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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
核糖体是合成蛋白质的重要细胞器，包括 40S
小亚基和 60S 大亚基。这些亚基分别有 4 种不同类
型的 RNA 和 80 种结构不同的蛋白质组成。RPS14
（Ribosomal protein S14）是 40S 亚基的组成成分，这
个蛋白属于 S11P 核糖体蛋白家族［1］。根据已有研
究，人类、酵母等真核生物体内的 RPS14 基因主要
负责 RNA 转录后加工，如 SSU-rRNA（small subunit
rRNA）的加工成熟与组装，从而调控蛋白质的翻译
过程。在中国仓鼠的卵巢细胞中，该基因的突变能
收稿日期 ：2012-06-28
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31071075）
作者简介 ：范艳荣，女，硕士研究生，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail: fyr888888@126.com
通讯作者 ：张飞云，副教授，硕士生导师，研究方向 ：植物分子生物学和植物分子病毒学 ；E-mail: feiyun39@126.com
拟南芥 RPS14 基因的克隆表达及功能初步研究
范艳荣  刘莹  张飞云
（首都师范大学生命科学学院，北京 100048）
摘 要 ： 拟南芥 RPS14（Ribosomal protein S14）是从拟南芥中分离出的一种核糖体蛋白，是核糖体 40S 亚基的组成成分，
属于 S11P 核糖体蛋白家族，主要负责 RNA 转录后加工。提取拟南芥总 RNA，用 RT-PCR 技术得到 RPS14 全长基因，经 T-A 克隆
插入到 pEASY-T3 载体上。利用亚克隆法成功构建 pGEX-6P-1-RPS14 原核表达质粒。GST-RPS14 融合蛋白在大肠杆菌 BL21（DE3）
中表达，分子量约为 43 kD。运用同样方法构建 pET-28a-AK6 原核表达质粒，获得大小约为 26 kD 的 HIS-AK6 融合蛋白。运用体
外 pull-down 技术，并用 SDS-PAGE 和 Western blot 进行验证，证明拟南芥 RPS14 蛋白与 AK6 蛋白之间存在相互作用。因此，推测
拟南芥的 AK6 与 RPS14 蛋白共同参与核酸代谢过程，影响 RNA 转录后加工，进而抑制拟南芥茎细胞的生长，使植株表现矮小特征。
关键词 ： 拟南芥 RPS14 AK6 Pull-down
Cloning，Expression and Function Preliminary Research of
RPS14 in Arabidopsis thaliana
Fan Yanrong Liu Ying Zhang Feiyun
（College of Life Science，Capital Normal University，Beijing 100048）
Abstract:  RPS14（Ribosomal protein S14）is a ribosomal protein of Arabidopsis thaliana. It is a structural component of 40S ribosomal
subunit and belongs to the S11P ribosomal protein family. It is responsible for RNA post-transcriptional processing. We extracted the total RNA
of Arabidopsis thaliana. The RPS14 full-length gene was obtained by RT-PCR. Through inserting the gene fragment into pEASY-T3 vector by
T-A cloning, we successfully constructed a recombinant vector pGEX-6P-1-RPS14. The GST-RPS14 protein was expressed in BL21（DE3）
strain and molecular weight was approximately 43 kD. We constructed the recombinant vector pET-28a-AK6 in the same way and obtained the
approximately 26 kD HIS-AK6 protein. We demonstrated the interaction between RPS14 and AK6 using pull-down, SDS-PAGE and Western
blot. Therefore, we speculate that they together participate in the nucleic acid metabolism and play a role in the RNA post-transcriptional
processing, thereby inhibiting growth of stem cells and making plants show dwarf phenotype.
