全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第2期
自 20 世纪 80 年代以来，研究人员发现病毒广
泛存在于海洋及淡水环境中，构成水生微生物群落
的重要组成部分［1，2］，其丰度高于细菌 1-2 个数量
级别，每升水中的数量高达 109 个病毒粒子［3］。科
学家曾推测，如果将海洋中庞大数量的病毒头尾相
连排成一列，则这个队列的长度将比地球附近的 60
个星系相互间的距离总和还要长［4］。这一惊人发现
使得人们对病毒在水环境中的生态学意义有了重新
认识，同时也激发了人们对病毒生态学功能的研究
兴趣。甚至有科学家认为这一重大发现如果提早若
干年，很有可能影响海洋地理及湖沼现代生物学的
收稿日期 ：2013-09-16
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31200019），江苏大学高级专业人才启动基金（11JDG151），中国博士后科学基金（20110491363）
作者简介 ：高恶斌，男，博士，研究方向 ：微生物分子生态学 ；E-mail: gaofei7908@126.com
分子生物学方法在浮游病毒多样性研究中的应用
高恶斌  王子乾
（江苏大学环境与安全工程学院，镇江 212013）
摘 要 ： 病毒是海洋及淡水微生物群落的重要组成部分，在调控微生物环路、驱动生物地球化学循环、维持浮游植物与细
菌多样性等方面扮演着重要角色。然而，传统的病毒培养及定量技术难以对浮游病毒群落结构与多样性进行深入而全面的解析。
微生物分子生态学技术的快速发展及广泛应用为此提供了新的途径。概述了克隆文库分析方法、凝胶脉冲场电泳（PFGE）技术、
DNA 指纹图谱、DNA 微阵列、宏基因组技术等分子生物学方法的基本概念及其在研究浮游病毒的种群结构与遗传多样性及其与环
境因素之间的相互关系等方面的应用状况。
关键词 ： 分子生物学方法 浮游病毒 群落结构 遗传多样性
Application of Molecular Biological Methods to Research on the
Genetic Diversities of Virioplankton
Gao Ebin Wang Ziqian
（School of the Environment and Safety Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）
Abstract:  Viruses are recognized as an important component of aquatic microbial communities in marine and freshwater environments,
and play a significant role in regulating microbial loop, driving global biogeochemical cycling and maintaining clonal diversities of phytoplankton
and bacterioplankton populations. However, the structure and diversity of virioplankton communities have not been extensively and overall
investigated using classical viral culture and quantitative methods, and the rapid development and application of molecular-ecological techniques
offer a new way. The basic concept of some molecular biological methods including cloning library, PFGE, DNA fingerprinting, DNA chip and
