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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第12期
玉米是世界上最重要的粮食作物之一，常规育
种是品种进行改良的主要手段，但很多优良性状基
因无法通过常规育种手段导入玉米。随着转基因技
术的发展，转基因玉米育种逐渐成为玉米品种改良
的重要手段。
作为转基因手段之一，农杆菌转化正日益成为
玉米遗传转化优先选择的方法之一，它的优势主要
在于 T-DNA 转移系统的优越性，T-DNA 转移系统
进行转化时可以大比率的单片段插入完整外源基因，
并可稳定表达和遗传［1］，优先将外源基因整合进
染色体中插入活性高的区域［2，3］，整合进基因组的
T-DNA 经常是以单拷贝或低拷贝的形式存在，并且
收稿日期 ：2012-05-05
基金项目 ：北京市农林科学院科技创新能力建设专项（KJCX201102003），北京市科技新星项目（Z111105054511066）
作者简介 ：蒋惠泉，男，硕士，研究方向 ：玉米基因工程 ；E-mail: jhq329@gmail.com
通讯作者 ：刘亚，男，博士，副研究员，研究方向 ：玉米转基因 ；E-mail: srlyyd@gmail.com
适用于农杆菌侵染的玉米受体材料筛选
蒋惠泉1，2  任雯1  徐游2  张志方1  陈浩1  贺浩华2  赵久然1  刘亚1 
（1 北京市农林科学院玉米研究中心，北京 100097 ；2 江西农业大学理学院，南昌 330000）
摘 要 ： 以培育的 14 个玉米新系为材料，对幼胚的Ⅱ型愈伤产率和愈伤再生率，以及幼胚和农杆菌共培养后幼胚的 GUS 瞬
时表达率进行统计，据此判断不同自交系在组织培养中的潜力，及其是否为农杆菌的易侵染材料，最终试验选出了 zpm5 和 zpm6
两种既适合组织培养又对农杆菌敏感的基因型材料。在对成熟胚愈伤诱导率的统计中发现，成熟胚愈伤诱导率可以作为对幼胚愈
伤诱导的预测手段，两者的愈伤诱导率呈正相关性。
关键词 ： 农杆菌 玉米 愈伤组织 GUS 染色
Screening on Recipient Material for Agrobacterium-mediated
Transformation in Maize
Jiang Huiquan1，2 Ren Wen1 Xu You2 Zhang Zhifang1 Chen Hao1 He Haohua2 Zhao Jiuran1 Liu Ya1
（1Maize Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097 ；2College of Science，Jiangxi Agriculture
University，Nanchang 330000）
Abstract:  At present, Agrobacterium mediated genetic transformation in maize is widely used in the world. A good recipient material is
very important for the transformation system. In this study, 14 new inbreed lines were used to choose the suitable recipient material by analysing
embryogenic Type Ⅱ callus induction, plant regeneration rate and GUS transient expression. Zpm2 and zpm5 were finally screened for maize
transformation system. In the study of mature embryos callus induction, mature embryos callus induction rate can predict the growth status of
immature embryos callus and their callus induction show a positive correlation.
