白
对照组 ；NC ：阴性对照组
图 2 FST 基因干扰后的 Western blot 鉴定结果
2.3 转染前后ActRⅡA、MSTN、Bmp4和MyoD基
因表达的变化
用 Real-time 方法检测稳定抑制 FST 基因表达的
成纤维细胞中 ActR Ⅱ A、MSTN、Bmp4 和 MyoD 四
个基因表达量的变化，结果（图 3）显示，与阴性
对照组和空白组细胞相比，FST 基因表达的干扰使
MyoD 基因的表达产生了极显著的下调（P<0.01），
同时其他 3 个基因的表达也产生了一定的下调趋势，
但差异不显著（P>0.05）。
3 讨论
激活素（activin，ACT）是一种调节组织细胞功
能的基本介质，它可以通过借助特异性的受体系统，
发挥广泛的生物学作用［9］。激活素若要进入细胞
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
MSTN Bmp4 MyoD
⴨ሩ
㺘䗮
䟿
RNAi NC
**
ActRĊA
** 代表差异极显著 ；RNAi ：干扰组 ；NC ：阴性对照组
图 3 Real-time 检测转染前后各基因相对表达量的变化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期114
还存在更为复杂的调控途径。
在 本 研 究 中，FR2-shRNA 和 FR3-shRNA 干 扰
质粒不仅没有抑制 FST 基因的表达，还使得 FST 基
因的表达出现了上调趋势。在前人的研究中也出现
过这种现象，Myostatin 基因沉默导致的双肌牛的肌
肉组织中，Myostatin 基因表达量高于正常的牛。这
种现象被认为机体为了维持该基因的正常表达，反
馈性的提高基因表达量导致，具体机制还有待进一
步研究。
4 结论
本研究通过 RNA 干扰技术成功获得了稳定抑制
FST 基因表达的猪胎儿成纤维细胞株，FST 基因表
达显著下调，并且导致了 ActivinR Ⅱ A、Myostatin、
Bmp4 和 MyoD 四个基因表达的变化，并极显著地降
低 MyoD 基因的表达。
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（责任编辑 马鑫）