metagonemics were described, and their application to address the population composition and genetic diversities of virioplankton in natural
aquatic environment, and to investigate the ecological relationship between virioplankton and environmental factors.
Key words:  Molecular biological method Virioplankton Community structure Genetic diversity
发展方向［5］。如今，海洋及淡水中的病毒及其在生
态系统中的作用是病毒学与生态学研究相互渗透而
成的一个新的研究方向，成为水环境科学研究的热
点之一［6，7］。
浮游病毒是一个生态学概念，指悬浮于水体
中的各类病毒，包括噬菌体、噬藻体、真核藻病毒
和其他动植物病毒等［8，9］。以原核生物为宿主的
噬菌体与噬藻体是浮游病毒的主要类群，具有丰富
的遗传多样性。它们虽然个体极为微小，但十分活
跃，是水生态系统结构与功能的重要调控者，在调
节水体微生物种群大小、结构与多样性方面具有
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显著作用［10，11］，而且在微生物食物环（Microbial
loop）［12］、生物地球化学循环［5］、微生物之间的遗
传物质转移［13］，以及全球气候变化［14］等方面起
着不可忽视的作用。浮游病毒是引起水生态环境
中浮游细胞生物死亡的主要因素之一，对影响微生
物群落结构演替与水体初级生产力等起着重要作
用［15， 16］。特别是对有害藻类细胞的裂解作用，使得
病毒在防治有害藻华（赤潮）方面非常具有发展潜
力［17，18］。浮游病毒的群落结构及多样性研究，有助
于人们更加深入地认识浮游病毒在水生态系统中的
地位与功能及其宿主微生物之间的相互关系，甚至
为开发浮游病毒及其基因资源用于改善与保护水生
态环境具有重要意义。
对于浮游病毒的研究，最初着重于新病毒的分
离鉴定、形态特征、生物学特性以及与宿主相互关
系的研究，而关于它们在水体中的种群结构及其与
环境因素之间的生态学意义所知甚少。直到 20 世纪
90 年代后，随着微生物分子生态学技术在微生物多
样性及生态功能研究中的广泛应用，为研究浮游病
毒遗传多样性提供了新的方法。微生物分子生态学
技术涉及生物学、基因组学和生物信息学等学科的
理论知识，主要以病毒基因组 DNA 的序列信息为依
据，通过检测浮游病毒种群 DNA 序列多态性，鉴定
个体的基因型，在基因水平评价种群遗传分化，并
在分子水平上阐述浮游病毒的组成和群落结构及其
动态变化，更好地揭示病毒与环境之间的生态学意
义。目前，应用于原位环境中浮游病毒种群结构与
多样性研究的微生物分子生态学方法主要包括基于
PCR 的克隆文库分析方法、凝胶脉冲场电泳（PFGE）、
DNA 指纹图谱、DNA 微阵列和宏基因组文库等。微
生物分子生态学技术克服了病毒分离培养的限制，
可以在核酸水平上阐明浮游病毒遗传多样性及其动
态变化，极大了促进了浮游病毒群落结构与生态学
功能的研究。
1 克隆文库
克隆文库（Cloning library）分析方法是首先从
环境样品中提取出浮游病毒基因组总 DNA，利用针
对病毒的标记基因序列设计通用引物对样品总 DNA
进行 PCR 扩增，将 PCR 产物与合适的克隆载体连接，
并转化感受态细胞（大肠杆菌），得到大量含有不同
标记基因序列的转化子，然后对这些转化子的标记
基因序列采用测序技术或 PCR/RFLP 进行定性分析。
对于测得的序列，可以通过与 GenBank 数据库中已
有数据的对比鉴定其分类地位，或者分析标记基因
序列的类型和相对数量，从而得到浮游病毒群落结
构和多样性的信息。
利用克隆文库分析方法研究浮游病毒多样性，
关键是要确定好合适于浮游病毒检测分析的标记基
因。目前，对于浮游病毒体多样性的研究主要采用
病毒的结构蛋白基因 g20、DNA 聚合酶基因和辅助