Key words:  Arabidopsis thaliana RPS14 AK6 Pull-down
导致产生蛋白合成抑制剂，抵抗催吐剂的合成。
拟南芥腺苷酸激酶 6（Arabidopsis thaliana Ade-
nylate kinase 6，AAK6）是一种腺苷酸单磷酸激酶，
广泛存在于生物体中。AK6 基因已在大多数动物，
如人类、果蝇、线虫以及酵母中有了较深入的研究，
近年来人们开始探究 AK6 基因在植物体内的特性与
功能。以模式植物拟南芥为研究对象，已证实 AK6
蛋白具有腺苷酸激酶活性，能可逆地催化 γ 磷酸基
团 的 转 移（ 通 常 作 用 于 ATP）， 使 ATP 和 AMP 反
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期74
应生成两分子的 ADP，以此来维持细胞内的能量平
衡［2-4］。同时，脊椎动物、果蝇、酵母菌，以及植
物细胞核中存在一种亚核结构柯浩体，它能够行使
mRNA 和 rRNA 前体的拼接和剪接功能。在对人类
AK6 基因（HAK6/CBRF）的初步研究表明，AK6 基
因定位于柯浩体上，故又称为柯浩体调节因子，其
很可能在柯浩体上发挥重要作用，与真核细胞中核
糖体的组装相关［5，6］。通过前期的研究，从 aak6-/
aak6-突变体植株与野生型植株的生长状况对比可以
看出，突变体明显矮小［6，7］。
RPS14 基因参与 RNA 的转录后加工过程，推测
其可能影响植株的生长状况。本研究拟用体外 pull-
down 技术，并结合 SDS-PAGE 和 Western blot 检测，
旨在探究拟南芥中 RPS14 蛋白与 AK6 蛋白是否存在
相互作用，找到植株矮化的内在线索。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 和 质 粒 pEASY-T3、pGEX-6P-1 载 体、
pET-28a 载体、大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 与
TOP10、BL21（DE3）均为本实验室保存。
1.1.2 试剂 Trizol 试剂购自美国 TEL-TEST Inc。常
用化学无机盐等试剂均为北化分析纯试剂。逆转录
试剂盒购自 Fermerters 公司。高保真 PCR 试剂盒、
随机引物购自上海生工生物工程公司。T-A cloning
试剂盒购自全式金公司。各种构建载体所需工具酶
（如限制性内切酶、T4 连接酶等）购于 TaKaRa 公司。
质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒购自
QIN-GEN 公司。
1.2 方法
1.2.1 RNA 提取与检测及反转录 以拟南芥的叶片
为材料，用 Trizol 法提取 RNA，并用反转录试剂盒
反转录成 cDNA。
1.2.2 RPS14 基因的扩增 根据 GenBank 中 2g36160
序 列 利 用 PrimerPremier5.0 设 计 引 物， 上 游 EcoR I
酶切位点，下游加入 Xho I 酶切位点，引物序列为 ：
上游引物 ：5-GAATTCATGTCAAAGAGAAAGA-
CTAAAGAGC-3 ；下游引物 ：5-CTCGAGTCAGAGC-
CTTCTTCCTCTTCTAC-3。
以制备好的拟南芥 cDNA 为模板，扩增体系为
20 μL 反应程序 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 30 s，
58℃退火 40 s，72℃延伸 1 min，30 个循环 ；72℃ 5
min。反应结束后，取出 5 μL 进行电泳，检测是否
扩增出目的片段，检测到目的片段后用胶回收试剂
盒进行回收。
1.2.3 原核表达质粒的构建和鉴定 将纯化后的
PCR 产物和 pEASY-T3 连接，用限制性内切酶 EcoR
I 和 Xho I 进行双酶切，胶纯化以后将 PCR 产物与
pGEX-6P-1 线性片段连接，16℃连接过夜，连接体
系如表 1 所示。
表 1 PCR 产物与 pGEX-6P-1 线性片段连接体系
试验组 用量（μL） 对照组 用量（μL）
T4 连接酶 1 T4 连接酶 1
10×buffer 1 10×buffer 1
载体片段 1 载体片段 1
目的片段 7 ddH2O 7
将连接产物转化至大肠杆菌 BL21（DE3）感受
态细胞中，37℃活化 1.5 h 后涂 LB Amp 抗性平板，
置 37℃倒置培养。转化后，用抗生素筛选后的单克
隆进行如下程序检测 ：菌落 PCR 筛选—测序，最终
找出正确的重组克隆。
1.2.4 重组蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化 将测
序结果正确的重组质粒分别转化 BL21（DE3）感受
态细胞表达菌株，用 0.5 mmol/L 的 IPTG 诱导，16℃
23 h。5 000 r/min，30 min 离心，弃上清。用 5 mL
