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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第2期
收稿日期 : 2011-07-16
基金项目 : 国家自然科学基金项目（51073073）, 国家“863”计划项目（2008AA02Z203）, 江苏省高等学校优秀科技创新团队项目（苏教科
2009-10 号）
作者简介 : 陈忍忍 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 羊毛纤维的生物功能化改性 ; E-mail: chenrenren2007@163.com
通讯作者 : 王强 , 男 , 副教授 , 硕士生导师 , 研究方向 : 纺织生物技术 ; E-mail: qiang_wang@163.com
羊毛防毡缩用蛋白酶的化学修饰
陈忍忍 范雪荣 王强 袁久刚 朱怡然
（江南大学 生态纺织教育部重点实验室，无锡 214122）
摘 要 : 为减少防毡缩整理中蛋白酶对羊毛纤维主体结构的破坏作用，分别研究了戊二醛、微生物谷氨酰胺转氨酶（MTG）
和水溶性碳二亚胺（EDC）对蛋白酶 Savinase 16L 的化学修饰，以期达到增大蛋白酶分子量，从而将水解作用限制在纤维表面的目
的。主要通过体积排阻色谱、SDS-PAGE 谱图以及荧光光谱研究修饰酶的分子量和结构变化。结果表明，戊二醛不能对蛋白酶分
子进行有效修饰 ；MTG 会被蛋白酶水解，无法催化酶分子间发生共价交联 ；而碳二亚胺既可以使蛋白酶分子间发生交联，又能将
含有伯胺基的大分子修饰剂偶联到酶分子上。
关键词 : 蛋白酶 化学修饰 戊二醛 碳二亚胺 微生物谷氨酰胺转氨酶 羊毛
Chemical Modification of Protease Used for Shrink Resistance of Wool
Chen Renren Fan Xuerong Wang Qiang Yuan Jiugang Zhu Yiran
（The Key Laboratory of Science and Technology of Eco-Textile，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract: Glutaraldehyde, microbial transglutaminase （MTG） and water-soluble carbodiimide （EDC） were employed to modify the
protease used in anti-felting finishing of wool, with the purpose of increasing its molecular weight and restricting its action to the wool surface.
The molecular weight distribution and structural changes of the modified protease were characterized by size exclusion chromatography, SDS-
PAGE and fluorescence spectrum. The results showed that glutaraldehyde was not an efficient crosslinker for the protease, since no increase
in the molecular weight was achieved. When MTG was used for the modification of the protease, it could be hydrolyzed by the protease and lost