Key words:  Agrobacterium transformation Maize Callus GUS
在基因组中很少发生重排［4，5］。
影响农杆菌转化的因素有外植体类型和生长时
间、农杆菌株系、载体类型、培养基、共培养条件
等，其中基因型是影响愈伤组织诱导和再生的重要
因素［6，7］，Spencer 等［8］ 研究发现玉米的基因型、
幼胚大小及植株的发育状态是影响玉米幼胚培养及
植株再生的重要因素。Schalappi 等［9］通过农杆菌对
玉米幼胚亲和性的研究，证明感受态的细胞是农杆
菌转化所必需的，只有那些再生和整合能力强的感
受态细胞才能得到转化植株。玉米转基因试验的对
像目前主要集中在 A118 及其衍生系上，因其农艺
性状一般，转基因育种过程需要经过长时间的杂交
2012年第12期 83蒋惠泉等 ：适用于农杆菌侵染的玉米受体材料筛选
选育，由此造成较高时间成本，且流程繁冗，故而
对农杆菌转化体系而言，受体的筛选非常重要。
良好的受体材料是玉米遗传转化工作的关键所
在，为了拓宽转基因玉米的材料范围，本研究以本
实验室新育成的 14 个自交系，通过对幼胚、成熟
胚的组织培养分析以及与农杆菌共培养后的 GUS 瞬
时表达状况，以广泛用于农杆菌转化的 Hi-Ⅱ杂交
种［10-12］为对照，从 14 个新育成自交系中选出适合
农杆菌转化玉米幼胚的材料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试材料 试验用幼胚来自 14 个自交系以
及 Hi Ⅱ杂交种，使用夏季北京大田生长玉米，视玉
米生长积温情况，授粉后大约 9-13 d，待幼胚大小
2 mm 时摘取玉米幼穗。成熟胚诱导使用 5 个自交系
及 Hi Ⅱ杂交种为试验材料。
1.1.2 菌 株 与 质 粒 所 用 菌 株 为 LBA4404， 携 带
GUS 报告基因（图 1）。
LB. T-DNA 左边界 ；RB. T-DNA 右边界 ；P35S. 35S 启动子 ；NOS poly-A. NOS 终止子 ；35S poly-A. 35S 终止子 ；Intron/GUS.
带有插入序列的基因 ；phosphinothricin. 草甘膦抗性基因
图 1 质粒 pCAMBIA3301 T-DNA 区段示意图
LB 35S poly-A phosphino thricin P35S P35S intron/GUS NOS poly-A RB
1.2 方法
1.2.1 菌株活化 从 -70℃冰箱中取出农杆菌菌种，
用接种环蘸取，在含 Kanamycin 的 YEP 平板上划线，
于 28℃培养 2-3 d 后挑取单菌落接种入 5 mL YEP 液
体培养基的试管中，28℃ 200 r/min 摇床培养过夜，
随后将此 5 mL 菌液转入 50 mL 相同成分 YEP 培养
基上于相同条件下继续过夜培养，待 OD550>0.5 时
取出分装，4℃短期保存，长期保存时加甘油保存
于 -70℃。
1.2.2 培养基 培养基及试剂成分，见表 1。
培养基及试剂 成分
YEP Yeast extract 5 g/L，NaCl 5 g/L，Peptone 10 g/L，Agar 15 g/L，Kanamycin 100 mg/L，pH6.8
侵染 1/2 N6 salts，N6 vitamins，2，4-D 1.5 mg/L，L-pro 0.7 g/L，Sucrose 68.4 g/L，D-glucose 36 g/L，MES 0.5 g/L，Myo-inositol 0.1 g/L，
As 100 μmol/L，pH5.2
共培养 1/2 N6 salts 和 N6 vitamins，2，4-D 1.5 mg/L，L-pro 0.7 g/L，Sucrose 30 g/L，MES 0.5 g/L，Myo-inositol 0.1 g/L，DDT 0.154 g/L，L-cys