PBS 悬浮沉淀。然后超声破碎，4℃ 12 000 r/min 离
心 30 min，收集上清，上清和沉淀分别留少许进行
SDS-PAGE 检测。在上清中加入适量 GST beads，4℃
旋转令其吸附蛋白 2.5 h ；2 000 r/min，3 min 离心弃
上清 ；加入至少 50 mL PBS，轻摇至 beads 悬浮于
溶液中，2 000 r/min，3 min 离心，弃上清 ；重复用
PBS 洗 beads 两次 ； 加入 1 mL GST Elution Buffer，轻
摇 10 min ；2 000 r/min，3 min 离心，收集上清 ；重
复用 GST Elution Buffer 洗两次，收集上清进行 SDS-
PAGE 检测。通过 SDS-PAGE 电泳检测。
1.2.5 过表达的拟南芥 AK6 蛋白的获得 AK6 引物：
上 游 引 物 ：5-GGAATTCCATATGGCGAGACGTAAC-
CGTGGG-3（Nde I）；下游引物 ：5-CGGGATCCTCA-
GGGTTGCCATGCATTA-3（BamH I）。 其 他 方 法 同
2013年第1期 75范艳荣等 ：拟南芥 RPS14 基因的克隆表达及功能初步研究
RRS14 蛋白的制备。
1.2.6 体外 pull-down 寻找与 RPS14 相互作用的蛋白
及免疫检测 用 50 μL GST beads 和 1 mL GST-RPS14
蛋白在 4℃孵育，将过表达的 HIS-AK6 蛋白混合液
加入经处理的 GST beads 中，在 4℃旋转混合孵育 2 h，
用冰冷的细胞裂解液洗涤重复洗 3 次，SDS-PAGE
检测。取胶，在冰浴中转 PVDF 膜 2 h，将膜从电转
槽中取出，用去离子水与 PBST 稍加漂洗，浸没于
封闭液中缓慢摇荡 1 h。加含 HIS-Tag 标签的一抗，4℃
摇动孵育 2 h。用 PBST 洗膜 3 次，每次 5-10 min。
加入相应的二抗后，用 PBST 再洗膜 3 次，每次 5-10
min。最后进行自显影。
2 结果
2.1 总RNA的提取及反转录
用 Trizol 从拟南芥的叶片中提取 RNA，根据检
测的浓度利用反转录试剂盒将 RNA 反转录成 cDNA，
保存在 -20℃备用，结果如图 1 所示。
1 2
28S
18S
5S
1, 2. ：总 RNA
图 1 拟南芥总 RNA 提取
利用特异的上下游引物通过 PCR 程序从拟南芥
cDNA 中扩增目的条带，1% 的琼脂糖凝胶电泳检测
扩增出的 PCR 产物，结果（图 2）表明获得了与预
期片段大小相符的清晰的目的条带。
2.2 原核重组表达质粒的构建和鉴定
将 切 胶 回 收 的 目 的 基 因 PCR 产 物 与 pEASY-
T3 载体连接，用限制性内切酶 EcoR I 和 Xho I 37℃
双 酶 切 pEASY-T3-RPS14 和 pGEX-6P-1， 结 果（ 图
3）显示连接成功。把切下的目的基因和双酶切后的
pGEX-6P-1 载体 16℃过夜连接，转化，挑取健壮的
单克隆摇菌，用菌液 PCR 检测出单一条带，结果（图
4）显示为阳性菌株。将阳性菌株菌液送去测序。测
序结果与 NCBI 的相关序列比对完全正确。
bp bp
M 1
1200
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
453
M ：DNA Marker ；1 ：目的条带
图 2 目的基因 PCR 检测
M 1 2
2000
bp PGEX-6P-1
pEASY-T3
ⴞⲴสഐ
1600
1000
750
500
100
M ：DNA Marker ；1 ：双酶切 pEASY-T3 和目的基因的重组载体 ；
2 ：双酶切 pGEX-6P-1
图 3 目的基因及 pGEX-6P-1 的双酶切鉴定
M 1
2000
bp
ⴞⲴสഐ
1600
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker ；1 ：目的基因
图 4 菌液 PCR 检测
2.3 原核重组表达载体的表达、可溶性分析及蛋
白纯化
将测序正确的重组质粒分别转化到 BL21（DE3）
中，分别挑取健壮的单克隆培养至 OD600=0.6，加入
诱导剂 IPTG 在 16℃诱导 23 h ；5 000 r/min，30 min
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期76
离心，弃上清。用 5 mL PBS 悬浮沉淀。然后超声破
碎，上清和沉淀用 SDS-PAGE 检测，如图 5-A 所示。
蛋白纯化后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测得到比较
单一的条带，结果如图 5-B 所示。
170
kD M 1 2
M3 4 5 6 7
130
95
72
55
43
34
26
17
170
kD
130
95
72
55
43
34
26
17
ⴞⲴ㳻ⲭ ⴞⲴ㳻ⲭ
A B
