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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(12):174-179
红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）是近海底层肉
食性鱼类，其生殖腺和肝脏等内脏中产生的河豚毒
具有潜在的医药开发价值，在临床上具有广阔的前
景［1］。红鳍东方鲀是一种重要的经济鱼类，但水
环境中存在的大量细菌和病毒使鱼类的皮肤和黏膜
不断受到侵袭，特别是弧菌、爱德华氏菌等的感染
给红鳍东方鲀的大规模养殖造成严重损失。干扰素
（Interferon，IFN）在 1957 年首次被 Isaacs 提出，干
扰素系统是脊椎动物抵抗病原体侵害的天然防御系
统之一，在先天性免疫应答中能够有效广泛地抑制
收稿日期 ：2015-04-21
基金项目 ：国家海洋公益性行业科研专项经费项目（201405003-2），大连市科技计划项目（2014B11NC091）
作者简介 ：马普，女，硕士研究生，研究方向 ：水产动物基因工程 ；E-mail ：mapu88824@sina.com
通讯作者 ：王秀利，男，博士，教授，研究方向 ：水产动物基因工程 ；E-mail ：xlwang@dlou.edu.cn
红鳍东方鲀干扰素 γ 基因的原核表达
马普1  孙赛红1  王玉芳1  李慧1  刘海映2  姜志强1  仇雪梅1  刘洋1   
张涛3  王秀利1
（1. 大连海洋大学水产与生命学院，大连 116023 ；2. 大连海洋大学海洋科技与环境学院，大连 116023 ；
3. 大连天正实业有限公司，大连 116011）
摘 要 ： 旨在探究一种简单高效的获取重组红鳍东方鲀 IFNγ蛋白的方法。提取红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）肾脏组织的
总 RNA，并以其为模板进行 RT-PCR 扩增干扰素 γ（IFNγ）基因序列。将 IFNγ成熟肽序列与表达载体 pET-32a（+）相连，成功构
建了重组表达载体 PET-32a-IFNγ。将其转化入 E. coli BL21（DE3）感受态细胞后获得了重组表达 IFNγ的基因工程菌。经 IPTG 诱导，
pET-32a-IFNγ在 BL21 中得到了表达。通过对表达产物的纯化和 Western blotting 检测，结果显示红鳍东方鲀 IFNγ基因在大肠杆菌
中的表达准确，且目的蛋白表达量较高。
关键词 ： 红鳍东方鲀 ；干扰素 γ ；原核表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.025
A Prokaryotic Expression of Recombinant IFNγ from
Takifugu rubripes
Ma Pu1 Sun Saihong1 Wang Yufang1 Li Hui1 Liu Haiying2 Jiang Zhiqiang1 Qiu Xuemei1 Liu Yang1
Zhang Tao3 Wang Xiuli1
（1. College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023 ；2. College of Marine Science and Environment，Dalian
Ocean University，Dalian 116023 ；3. Dalian Tianzheng Industrial Corporation Limited，Dalian 116011）
Abstract: The aim is to provide a simple and efficient method to acquire recombinant fusion proteins of IFNγ of T. rubripes. In this study,
total RNA was extracted from the kidney tissue of T. rubripes, and used as a template to amplify gene sequences of interferon γ（IFNγ）by
RT-PCR. The recombinant DNA pET-32a-IFNγ was constructed by ligating the mature peptide sequences of IFNγ and prokaryotic expression
vector pET-32a（+）. The genetic engineering bacteria of recombinant expressed IFNγ were obtained by transforming pET-32a-IFNγ into the
competent cells of Escherichia coli BL21（DE3）. The fusion proteins were obtained under the induction of IPTG. By purifying the express
products and Western blotting test, the results showed the high-efficiency expression of recombinant pET-32a-IFNγ in E. coli and the accurate
target protein.