cross-linking function. EDC can be used to modify the protease. Moreover, polymers containing primary amine can be conjugated to the protease
when EDC existed.
Key words: Protease Chemical modification Glutaraldehyde Carbodiimide Microbial transglutaminase Wool
生物酶是一种高效、作用专一的生物催化剂，
使用条件非常温和，已在食品、医药、环保等多个
领域得到了应用。但是，天然酶自身还存在诸多缺
点，如耐热、酸、碱、有机溶剂的能力差，半衰期短，
易失活等，极大地限制了其在工业领域的广泛应
用［1,2］。而酶分子的修饰则有可能提高其稳定性，改
善酶学性质［3］。近年来，生物酶在纺织中的应用也
越来越受到重视。其中，蛋白酶在羊毛生物法防毡
缩整理中的应用研究也取得了较大进展。由于羊毛
纤维表面覆盖着致密的鳞片层，使得毛织物在洗涤
过程中，纤维间产生定向摩擦效应，发生严重的毡
缩现象，导致织物尺寸缩小，严重影响毛织物的服
用性能。生物酶防毡缩整理主要是利用酶分子对羊
毛纤维的水解作用，剥除鳞片层，从而达到防毡缩
目的。但是，可用于羊毛防毡缩整理的蛋白酶的分
子量相对较小，很容易通过鳞片间隙的细胞膜复合
物层扩散进入纤维主体，水解细胞间质，对纤维强
力造成严重损伤［4-6］。相关研究表明，通过化学修
饰使蛋白酶分子量增大到一定程度，则可将酶的作
用范围限制在纤维表面，降低对纤维主体的损伤［4］。
本研究从提高羊毛防毡缩用蛋白酶的分子量，
降低对羊毛纤维损伤的目的出发，采用戊二醛、
2012年第2期 183陈忍忍等 ：羊毛防毡缩用蛋白酶的化学修饰
MTG 和水溶性碳二亚胺 EDC 对蛋白酶进行修饰，并
从修饰酶分子量和结构变化等方面评价修饰效果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 蛋白酶（Savinase 16L，16 000 U/g），
Novozymes 公司提供 ；戊二醛（25%），国药集团化
学试剂有限公司产品 ；MTG（100 U/g）一鸣生物制
品有限公司产品 ；碳二亚胺（EDC，纯度≥ 98.5%），
上海晶纯实业有限公司产品 ；壳聚糖（脱乙酰度
≥ 90%，粘均分子量约 40 万），国药集团化学试剂
有限公司产品 ；Sephacryl S-200 凝胶填料，北京拜
尔迪公司提供 ；其他化学试剂均为分析纯。
1.1.2 主要设备 自动液相色谱分离层析仪 ：MF
99-3，层析柱（内径 1.6 cm，长 50 cm），上海沪西
分析仪器厂 ；蛋白质电泳仪 ：美国 BIO-RAD 公司 ；
荧光分光光度计 ：F-4600，日本 Hitachi 公司 ；电子
单纱强力机 ：YG020 型，常州市第二纺织机械厂。
1.2 方法
1.2.1 修饰方法 戊二醛交联 ：用 20 mmol/L 磷酸
盐缓冲液（pH7.5）配制 5%（V/V）浓度的蛋白酶溶液，
边搅拌边缓慢加入 0.2% 戊二醛引发交联反应。室温
磁力搅拌 30 min 后，置于 4℃冰箱，继续反应 4 h。
MTG 催 化 交 联 ：用 20 mmol/L 磷 酸 盐 缓 冲 液
（pH7.5）配制成 25 mg/mL MTG 酶溶液。加入蛋白
酶，使最终体系中酶浓度为 5%（V/V）。反应体系
于 37℃摇床上反应 2 h。
EDC 引发交联 ：将蛋白酶用 20 mmol/L 磷酸盐
缓冲液（pH6.0）稀释成 5%（V/V）浓度的溶液，加
入 40 mmol/L EDC 活化酶分子羧基，引发交联反应，
于室温搅拌反应 4 h。
1.2.2 酶活和蛋白质浓度测试 采用酪蛋白为底物，
测试蛋白酶在 37℃的活力。酶活测定采用紫外分光
光度法，将每分钟催化酪蛋白水解生成 1 μg 酪氨酸
的酶量定义为一个活力单位。
1.2.3 体 积 排 阻 色 谱 检 测 利 用 紫 外 检 测 仪 在
280 nm 检测蛋白酶的出峰时间。其中，EDC 修饰酶