代谢基因等序列作为其检测分子遗传标记。
1.1 结构蛋白基因g20（Structural gene g20）
结构蛋白 g20 基因（Structural gene g20）是肌尾
病毒科中存在的一段编码结构蛋白基因，其序列相
对保守［19］，被作为分子标记用于研究浮游病毒的遗
传多样性。研究者采用该基因序列作为遗传标记的
研究结果揭示了浮游病毒具有相当丰富遗传多样性，
而且不同水环境之间遗传多样性差异较明显。Chen
等［20］通过针对 g20 基因序列并构建克隆文库，研
究发现河口与开放海域间蓝藻病毒种类组成及结构
完全不同，同一位点处不同深度差异较大。Wilhelm
等［21］ 采用此方法分析了聚球藻噬藻体在加拿大
Laurentian 湖的东、中和西部均有广泛分布，而且淡
水噬藻体与海洋噬藻体的遗传多样性有很大的相关
性，但是又各成一支，推测其原因是与它们感染的
蓝藻宿主有关。
1.2 DNA聚合酶基因
DNA 聚合酶（DNA Polymerase）是 DNA 复制所
需的一种生化酶，具有高度保守的氨基酸序列，成
为研究浮游病毒遗传多样性及其亲缘关系的重要分
子标记。1995 年，Short 和 Suttle［22］首次采用 DNA
聚合酶基因片段的特异性引物从自然界样品中直接
分离到病毒的 pol 基因为基础，揭示了噬藻体和噬
菌体的 DNA 聚合酶基因具有相似性。Labonté 等［23］
通过 DNA 聚合酶基因序列发现，加拿大乔治亚湾及
墨西哥东北部湾的短尾科病毒分布非常广泛，且具
有丰富的遗传多样性。Chen 等［24］根据海洋短尾科
噬藻体 DNA 聚合酶基因序列设计兼并引物，对美国
2014年第2期 49高恶斌等 ：分子生物学方法在浮游病毒多样性研究中的应用
切萨皮克海湾夏、冬两季表层、中层及底层水中的
蓝细菌短尾病毒的多样性和动态组成进行研究，揭
示该海域短尾科蓝藻病毒相当丰富，且病毒种群结
构及多样性呈现出明显的季节性变化。黄思军等［25］
利用病毒 DNA 聚合酶基因序列对世界多处采集病毒
样品进行扩增，揭示了全球海洋中蓝细菌短尾病毒
的广泛分布。
1.3 辅助代谢基因
辅助代谢基因（Auxiliary metabolic genes，AM-
Gs）是病毒基因组中一类与宿主代谢功能相关的同源
基因，在特殊的环境中可有助于提高病毒的生存适
应性［26-28］。这类基因序列广泛存在于蓝藻病毒（噬
藻体）基因组，且由于不属于某一特定的病毒科，
可作为研究自然环境中蓝藻病毒种群结构与遗传多
样性的分子标记。目前，被作为标靶基因的辅助代
谢基因主要有光合作用基因 psbA、psbD 与焦磷核苷
酸水解酶基因 mazG，作为研究噬藻体遗传多样性
及其与宿主蓝藻间的相互关系的辅助方法。光合作
用基因 psbA、psbD 分别编码光系统Ⅱ反应中心的的
D1 和 D2 蛋白，是宿主光调控的关键基因［29］，其序
列具有一定的保守性。Chenard 等［30］根据 psbA 基
因序列对海洋及淡水噬藻体的遗传多样性进行研究，
并构建了系统发育树，结果发现海洋噬藻体具有不
同于淡水噬藻体的进化过程，而且蓝藻与噬藻体同
属一进化枝，由此推测噬藻体携带的光合基因来源
其宿主。mazG 是细菌中的焦磷核苷酸水解酶［31］，
起到调节营养压力应激的作用，是细胞程序性死亡
的调控子。Bryan 等［32］发现 mazG 基因广泛存在于
以聚球藻为宿主的肌尾病毒科和短尾病毒科噬藻体
中，且高度保守。此外，他们利用 mazG 基因检测
证明了噬藻体呈全球性分布，且不同噬藻体间频繁
进行横向基因转移。将辅助代谢基因作为病毒检测
的分子标记，不仅有助于认识环境中浮游病毒种群
多样性，而且可以在功能基因水平上了解病毒与宿
主生理状况的密切联系。
克隆文库分析方法只有在分析的克隆数目足够
多的情况下，才可以比较完整地认识种群组成的情
况，PCR 和克隆策略引入的误差会对克隆出的标记
基因序列及其鉴定产生偏差。由于浮游病毒是高度
差异的生物类群，缺少类似于细菌 16S RNA 的通用
分子标记，使得 PCR 获得的数据不全面，具有选择性。
此外，克隆文库分析法成本高，分析时间长，对病
毒群落结构变化进行动态跟踪研究受到很大的限制。