0.3 g/L，Silver nitrate 0.85 mg/L，As 100 μmol/L，Agar 8 g/L，pH5.8
幼胚诱导 N6 salts 和 N6 vitamins，2，4-D 1.5 mg/L，L-pro 0.7 g/L，Sucrose 30 g/L，MES 0.5 g/L，Myo-inositol 0.1 g/L，Silver nitrate 0.85 mg/L，
Phytagel 3 g/L，pH5.8
再生Ⅰ MS salts 和 N6 vitamins，Myo-inositol 0.1 g/L，Sucrose 60 g/L，phytagel 3 g/L，pH5.8
再生Ⅱ MS salts 和 N6 vitamins，Myo-inositol 0.1 g/L，Sucrose 30 g/L，phytagel 3 g/L，6-BA 0.5 mg/L，pH5.8
成熟胚诱导 N6 salts 和 N6 vitamins，2，4-D 4 mg/L，L-pro 0.7 g/L，Sucrose 30 g/L，CH 1 g/L，Myo-inositol 0.1 g/L，Silver nitrate 10 mg/L，Phytagel 3 g/L，
pH5.8
GUS 检测液 pH0.7 的 0.1 mol/L 磷酸钠缓冲液，K3［Fe（CN6）］0.5 mmol/L，K4［Fe（CN6）］·3H2O 0.5 mmol/L，Na2EDTA 10 mmol/L，X-gluc
1.9 mmol/L
注 ：Inf 过滤灭菌，Co-C 培养基使用前一天配制，3 d 内使用
表 1 试验用培养基与试剂
1.2.3 幼胚组织培养 取胚大小在 2 mm 左右的玉米
幼穗，1∶5 配次氯酸钠溶液，加入 0.1% Tween 20，
将穗子浸入灭菌 20 min，灭菌过程中每隔 3-5 min
旋转穗子使灭菌均匀。超净台上剥胚，剥出的幼胚
置于不含 AS 的侵染培养基中，清洗 2-3 次后转移
入幼胚诱导培养基，每 20 d 左右继代一次，培养约
两个月后统计愈伤类型与比率。
1.2.4 愈伤再生 将愈伤转移到 I 型再生培养基上
28℃暗培养约 3 周，待愈伤变白后将其转移至 II 型
再生培养基，光照下进行萌芽（25℃，16 h 光周期，
80 μE/m2/s）。以单个幼胚脱分化形成的愈伤可成功
再生成苗计作一个事件，包括Ⅰ型或Ⅱ型愈伤成苗。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期84
1.2.5 成熟胚组织培养 将成熟种子清除老皮后放
入三角瓶中，先用洗涤剂洗 5 min，再用自来水冲洗
干净，再加入 75% 酒精洗 2 min，随后 0.15% 升汞洗
7-8 min，最后用无菌水冲洗 6 次。将消过毒的种子
放入含 4 mg/L 2，4-D 无菌水的平皿内，胚面翻向上，
平皿内预先垫两层无菌吸水纸，于 27℃暗处培养
24-72 h，待种子刚刚涨破种皮刚要萌发时取出。将
种子从胚芽部位纵切两半，用解剖刀挑中间生长点
部位约 2 mm，放入成熟胚诱导培养基中，切口向下
培养，初次继代时间为 30 d，随后约 3 周继代一次。
1.2.6 幼胚侵染 从 4℃冰箱取出菌种，以 4% 的量
接种于含相同抗生素的新鲜 YEP 液体培养基中，在
摇床上 200 r/min 摇振 16 h 后，离心机上 3 000 r/min
离心 3 min 获取菌体，使用含 100 μmol/L AS 的侵染
培养基重悬，调节农杆菌的量使 OD550 在 0.3-0.4 的
范围之间。
新剥出的幼胚临时存入含 AS 的侵染培养基内，
待剥胚完成后以相同侵染培养基洗涤 2-3 次，而后
加入 1.5 mL 农杆菌悬浊液（OD550=0.3-0.4）。将含菌
液与胚幼的离心管上下摇动约 20 次，20℃侵染 10
min，随后将幼胚转移到共培养培养基的表面，胚的