采用 20 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.0）为洗脱液 ；
戊二醛和 MTG 修饰酶洗脱液为 20 mmol/L 磷酸盐缓
冲液（pH7.5）。上述洗脱液中均含 150 mmol/L 氯化钠。
1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 浓缩胶
浓度为 5%，分离胶浓度为 12%，电泳结束后，采
用 Coomassie R250 对凝胶染色。
1.2.5 荧光光谱 激发波长为 280 nm，狭缝宽度均
为 5 nm，测定蛋白酶在 250-500 nm 内的发射光谱。
1.2.6 蛋 白 酶 和 MTG 复 合 对 羊 毛 纱 线 的 处 理 工
艺 毛织物热水浸渍→双氧水氧化（H2O2 5 mL/L，
Na2SiO4 1.25 g/L，pH8.6，温度 50℃，时间 60 min，
浴比 1 25）→充分洗涤，室温晾干→蛋白酶 &MTG
处 理（ 蛋 白 酶 4 U/mL，MTG 0.2 U/mL，pH8 Tris-
HCl 缓冲液，温度 50℃，时间 60 min，浴比 1 25）
→ 85℃失活 15 min →充分水洗，室温晾干。
在相同试验条件下，分别对氧化毛织物进行单
独蛋白酶处理、单独 MTG 处理以及蛋白酶和 MTG
的两步法处理，作为两种复合酶处理效果的对照样。
1.2.7 纱线断裂强力测试 参照 GB/T 3916-1997。
2 结果
2.1 戊二醛交联
2.1.1 体积排阻色谱分析 双官能团试剂戊二醛可
以用于酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽
链部分之间的共价交联［7,8］。戊二醛不仅能与酶分子
中的氨基反应，还可以与羟基反应［7］。图 1 为戊二
醛交联前后蛋白酶的体积排阻色谱。
图 1 修饰酶和未修饰酶的体积排阻色谱
洗脱曲线（图 1）显示，未修饰蛋白酶（SAV）
的洗脱峰吸光值较高，且分子量分布较窄 ；加入
戊二醛修饰后，戊二醛修饰酶（GTA-SAV）反应
液的洗脱峰值大大降低，且分子量分布变宽。比
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期184
较出峰的时间发现，并无高分子量物质提前洗脱
出来。
2.1.2 紫外光谱分析 修饰酶和未修饰酶的紫外光
谱见图 2。从紫外光谱可以看出，戊二醛修饰酶在
紫外区的吸收特性没有发生明显变化，且没有对在
280 nm 有吸收峰的色氨酸和酪氨酸等造成显著影响。
表明戊二醛修饰未改变蛋白酶分子的结构。
而从体积排阻色谱分析可知，GTA-SAV 反应液
的洗脱峰在 280 nm 的吸光值变小，且分子量分布变
宽。这说明，戊二醛交联蛋白酶反应中，可能产生
了一些低分子量聚合物。
2.2 MTG催化交联
微生物转谷氨酰胺酶是一种催化酰基转移反应
的转移酶，可催化蛋白质分子内和分子间交联、蛋
白质与氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰
胺酰胺基的水解，从而改善各种蛋白质的功能性
质［10］。MTG 能催化酪蛋白、大豆蛋白、肌球蛋白、
谷蛋白等体外大多数食品蛋白质的交联反应［11］。
基于 MTG 的作用原理和应用现状，本研究尝试将
MTG 用于蛋白酶的交联。
2.2.1 体积排阻色谱分析 MTG 修饰蛋白酶（MTG-
SAV）溶液和未修饰酶的体积排阻色谱如图 4 所示。
与 SAV 相比，MTG 的分子量较大，提前洗脱出来 ；
MTG 修饰酶液的洗脱曲线中，MTG 的洗脱峰消失，
修饰酶的出峰时间没有提前，反而略有推迟。这说明，
MTG 修饰后没有高分子量的蛋白酶修饰物生成。
2.2.2 SDS-PAGE 分析 MTG、MTG 修饰酶和未修
饰酶的 SDS-PAGE 见图 5。由图 5 可知，MTG 的分
子量约为 39 kD，大于 SAV 分子量，故在体积排阻
色谱中较早被洗脱出来。MTG-SAV 反应液中，无高
分子量物质产生，并且 MTG 的条带消失，这与体积
排阻色谱分析得到的结论是一致的。产生这种现象