2 脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulsed-field gel electrophoresis，
PFGE）是一项依靠有规律地改变电场方向而使大分
子 DNA 得以分离的电泳技术，被广泛应用于所有的
生物基因组结构和功能的研究。由于该技术具有重
复性好、分辨力强、易标准化，结果准确稳定，不
受表型形状干扰等优点，被认为是进行分子生物学
分型的可信方法之一，其为确定同种生物之间的亲
缘关系提供了可靠的技术支持。
PFGE 技术最初是用于分析羊瘤胃内的噬菌体
基因组大小［33］，后来逐渐被用于分析海洋病毒生态
学研究［34-37］，并发展成为浮游病毒遗传多样性及其
种群动力学的重要研究方法。与常规的微生物计数
法相比，该技术可以获得不同水体中浮游病毒的群
落结构及多样性、动态变化、时空分布等特征。目
前，PFGE 技术已广泛用于研究不同水体中浮游病毒
基因组的大小、丰度及不同基因组大小浮游病毒与
环境因素间的相互关系。Wommack 等［8］采用 PFGE
技术对美国切萨皮克湾的浮游病毒种群动力学进行
检测，为期一年的研究结果表明该海湾内的浮游病
毒基因组大小范围在 50-300 kb 之间，而且浮游病
毒群落结构呈现明显的时空变化。利用 PFGE 技术，
Sandaa 与 Larsen［38］发现挪威海岸水域中的浮游病
毒群落多样性十分丰富，并呈现明显的季节性动态
变化。刘艳鸣、张奇亚等［39］采用 PFGE 揭示中国
武汉东湖存在 5 种不同大小的病毒基因组，大小范
围在 15-300 kb 之间，并证实了噬菌体和噬藻体是
构成东湖中浮游病毒群落的优势类群。Tijdens 等［40］
揭示了荷兰 Loosdrecht 湖浮游病毒基因组大小在 30-
200 kb 之间，并发现了该湖内浮游病毒种群动力学
与环境参数密切相关。此外，利用脉冲场凝胶电泳
结合 DNA 指纹图谱方法对病毒裂解宿主后病毒及其
宿主种群结构的变化进行研究，从而证实了病毒是
调节水体微生物多样性的重要因素［41］。近年来，病
毒编码的光合作用基因（psbA、psbD）及其生态学
意义成为浮游病毒生态学研究的热点之一。研究认
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为病毒的光合作用基因在感染宿主过程中的表达，
能够增强宿主光合能力，对增加病毒的裂解量与自
身生存率具有重要作用［42，43］。为了探索自然环境中
病毒光合作用基因及其多样性，Sandaa 等［44］利用
PFGE 方法对挪威海域浮游病毒类群进行分离，再采
用病毒光合作用基因引物进行 PCR 检测，结果发现
PFGE 分离的病毒中多数都含有 psbA 和 psbD，两类
病毒只含有 psbA，一类病毒只含有 psbD。
尽管 PFGE 是一种快速检测病毒种群的方法，
但该技术仅适于研究环境中浮游病毒群落的整体结
构，而对特定类群病毒基因组多样性的研究还存在
一定的不足。此外，对于基因组 DNA 大小相似的病
毒，PFGE 很难以有效的将它们区分开来，从而导致
对病毒多样性的检测结果偏低。
3 DNA 指纹图谱
DNA 指纹图谱（DNA fingerprinting）是用 PCR
扩增浮游病毒样品总 DNA 的标记基因序列，然后用
合适的电泳技术将其分离而成的具有特定条带特征
的图谱。DNA 指纹模式的不同就反映种群结构的不
同。按分离依据不同，DNA 指纹图谱可分为限制性
酶切片段长度多态性图谱、末端限制性片段长度多
态性图谱、随机扩增多态性 DNA 图谱和变性梯度凝
胶电泳图谱。
3.1 限制性酶切片段长度多态性
限制性酶切片段长度多态性（Restriction fragm-
ent length polymorphism，RFLP）技术是在生物多样
性研究中广泛应用的 DNA 分子标记。它的主要技术
原理是应用特定的核酸内切限制酶切割有关的 DNA
分子，经过电泳、原位转膜印迹、探针杂交、放射
性自显影后，分析与探针互补的 DNA 片段在长度
上的简单变化。该技术具有全新、快速、高效等优
势，可以在群落水平上提供几乎无穷尽的、反映遗