M ：蛋白质 Marker ；1 ：pGEX-6P-1-RPS14 诱导前 ；2 ：pGEX-6P-1-RPS14 诱导后沉淀 ；3 ：pGEX-6P-1-RPS14 诱导后上清 ；
4-7 ：纯化后的 RPS14 蛋白
图 5 SDS-PAGE 电泳分析 RPS14 蛋白表达（A）及纯化（B）
kD
M 1 2
72
55
43
34
26
17
10
M ：蛋 白 质 Marker ； 1 ：RPS14 蛋 白 与 AK6 蛋 白 进 行 pull-
down ； 2 ：pGEX-6P-1 与 AK6 蛋白进行 pull-down
图 6 SDS-PAGE 检测 pull-down 结果
kD
M 1 2
72
55
43
34
26
17
10
M ：蛋白质 Marker ；1 ：用 HIS-Tag 抗体处理后对应的条带 ；
2 ：pGEX-6P-1 表达作为对照
图 7 Western blot 检测 pull-down 结果
2.4 过表达拟南芥AK6蛋白
获得 AK6 蛋白需构建原核表达质粒 pET-28a-
AK6，其中 pET-28a 中带有 HIS 标签，便于后续试
验中进行 Western blot 以鉴定 AK6 蛋白的存在，从
而证明拟南芥中 RPS14 蛋白与 AK6 蛋白发生相互
作用。
2.5 核糖体组成蛋白RPS14可能与AK6相互作用
将纯化后的 HIS-AK6 和 GST-RPS14 融合蛋白与
GST beads 共同孵育，经离心收集洗脱复合物和洗涤
后，再加入过量 GSH 获得相互作用蛋白的复合物，
去上清用 SDS-PAGE 检测（图 6）。取胶，在冰浴中
转 PVDF 膜 2 h，最后进行自显影。
Western blot 检 测 结 果（ 图 7） 显 示， 凝 胶 泳
道 1 转移膜上出现明显目的条带，且条带位于约 26
kD 处 ；而对照组凝胶泳道 2 转移膜上无目的条带出
现。由于试验组 pull-down 收集的上清液蛋白中，只
有 AK6 融合蛋白带有 HIS 标签，免疫检测加入识
别 HIS 标签的抗体，使 HIS-AK6 融合蛋白与之结
合，最后显色位置进一步证明上清液蛋白中确实存
在 AK6 蛋白，并确定 SDS-PAGE 结果中出现的 26
kD 处条带是 AK6 蛋白，从而也进一步证明拟南芥
中 RPS14 蛋白与 AK6 蛋白确实存在相互作用，共同
调控细胞能量代谢平衡，这在 AK6 缺失导致拟南芥
生长矮化的机制中可能发挥了重要作用。
2013年第1期 77范艳荣等 ：拟南芥 RPS14 基因的克隆表达及功能初步研究
3 讨论
拟南芥腺苷酸激酶 6（AA6）是 P-loop 激酶家
族成员，该激酶家族具有典型、保守的 Walk A 和
Walk B 结构域，其中 Walk A 结构域能够结合 NTP
分子，Walk B 结构域能够结合重要的辅因子 Mg2+，
能使 NTP+NMP=2NDP。核苷酸的平衡对多种细胞内
的功能非常重要，如细胞内能量的代谢及 DNA 和
RNA 的合成等。
由于 AK6 是腺苷酸激酶，在体外试验中，除
酵母外，人类、线虫、果蝇 AK6 的同源蛋白都具有
激酶活性［8，9］，能使所有类型的 NTPs 和 dNTPs 充
当磷酸供体，最适磷酸供体是 ATP 和 dATP。同时，
与拟南芥野生型植株相比，aak6-/aak6-纯合突变体
植株表现出明显的矮化［10］，暗示 AK6 基因的缺失
影响了细胞的形态和生长。
研究发现，酵母 RPS14 蛋白 C 端精氨酸突变成
丙氨酸时，与 Fap7（AK6 的同源蛋白）缺失的表型
相似，证实 YAK6（Fap7）能与核糖体蛋白质 RPS14
互作，共同促进 20S rRNA 前体中 D 位点的剪接过程，
使 20S rRNA 前体剪接为成熟的 18S rRNA，再进一
步组装为 40S 核糖体小亚基。如果把 Fap7 上 Walk
A 和 Walk B 结构域中几个保守的氨基酸突变以后，
能明显抑制 20S rRNA 前体的剪接和细胞的生长［11］，
说明 RPS14 基因对 RNA 的编辑起重要作用。
推测在拟南芥中，RPS14 和 AK6 也可能存在相
互作用。将 GST 空载，GST-RPS14 融合蛋白和 HIS-
AK6 融合蛋白在细菌中过表达，并亲和层析纯化。
将纯化后的 GST 空载，GST-RPS14 蛋白分别与 HIS-
AK6 蛋白在冰上同 GST beads 孵育，纯化的 GST 空载
作为负对照。用 SDS-PAGE 检测，结果显示 GST-
RPS14 和 HIS-AK6 特异性的结合，而负对照组不发
生结合。Western blot 进一步证实 GST-RPS14 和 HIS-
AK6 在体外有相互作用。
4 结论
本研究选用模式植物拟南芥作为试验材料克隆
了 RPS14 基因和 AK6 基因，并获得其可溶性蛋白
GST-RPS14 和 HIS-AK6。运用体外 GST pull-down 技
术得出，拟南芥 RPS14 蛋白与 AK6 蛋白存在相互
作用。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）