Key words: Takifugu rubripes ；interferon γ ；prokaryotic expression
2015,31(12) 175马普等：红鳍东方鲀干扰素 γ基因的原核表达
感染的传播［2］。IFNs 是一个蛋白家族，由 3 种主
要类型组成 ：Ⅰ型干扰素（IFN-α、-β 和 -ω），Ⅱ型
干扰素（IFN-γ）和Ⅲ型干扰素（IFN-λ1、IFN-λ2 和
IFN-λ3， 又 分 别 被 称 为 IL-29、IL-28A 和 IL-28B），
IFNs 对很多生物反应有影响，包括对病原体的防御
机制、对先天性和适应性免疫应答中效应细胞的管
理和抗肿瘤效应［3］。IFNs 通过细胞表面受体作用使
细胞产生抗病毒蛋白，抑制病毒在宿主细胞中的复
制。另外，IFNs 还可增强自然杀伤细胞（NK 细胞）、
巨噬细胞和 T 淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节
作用，增强抗病毒能力，对细胞生长和细胞分化也
有很重要的调节活性［4-6］。
IFNγ 主要由 T 细胞 和 NK 细 胞 分 泌， 对 抵 抗
病毒感染和胞内细菌感染至关重要，能够直接增强
肿瘤细胞的免疫原性，激发对转化细胞的免疫应
答［7-9］。IFNγ 在免疫系统中的重要性除了其直接抑
制病毒复制的能力外，更重要的是源于它对免疫刺
激和免疫调节的影响，而且还能够直接或间接地上
调主要组织相容性复合体（MHC Ⅰ和 MHC Ⅱ）的
抗原提呈作用［10］。IFNγ 同时还是巨噬细胞的激活
剂，能够增强巨噬细胞杀死细菌、原生动物和病
毒性病原体的能力［11］。哺乳动物的 IFNγ 能够保
护宿主抵抗胞内病原体，如利什曼原虫、李斯特
单核细胞增生菌和结核分枝杆菌等的侵染，这使
得 IFNγ 在调节巨噬细胞介导的抗菌反应中的作用
更为明显［12］。IFNγ 基因已经在许多鱼类中被克隆
出 来。 斑 点 叉 尾鮰（Channel catfish） 能 够 产 生 两
种 IFNγ mRNAs（IFN-γ1 和 IFN-γ2），这两个 mRNA
在不同的组织和细胞类型中有不同的表达形式，牙
鲆（Paralichthys olivaceus）同样有两种 IFNγ 转录本
（IFN-γ1 和 IFN-γ2）， 这 两 个 转 录 本 非 常 相 似， 仅
有 3 个核苷酸不同［13］。红鳍东方鲀的 IFNγ 基因在
2004 年首次被 Zou ［14］克隆出来。
在国内，应用于禽、猪、牛、犬等的基因工程
干扰素抗病毒制剂已得到广泛发展［15］。徐正中等［16］
通过原核表达得到的重组牛 IFNγ 蛋白，有较高的抵
抗病毒的能力。代丽等［17］克隆了鸡 IFNγ 基因，并
通过原核表达得到该重组蛋白，利用鸡成纤维细胞—
新城疫（CEF-NDV）系统检测该重组蛋白的抗病毒
活性发现，经过稀释后的重组蛋白能有效抵抗病毒
的攻击。崔然［18］构建了猪 IFNγ基因的原核表达载体，
并纯化出该重组蛋白，进一步研究发现该蛋白具有
抵抗猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive
and respiratory syndromt virus，PRRSV）和水泡性口
炎 病 毒（Vesicular stomatitis virtes，VSV） 的 能 力。
张海玲等［19］构建了北极狐 IFNγ 的原核表达载体，
并以包涵体的形式成功表达了该目的蛋白的成熟肽。
活性测定表明，在非洲绿猴肾细胞（Vero）和犬肾
细胞（MDCK）细胞中复性后的重组北极狐 IFNγ 蛋
白能够抑制 VSV 病毒的繁殖。然而，有关鱼类基因
工程干扰素制剂的研究并不是很多，本研究通过基
因重组技术将红鳍东方鲀 IFNγ 基因连接到表达载体
pET-32a（+），并转化到大肠杆菌中表达，得到重组
红鳍东方鲀 IFNγ 蛋白，旨在为进一步深入研究重组
红鳍东方鲀 IFNγ 蛋白活性及其在红鳍东方鲀健康养
殖上的应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
实验用健康红鳍东方鲀采自大连天正实业有限
公司。采集红鳍东方鲀肾脏组织并迅速冻存于液氮