传多样性的可靠证据，可作为一种能高度灵敏检测
自然环境中微生物种群变化的方法。目前已应用于
浮游病毒群落结构和动力学研究，以及作为一种鉴
定未知病毒的筛选方法。1996 年，Chen 等［45］利用
RFLP 技术调查了墨西哥湾近海海域病毒群落的遗传
多样性，得到了 5 个不同的系统分类单元（OTUs），
均属于藻 DNA 病毒科，其中 4 个属于寄生藻病毒属，
而另 1 个 OTU 在寄生藻病毒属和金藻病毒属间形成
1 个单独的分支。Marston 等［46］利用 RFLP 技术研
究美国罗德洲近海海域噬藻体遗传多样性时，鉴定
了 36 种不同肌尾噬藻体的 g20 基因型，而推测短尾
噬藻体与长尾噬藻体是该海域内噬藻体种群的主要
成员。
3.2 末端限制性片段长度多态性
末端限制性片段长度多态性（Terminate-restric-
tion length fragment polymorphism，T-RFLP）是 RFLP
方法的进一步发展，它是利用一定的标记引物对样
品中的 DNA 进行特异扩增，在计算机程序自动分
析时仅分析荧光标记的末端限制片段，这样使得限
制片段长度多态性图谱更为简化，并且每个可见的
条带都代表一个“核型”或一个分类单元。此法能
够得到一个群落的特征指纹图谱，可用于比较不同
群落的相似性以及群落结构在时间和空间上的动态
变化。Jiang 等［47］利用 T-RFLP 技术调查研究了加
利福尼亚南部海域的噬菌体遗传多样性，并鉴定了
30 种不同的基因组 RFLP 带型，表明病毒多样性远
比其宿主的多样性要丰富，而且感染相同或相似宿
主的噬菌体遗传学组成相似。他们还发现此海域的
病毒基因组大小在 40 kb-200 kb 之间，并且呈垂直
分布状态，上层水域的病毒要比下层丰富。此外，
Sobecky 等［48］采用此方法发现水生态系统中病毒
参与的水平基因转移现象，而病毒介导的水平基因
转移是造成群落多样性的一个重要原因。2004 年，
Wang 等［49］研究美国切萨皮克湾噬藻体的遗传多样
性与种群动力学时，鉴别出许多新的 g20 序列，在
15 个 g20 序列中只有一个与已分离的噬藻体相近，
而且 T-RFLP 图谱分析表明该海湾中噬藻体的种群
结构及多样性受季节性变化影响比空间变化影响更
加明显。通过采用 T-RFLP 技术，Labonté 等［23］在
加拿大乔治亚湾及墨西哥东北部湾得到了与短尾病
毒相关的 29 个不同系统分类单元（OTUs），汪岷与
闫群等［50］在我国青岛近海春季水样中共获得 11 个
病毒 OTUs，并通过构建系统树的方法发现这 11 个
OTUs 聚成了 3 簇。
3.3 随机扩增多态性DNA
随机扩增多态性 DNA（Randomly amplified poly-
2014年第2期 51高恶斌等 ：分子生物学方法在浮游病毒多样性研究中的应用
morphic DNA，RAPD）由 Williams 建立的［51］，是利
用随意设计的长度为 8-10 bp 的非特异引物，在不
严格的 PCR 条件下（低退火温度）对基因组 DNA
随机扩增，获得一系列大小不同的产物，通过电泳
而产生了由一系列条带组成的指纹图谱。该技术克
服了 RFLP 方法的局限性，不需了解 DNA 序列，具
有操作简便、快速和经济等优点，在环境微生物
生态学研究中得到了广泛应用。Winget 等［52］采用
RAPD-PCR 评估 Chesapeake 海湾中浮游病毒群落的
丰富度动态变化，揭示了浮游病毒时间变化要比空间
变化更加明显。相比其他检测技术，RAPD-PCR 在
研究浮游病毒多样性时显得更加实用有效。
3.4 变性梯度凝胶电泳
变性梯度凝胶电泳（Denaturing gradient gel elec-
trophoresis，DGGE）方法是最先用于检测 DNA 突变
的一种电泳技术［53］。它主要是通过在一般聚丙烯酰
胺凝胶电泳的基础上添加了呈梯度分布的化学变性
剂（如尿素和甲酰胺），使核苷酸序列不同分子相近
的 DNA 片段沿着化学梯度的差异而滞留于凝胶的不
同位置，从而形成相互分开的图谱，该图谱可以看
成是微生物群落中主要种类的一个轮廓。该技术具
有可重复和容易操作等特点，能够提供微生物群落