的原因很可能是 MTG 没有使蛋白酶之间发生交联反
应，反而被蛋白酶水解成小分子物质，造成 MTG-
SAV 的洗脱曲线出峰时间比 SAV 推迟。
2.2.3 MTG 和蛋白酶的复合作用 MTG 催化蛋白质
交联的一个必须条件是蛋白质中要有足够的可以相
互作用的赖氨酸和谷氨酰胺残基［11］。羊毛纤维中含
有一定量的赖氨酸和谷氨酰胺，许多研究表明 MTG
可以催化羊毛蛋白中的赖氨酸和谷氨酰胺发生共价
交联，在纤维内部形成网络，增加纤维的强力，从
而在一定程度上修复羊毛加工过程中氧化剂和蛋白
酶对纤维的损伤［12,13］。将 MTG 和蛋白酶复合一浴
法处理羊毛纱线，若 MTG 没有起到修复强力的作用，
则将进一步证实 MTG 修饰蛋白酶试验中，MTG 会
被蛋白酶水解，无法发挥催化交联作用。图 6 为不
同处理条件下，羊毛纱线强力的变化。
从图 6 中可以看出，双氧水氧化处理后，纱
线强力比未氧化原样低。加入 MTG 处理后，纱线
强力得到了一定程度的修复，但仍然低于原样 ；蛋
白酶处理后，纱线强力进一步降低，比原样下降
图 2 修饰酶和未修饰酶的紫外光谱
2.1.3 SDS-PAGE 谱图分析 为了进一步验证戊二醛
能否使蛋白酶分子之间发生交联，进行 SDS-PAGE
分析。结果 （图 3）显示，SAV 呈现 4 条比较清晰的
谱带，分子量约为 14-27 kD。而其体积排阻色谱只
呈现一个很窄的峰，说明这 4 条谱带可能是由 SOD
所带的电荷差异引起的［9］；修饰酶 GTA-SAV 具有
与 SAV 相同的条带分布，并无新的高分子条带显现。
图 3 修饰酶和未修饰酶的 SDS-PAGE 图
2012年第2期 185陈忍忍等 ：羊毛防毡缩用蛋白酶的化学修饰
图 4 修饰酶和未修饰酶的体积排阻色谱
图 5 修饰酶和未修饰酶的 SDS-PAGE 图
约 8.2% ；对 蛋 白 酶 处 理 样， 继 续 进 行 MTG 处 理
（SAV+MTG）后，纱线强力提高，与文献报道的结
果一致［12,13］；MTG 和蛋白酶复合（SAV&MTG）一
浴法处理羊毛纱线的强力比蛋白酶处理样还低，只
有原样的 83.8%，说明 MTG 没有对纱线起到修复作
用。Hossain 等［14］ 将 蛋 白 酶 Esperase 与 MTG 同 浴
处理羊毛时，也发现相同的现象。这个试验结果再
次证明，MTG 会被蛋白酶水解，无法对酶分子进行
修饰。
2.3 EDC活化交联
EDC 是可溶于水的碳二亚胺，具有活化羧基的
作用，可以引发羧基和伯胺的缩合反应，已被广泛
应用于酶分子修饰［7,15］。
2.3.1 体积排阻色谱分析 未修饰蛋白酶和 EDC 修
饰蛋白酶（EDC-SAV）反应液的洗脱曲线如图 7 所示。
比较 EDC-SAV 反应液与 SAV 的洗脱曲线，可
明显看出，EDC 修饰后，洗脱曲线出现两个峰。经
图 6 MTG 和蛋白酶复合作用对羊毛纱线强力的影响
检测，EDC-SAV 反应液的两个峰都有酶活，且第一
个峰的出峰时间比 SAV 提前约 20 min。这说明在
EDC 的作用下，反应液中出现了新的大分子量物质，
很可能蛋白酶分子自身发生了交联反应。并且试验
中发现，随反应时间的延长，EDC-SAV 反应液洗脱
曲线中第一个峰的峰值逐渐变大，而第二个峰值不
断减小。
图 7 修饰酶和未修饰酶的体积排阻色谱
在 EDC 修饰蛋白酶反应过程中进行蛋白酶活力
测试，发现随反应时间的延长，酶活未发生明显变化，
室温反应 4 h 后，酶活仍为反应初始的 97.5%，表明
交联反应未对酶的活性中心造成显著影响。
2.3.2 SDS-PAGE 分析 取 EDC 修饰酶液进行 SDS-
PAGE 测试，电泳结果（图 8）显示，在 EDC 修饰后，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期186
并无高分子量条带出现，凝胶色谱中看到的高分子
量物质并未在电泳结果中表现出来。但是对比 SAV
可以发现，EDC-SAV 最上面一个条带颜色变深（箭
头）。这可能是低分子量肽链交联分子量增大的结果。
2.3.3 荧光光谱分析 在天然蛋白质分子结构中，