盾片面向上，吸出多余的农杆菌菌液，20℃共培养
3 d。
1.2.7 GUS 染色 将共培养后的自交系幼胚转移入
含 GUS 检测液的 EP 管，37℃保温过夜，目测或显
微镜观察染色位置与染色率，以幼胚组织呈现蓝色
斑点为染色标志。
2 结果
2.1 幼胚愈伤诱导率与愈伤生长状况
试验以幼胚大小在 1.5-2.0 mm 之间为采摘标准，
选择幼胚大小在 2 mm 左右的玉米幼胚，以幼胚愈
伤培养基进行组织培养，统计幼胚愈伤类型与再生
率，与 GUS 染色率数据共同列于表 2。
表 2 玉米幼胚愈伤诱导与 GUS 染色
玉米基因型
愈伤诱导与再生 GUS 染色
样本数 Ⅱ型愈伤率（%） 再生率（%） 染色数 百分率（%）
zpm1 38 31.58 52.63 42/120 35.00
zpm2 182 10.44 45.83 43/46 93.48
zpm3 139 16.55 58.33 20/115 17.39
zpm4 93 0.00 64.29 51/56 91.07
zpm5 143 40.56 83.87 45/70 64.29
zpm6 169 59.76 41.67 36/94 38.30
zpm10 113 0.00 66.67 34/81 41.98
zpm12 60 71.67 76.67 2/81 2.47
zpm13 51 0.00 50.00 18/55 32.73
zpm15 54 0.00 38.71 24/78 30.77
zpm16 86 0.00 51.61 27/116 23.28
zpm17 56 0.00 0.00 1/38 2.63
zpm19 99 0.00 8.33 16/49 32.65
zpm20 47 0.00 16.67 65/110 59.09
Hi Ⅱ 111 63.96 80.00 32/76 42.11
由表 2 可见，玉米幼胚的愈伤组织类型受基因型
影响非常大，zpm4、zpm15、zpm16、zpm17 和 zpm19
的Ⅱ型愈伤诱导率明显低于其他自交系。Ⅱ型愈伤
诱导率指标在植物组织培养中非常重要，松脆的 II
型愈伤组织生长迅速，可以长期继代并保持胚性，
虽然Ⅰ型愈伤在组织培养过程中，有一定机率会转
化成Ⅱ型愈伤组织，但转化比例不是很大。试验中
发现，Ⅱ型愈伤诱导率在 30% 以上的玉米品系有
zpm1、zpm5、zpm6 和 zpm12， 其 中 zpm6 和 zpm12
经培养后得到了近似和超出对照 Hi Ⅱ的Ⅱ型愈伤诱
导率。
再生率方面，研究发现对照 Hi Ⅱ杂交种明显
2012年第12期 85蒋惠泉等 ：适用于农杆菌侵染的玉米受体材料筛选
高于其他 14 个供试的自交系，Ⅱ型愈伤产率较高
的 zpm1、zpm5、zpm6 和 zpm12，其 再 生 率 分 别 为
52.63%、83.87%、41.67% 和 76.67%，虽然 zpm6 的
再生率较低，但因其Ⅱ型愈伤产率较高，所以也被
认为是适于组织培养的材料，最终我们认为Ⅱ型愈
伤产率较好的 zpm1、zpm5、zpm6 和 zpm12 为适用
于组织培养的材料。
2.2 成熟胚与幼胚愈伤的有效诱导率比较
zpm1、zpm2、zpm5、zpm12、zpm15 与 Hi Ⅱ 杂
交种被用在成熟胚与幼胚的愈伤诱导率比较上，Ⅲ
愈伤不列入数据统计，以Ⅰ型和Ⅱ型愈伤的总和为
愈伤有效诱导率，见图 2。
和图 4 所示。
图 2 成熟胚与幼胚愈伤诱导率比较
HiĊ zpm1 zpm2 zpm15zpm12zpm5
R2=0.766
P=0.076
ᒬ㜊
ᡀ⟏㜊
᜸Ք
䈡ሬ
⦷%

120
100
80
60
40
20
0
૱㌫
从图 2 可见，成熟胚的诱导率均低于幼胚的
诱导率，差异最大的 Hi Ⅱ杂交种的幼胚诱导率为
89.7%，而成熟胚仅为 13.1%。差异最小的是 zpm5，
幼胚诱导率为 97.9%，成熟胚的诱导率为 62.8%，6
种基因型玉米百分比差异从 35.1% 至 76.6% 不等。