中优势种类信息和同时分析多个样品，适合于调查
种群的时空变化、种群成员鉴定。
该方法往往结合 PCR 同时使用，首先利用针
对标记基因序列的特异引物进行 PCR 扩增，然后利
用 DGGE 把不同的碱基组成的序列分开，按照条带
位置的不同割取相应条带测序，进而分析病毒的多
样性和动态变化。DGGE 结合 PCR 方法已成为揭示
自然环境中浮游病毒群落结构、遗传多样性及种群
动态分析的有效手段。1999 年，Short 和 Suttle 针对
藻类病毒特异性 DNA 多聚酶（pol）基因片段进行
PCR 引物扩增，通过 DGGE 技术分离 PCR 扩增片段
并对不同片段进行克隆测序分析［54］，从而得知自然
海洋水中不同位置藻病毒群落的遗传多样性。2005
年，他们再次采用同样的方法分析了海洋环境中噬
藻体群落的遗传多样性［55］，并初步证实了噬藻体
与宿主间的依赖关系以及它们在地理分布上并无直
接联系的进化特点。Wilson 等［56］采用该技术方法
对福克兰群岛到英联合王国的大西洋横断面噬藻体
多样性空间分布进行研究，揭示了噬藻体的遗传多
样性及结构组成还与水体分层密切相关。Schroeder
等［57］采用此方法分析了球石藻赤潮前后海洋病毒
的多样性与种群动力学，得出浮游病毒种群多样
性发生了改变，Dorigo 等［58］采用此方法研究法国
Bourget 淡水湖中噬藻体多样性及其与环境因素相互
关 系。 最 近，Chénard 与 Suttle［59］ 利 用 PCR-DGGE
技术对淡水和海洋噬藻体 psbA 基因片段进行分析，
结果揭示了淡水噬藻体与海洋噬藻体的 psbA 基因有
不同的进化史，同一地理区域的噬藻体 psbA 基因结
构也存有差异。
4 核酸探针检测技术
核酸探针检测技术（Nucleic acid probe technol-
ogy）是根据碱基互补配对的原则，被标记的特异性
核苷酸探针（用放射性元素或荧光染料标记）以原
位杂交、Southern 印迹杂交、斑点印迹和狭线印迹
杂交等不同方法，可直接用来检测待测样品中的同
源核酸序列，从而获得 DNA 序列及片段长度多态性。
由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度
灵敏性，使得核酸分子杂交技术广泛应用于微生物
多样性的研究中，定性定量分析它们的存在、分布
和丰度。近年来，此方法被用于水环境中的病毒群
落的检测与生态作用研究。Wommack 等［60］采用核
酸杂交技术分析了 Chesapeake 海湾中浮游病毒群落
的时空动力学及其宿主生物之间的相互关系，结果
发现病毒在时间与空间上发生显著的丰度变化，并
且是导致细菌与浮游植物群落遗传多样性的重要因
素。
该技术所采用的探针必须是已知的病毒序列，
其检测结果只是已知的病毒，得不到新的病毒基因。
目前，NCBI 数据库里的病毒序列信息非常有限，难
以获得较为全面的病毒检测探针，因而在分析浮游
病毒多样性时获得的相关信息比较少。
5 DNA 微阵列
DNA 微阵列（DNA chip）也称为基因芯片（G-
eochip），是 20 世纪 90 年代中期发展起来的一门新
技术，它是采用原位合成或直接点样的方法，将成
千上万个基因有序的排列在固体载体上而形成微矩
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期52
阵，待检测样品用荧光分子标记后，与微阵列杂交，
通过荧光扫描及计算机分析即可获得样品中大量基
因的表达类型、突变情况及不同基因的组成与变化
情况，以达到快速、高效、高通量的分析生物信息
的目的。
DNA 微阵列应用于病毒多样性研究主要是从球
石藻病毒的全基因组测序开始，Allen 等［61］以球石
藻病毒 EhV-86 全基因组序列为基础设计探针并构建
EhV-86 的 DNA 微阵列，从基因水平上评估球石藻
病毒属的多样性，也从转录水平调查球石藻病毒的
感染过程。然后他们利用标记基因、宿主范围和微
阵列从基因型到表型上去探讨球石藻病毒的株间多
样性，通过微阵列结果发现以前认为是相同的两个
病毒株实际上存在较大差异［62］。以往基于 PCR 方