酪 氨 酸（Tyr）、 色 氨 酸（Trp） 和 苯 丙 氨 酸（Phe）
这 3 种氨基酸会发射荧光。一般情况下，这些基团
分布在蛋白质内核的疏水区［16］。
图 8 修饰酶和未修饰酶的 SDS-PAGE 图
图 9 修饰酶和未修饰酶的荧光光谱
2.3.4 EDC 引发蛋白酶与大分子修饰剂交联 EDC
具有活化羧基的作用，可以活化酶分子中的羧基，
再与含有伯胺基的大分子物质缩合生成酰胺键。
Villalonga 等［18,19］利用 EDC 将胰蛋白酶、苯丙氨酸
脱氢酶与胺化的右旋糖酐共价交联，修饰后酶的稳
定性等性能都得到改善。
壳聚糖是基本单元带有氨基的葡萄糖，分子链
上分布着大量羟基和氨基，性质活泼，是比较合适
的大分子修饰剂［20,21］。本研究利用 EDC 活化蛋白酶
分子的羧基，使之与壳聚糖分子中的伯胺基之间发
生缩合反应，形成壳聚糖 - 蛋白酶偶联物，从而达
到增大蛋白酶分子量的目的。
试验中采用体积排阻色谱、荧光光谱、圆二
色性光谱和热稳定性分析等对修饰产物进行了表
征。结果表明，壳聚糖修饰后，蛋白酶的分子量增
大 ；酶分子的二级结构发生了较大变化，其中 α-螺
旋含量从 34.8% 提高到 80.6%，而无规则卷曲含量
下降到 15.3% ；壳聚糖 - 蛋白酶偶联物在 80℃还能
保持最适温度时 64.9% 的酶活，而未修饰酶只残留
31.8% 的活力，表明修饰酶的适用温度范围向高温
拓展 ；修饰酶在 55℃、20 mmol/L 醋酸—醋酸钠缓
冲液（pH5.0）中处理 3 h 后，仍能保持 90% 的酶活，
热稳定性提高。综上，EDC 修饰蛋白酶是可行的方法。
3 讨论
酶蛋白侧链上的功能基主要有氨基、羧基、巯
基等，修饰以上每一种功能基都有很多修饰剂可供
选择。本研究选用戊二醛、MTG 以及水溶性碳二亚
胺 EDC 对羊毛防毡缩用蛋白酶 SAV 进行修饰，以
期增大蛋白酶的分子量。
研究结果表明，戊二醛是蛋白质交联的常用交
联剂。但是，凝胶层析试验和电泳试验均表明，戊
二醛修饰后，没有生成高分子量蛋白酶聚体。以上
现象均说明戊二醛并不是修饰蛋白酶的有效试剂，
这可能是由于酶分子中自由赖氨酸残基的数量较少
造成的。研究表明，双功能试剂戊二醛能否成功交
联蛋白质取决于分子中自由赖氨酸残基的数量［8］。
Silva 等在戊二醛修饰蛋白质的研究中发现，戊二
醛可使酪蛋白和牛血清蛋白交联产生高分子量的多
聚体，但并不是修饰蛋白酶 Esperase 的有效交联
如图 9 所示，在 280 nm 的激发波长下，未修饰
酶的最大发射波长为 340.4 nm；EDC 修饰后，最大发
射波长未发生变化，荧光强度稍有降低。在 280 nm
处激发产生的荧光，主要是色氨酸残基的荧光发
射［17］。荧光强度降低，可能是由于 EDC 修饰后，
酶分子中色氨酸残基被包埋的更深所致。
2012年第2期 187陈忍忍等 ：羊毛防毡缩用蛋白酶的化学修饰
剂。因为相较于酪蛋白和牛血清蛋白分子，Esperase
中含有非常少的自由赖氨酸残基。本试验中采用
的同样来自于 Novozymes 公司的枯草杆菌蛋白酶
Savinase，很可能也是由于分子中自由赖氨酸残基的
数量较少，造成戊二醛无法有效修饰蛋白酶。
从体积排阻色谱、SDS-PAGE 分析以及蛋白酶
与 MTG 复合应用的结果可知，与蛋白酶同时存在
时，MTG 会被蛋白酶水解，无法发挥催化交联作用。
EDC 可以引发蛋白酶分子之间发生交联，修饰后蛋
白酶分子量变大，且 EDC 修饰不会影响活力中心。
此外，本课题的研究也证实，在含有伯氨基大分子
壳聚糖存在的情况下，EDC 也可引发大分子与酶分
子之间偶联，达到增大蛋白酶分子量的目的。
4 结论
本研究表明，戊二醛无法对蛋白酶进行有效修
饰 ；MTG 会被蛋白酶水解失去催化交联作用，无法
实现修饰蛋白酶的目的 ；EDC 可使蛋白酶分子间发
生交联，并且不会影响活力中心 ；在含有伯胺基修
饰剂存在的情况下，EDC 能引发修饰剂与蛋白酶之
间的偶联反应。
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（责任编辑 马鑫）