成熟胚与幼胚的诱导在不同基因型间的差异上
表现出了一致性，图 2 显示，zpm2、zpm5、zpm12 和
zpm15 中幼胚与成熟胚的诱导率在基因型间表现
出 了 一 致 的 波 动， 幼 胚 中 诱 导 率 zpm5>zpm12>
zpm15>zpm2， 在 成 熟 胚 同 样 如 此， 虽 然 zpm1 和
Hi Ⅱ在与 zpm2 没有表现出幼胚与成熟胚的一致，
但在与 zpm5 和 zpm12 进行比较时，可以看到这一
规律的存在。但在使用 SPSS 软件进行数据相关性分
析发现，二者相关系数 R2=0.766，P=0.076，表示成
熟胚与幼胚诱导率间的相关性未达到显著水平。
2.3 自交系的GUS染色率初筛
以目前应用广泛的 LBA4404 菌株分别侵染 14
个自交系与 Hi Ⅱ杂交种，共培养后进行 GUS 染色
（图 3），统计它们的 GUS 瞬时表达率，结果如表 2
G
U
Sⷜ
ᰦ㺘
䗮⦷
%
100
80
60
40
20
0
zp
m1
zp
m2
zp
m3
zp
m4
zp
m5
zp
m6
zp
m1
0
zp
m1
2
zp
m1
3
zp
m1
5
zp
m1
6
zp
m1
7
zp
m1
8
zp
m2
0
Hi
Ċ
૱㌫
图 4 自交系的 GUS 瞬时表达率
有两个自交系材料 zpm2 和 zpm4 的染色率超过
了 80%，检验未发现染色异常，80% 以上的 GUS 染
色率在农杆菌侵染幼胚过程中比较少见，说明这两
种自交系为农杆菌易感材料。GUS 染色率在 40% 左
右的自交系有 zpm2、zpm4、zpm5、zpm6、zpm10 和
zpm20，由于作为对照的 Hi Ⅱ杂交种 GUS 染色率为
42%，所以认为 GUS 染色率与 Hi Ⅱ相近的以上 6 个
自交系基因型皆为具有农杆菌侵染潜力的材料。
Ⅱ型愈伤形成率与 GUS 染色率之间并不存在
直接的相互关系，较高的Ⅱ型愈伤形成率可以同
时具有较低的 GUS 染色率，反之亦然。研究表明，
在 14 个自交系中，具有农杆菌转化潜能的自交系
有 zpm2、zpm5 和 zpm6， 其 中 zpm5 和 zpm6 较 好，
zpm2 次之。但鉴于 zpm12 在组织培养过程中有非常
好的Ⅱ型愈伤形成率，zpm1 也有较高的Ⅱ型愈伤产
率，故而可在侵染方法上适当加以改进，以适应对
此两种自交系的侵染。
图 3 GUS 染色的幼胚
3 讨论
3.1 幼胚愈伤形态对转化率的影响
Gutlitz［13］认为，每个植物细胞所能承受的接
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期86
种量是有限的，一旦超过了限度，细胞就会受到损
伤，从而导致转化效率的降低。在农杆菌与幼胚作
用的宿主 - 病原作用体系中，病原的侵染通常由于
侵染细胞部位的细胞死亡而中止，这一细胞自我应
激机制是由细胞受伤后发生过敏反应，由其活性氧
基快速大量产生介导的［14］。在选择培养过程中，受
选择压力与农杆菌压力死亡的愈伤组织产生的有毒
物质常会对健康愈伤组织产生毒害，容易形成 I 型
愈伤组织的玉米基因型胚性差，再生性弱，选择培
养过程中健康愈伤组织与死亡愈伤组织经常结为一
体，难以分开，造成健康愈伤组织的死亡。成块状
的 I 型愈伤组织也使筛选剂难以对愈伤形成全面接
触，从而产生嵌合体，松脆的 II 型愈伤组织则生长
迅速，在选择培养中可以全面接触筛选剂，容易分散，
易于获得抗性愈伤。
研 究 发 现， 自 交 系 zpm3、zpm10、zpm13 和
zpm20 的Ⅲ型愈伤皆大于 40%，即在普通组织培养
条件下死亡率接近一半，在抗性愈伤筛选过程中，
培养基中的抗生素与筛选剂往往也会对幼胚产生不
良影响［15］，受农杆菌侵染的玉米愈伤细胞也更容易
遭受细胞应激产生的过敏反应［16］，所以如果在单独
培养时，玉米幼胚愈伤的Ⅲ型愈伤比率很高，在用