法的单个基因研究，可以获得浮游病毒遗传多样性
的相关信息，而在确定属内病毒间的遗传距离时受
到限制，应用 DNA 微阵列分析病毒属内的多样性，
可以很好地解决系统发生关系。DNA 微阵列分析能
检测同源基因差异性，提供影响生物多样性的重要
信息，但仅限制于用已知病毒基因做探针，在分析
中得不到新的基因。
6 宏基因组文库（Metagenomics library）
宏基因组的概念是由 Handelsman 等于 1998 年
首先提出的，也称为环境基因组，其定义是指特定
生境中全部微小生物遗传物质的总和［63］。与传统方
法相比，宏基因组技术主要利用非人工培养的分子
生物学技术、方法和手段进行系统分析微生物在环
境中的基因组集合，研究其群落结构与生态功能。
宏基因组学研究的基本思路是直接提取环境中特定
微生物群落的基因组总 DNA，克隆到合适的载体，
转化宿主细胞，形成一个高度复杂的重组 DNA 文库，
从文库中获得相关基因，避免了传统微生物学基于
分离培养研究的限制。
近年来，宏基因组学研究极大的推动了环境微
生物生态学的发展，为充分认识自然环境中浮游病
毒群落的遗传组成及其多样性开辟了新的研究途径。
2002 年，Breitbart 等［64］ 利用宏基因组学技术对 2
个天然海水水体中的病毒群体进行研究，开启了宏
基因组学在浮游病毒研究领域的应用。Breitbart 等［65］
运用宏基因组学结合数学模型的方法，推算 1 kg 的
近海表层沉积物中的病毒种类将超过地球上所有的
爬行动物种类的总和。Angly 等［66］运用宏基因组
学技术对北大洋、墨西哥湾、马尾藻海域和哥伦比
亚海域的病毒群体进行了研究，探讨了海洋病毒群
落的结构组成及及其分布状况，并发现双链 DNA
病毒可能是生物圈中遗传多样性的最丰富的群体之
一。宏基因组学不仅可以提供自然环境中浮游病毒
的群落结构及多样性数据，而且可以提供一些潜在
的病毒种群结构数据。Bench 等［67］构建了切萨皮克
湾浮游病毒宏基因组文库，并发现大量的未知病毒
和新病毒序列。Ngando 等［68］利用宏基因组技术对
Senegal 的一个超盐湖进行了病毒多样性研究，并发
现了许多的序列与 SEED 数据库不匹配（SEED 是由
GenBank 数据库和已测的所有基因组序列组成的数
据库）。2009 年，Sharon 等［69］通过已经获得的环境
病毒宏基因组文库进行比较分析，发现了一系列与
光系统 I（PSI）相关的基因序列，并揭示了这些基
因在噬藻体基因组中普遍存在。
利用宏基因组技术研究浮游病毒遗传多样性
时，克服了浮游病毒没有统一分子标记的不足，能
够获得比较全面可靠的数据。在宏基因组技术的应
用中，应加强与其他技术相结合，以减少单一技术
造成的偏差。对特定环境内的浮游病毒群落多样性
进行研究时，宏基因组文库技术可避免 PCR 偏好性
所导致的误差，而 PCR 文库可矫正构建宏基因组文
库的基因遗漏现象。因而，采用宏基因组文库结合
PCR 文库的分析方法，将会有助于不同环境中的病
毒群落结构与遗传多样性的精确研究。
7 结语
分子生物学技术在浮游病毒生态学研究中已
显现其独特的优越性，成为一种快速分析浮游病毒
群落组成结构与多样性的有效手段。在分析浮游病
毒多样性的过程中，通过采取多种分子生物学技术
方法结合使用，取长补短，相互补充，可以减少
单一分析技术的局限性，综合各类技术的优势，使
获得的浮游病毒生态学信息更为客观、真实和有效。
2014年第2期 53高恶斌等 ：分子生物学方法在浮游病毒多样性研究中的应用
参 考 文 献
［1］ Bettarel Y, Sime-Ngando T, Amblard C, Dolan J. Viral activity in two
contrasting lake ecosystems［J］. Appl Environ Microbiol, 2004,
70 ：2941-2951.
［2］ Suttle CA. Viruses in the sea［J］. Nature, 2005, 437 ：365-361.
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（责任编辑 狄艳红）