农杆菌侵染时，愈伤质量将更差。
3.2 成熟胚愈伤诱导在自交系筛选中的运用
相对于玉米幼胚，玉米成熟种子有取材方便、
不受生长季节限制、受体均匀等优点。Green 等［17］
首次报道利用成熟胚可以诱导愈伤组织，但没有
再生植株。Wang 等［18］ 从两个玉米自交系 B73 和
Mo17 的成熟胚中诱导出愈伤组织并再生植株，但再
生频率非常低。2004 年 Huang 等［19］通过对 7 个自
交系材料的研究，初步建立了成熟胚途径的胚性愈
伤组织诱导和植株再生体系，其植株再生效率达到
19.8%-32.4%。与本研究的结果相吻合，曹俊梅等［20］
报道幼胚的愈伤诱导率与成熟胚的愈伤诱导率有直
接的关系，两者的诱导率呈正相关，因此可以通过
对成熟种子进行成熟胚初筛，根据成熟胚的愈伤诱
导情况推测其在幼胚中的诱导率。
从目前的研究来看，使用成熟胚作为转基因体
系的受体还不太成熟，Sidorov 等［21］利用 7-10 d 的
幼苗中胚轴诱导愈伤组织，使用农杆菌进行遗传转
化，获得 2％-11％的转化率。对于成熟胚萌动的胚
芽所诱导的胚性愈伤组织而言，王世玉等［22］曾报
道了使用基因枪法可在成熟胚诱导的愈伤组织中观
察到 GFP 瞬时表达率，但目前并无使用成熟胚诱导
的愈伤获得转化苗的报道。从本研究的结果看，成
熟胚所诱导的愈伤组织品质差，Ⅱ型愈伤产率低，
因此找到一种适合成熟胚愈伤诱导的培养基是将成
熟胚愈伤用作农杆菌转化受体的关键。
3.3 根据GUS染色率筛选符合农杆菌侵染的受体
GUS 染色［23］通常用于估测在农杆菌与侵染受
体共培养结束后，玉米盾片部细胞的 T-DNA 早期转
移事件和 T1 代叶片中的基因插入情况，插入到 GUS
编码区的内含子序列可阻止 GUS 基因在农杆菌中的
表达。Frame 等［12］在 2002 年以 Hi Ⅱ幼胚为材料，
以 GUS 瞬时表达率为标准研究 L-Cys 的添加对体系
的影响，在共培养后获得 50%-85% 不等的 GUS 染
色率。黄雪清等［24］使用 3 种株系的农杆菌侵染自
交系，在使用 LBA4404 侵染 4 种自交系时，获得
14.5%-24% 的 GUS 瞬时表达率。
作为农杆菌侵染玉米幼胚后的初步检测手段，
GUS 瞬时表达率并不代表最终转化率，GUS 染色只
代表在共培养阶段后有携带 GUS 片段的 T-DNA 转
移进入了幼胚并获得表达。有研究表明，增加农杆
菌浓度可以提高 T-DNA 的转移率，但 T-DNA 转移
率效并不代表最终转化率，随着农杆菌接种量的提
高，GUS 瞬间表达率随着农杆菌浓度的提高而上升，
但愈伤组织的诱导率却随之下降，从而导致转化率
的下降［11］。尽管如此，GUS 染色分析因其检测周期
短，表观性强，在材料筛选与条件优化的研究中仍
具有相当大的应用价值。
4 结论
本研究通过对新育成玉米自交系的成熟胚、幼
胚组织培养，并在共培养后对幼胚 GUS 染色分析，
初步建立了适宜玉米遗传转化材料选择的试验流程：
首先根据成熟胚种子与对照组所诱导出的成熟胚愈
伤，预测幼胚的愈伤诱导情况 ；统计幼胚在去掉筛
选剂及抗生素的选择培养基上的愈伤生长情况，淘
汰不适应组织培养的玉米基因型 ；最后根据共培养
2012年第12期 87蒋惠泉等 ：适用于农杆菌侵染的玉米受体材料筛选
后幼胚的 GUS 瞬时表达率，选择出可使用农杆菌进
行转化的玉米基因型。
在本次筛选的自交系中，以 Hi Ⅱ杂交种为对照，
Ⅱ型愈伤产率在 30% 以上的有 zpm1、zpm5、zpm6
和 zpm12，其中 zpm6 和 zpm12 经培养后得到了近似
或超出 Hi Ⅱ的Ⅱ型愈伤产率，上述 4 种玉米基因型
材料从组织培养角度，可作为转化系统的受体材料。
综合 GUS 染色率，最终选择 zpm5 和 zpm6 作为农杆
菌侵染的受体材料。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）