中，存于 -80℃冰箱备用。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取 取 -80℃冰箱中冻存的红鳍
东方鲀肾脏组织约 0.1 g，按照 RNAiso Plus 试剂盒
（TaKaRa 公司）的方法提取总 RNA，经 1% 的琼脂
糖凝胶电泳检测总 RNA 的质量，-80℃保存备用。
1.2.2 红 鳍 东 方鲀干 扰 素 γ 基 因 的 扩 增 根 据
已 发 表 在 GenBank 上 的 红 鳍 东 方鲀 IFNγ 基 因
（AJ616216.2） 序 列， 利 用 生 物 信 息 学 软 件 Primer
Premier5.0 设计引物为 ：IFN-F ：5-CATGCCATGGG
CTCCTACATCCCAGTAGAAATG-3（ 下 划 线 部 分 为
Nco Ⅰ酶切位点）；IFN-R ：5-CCGCTCGAGATGACC
TCGAATCGACATCT-3（下划线部分为 Xho Ⅰ酶切
位点）。
将实验提取的 RNA 利用 PrimeScript RT reagent
kit Perfect Real Time 反转录试剂盒进行反转录得到
cDNA。以该 cDNA 为模板用引物 IFN-F/IFN-R 进行
PCR 扩增 IFNγ 基因。将扩增片段与 pMD19-T 载体
相连并转化入大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，涂平板
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（含 100 μg/mL 氨苄青霉素）筛选、挑取单克隆菌落，
送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.2.3 IFNγ 蛋白的生物信息学分析 选取红鳍东方
鲀（T. rubripes，CAE82301.2）、斜带石斑鱼（Epine-
phelus coioides，AFM31242.1）、 绿 河 鲀（Tetraodon
nigroviridis，AHZ62714.1）、大西洋大比目鱼（Hipp-
oglossus hippoglossus，ADP55200.1），大西洋鲑（Sa-
lmo salar，NP_001165275.1）、 虹 鳟（Oncorhynchus
mykiss，NP_001118092.1）、大西洋鳕鱼（Gadus mo-
rhua，ACN41957.1）、原鸽（Columba livia，EMC77-
410.1）， 美 洲 旱 獭（Marmota monax，AAP80574.1）
和马（Equus caballus，ABS28998.1）的 IFNγ 氨基酸
序列，利用 ClustalW 和 MEGA5.0 软件进行多序列比
对并构建系统进化树。
1.2.4 原核表达载体 pET-32a-IFNγ 的构建 以重组
质粒 pMD19-T-IFNγ 为模板进行 PCR，扩增条件为 ：
94℃预变性 5 min ；94℃变性 30 s，58℃退火 30 s，
72℃延伸 30 s，30 个循环 ；72℃延伸 10 min。产物
经 1% 琼脂糖凝胶检测后进行胶回收，将 PCR 产物
和表达载体 pET-32a（+）（本实验室保存）分别进
行 Nco Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切后用 T4 DNA Ligase 连接，
转化至 E.coli DH5α 感受态细胞，挑取单菌落扩大培
养后提取质粒，质粒经 PCR 及双酶切鉴定为阳性后
送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序
正确的阳性重组质粒命名为 pET-32a-IFNγ。
1.2.5 原核表达载体的诱导表达 测序鉴定正确的
重组质粒 pET-32a-IFNγ 转化至 BL21（DE3）感受态
细胞（本实验室保存），37℃培养过夜，按 1∶100
转接至 100 mL LB 培养基（含 Amp）震荡培养。当
菌液 OD600=0.6 左右时以 1.0 mmol/L IPTG 37℃诱导
4 h，取 1 mL 菌液离心弃上清，沉淀用 100 μL PBS
重悬，加入 25 μL 上样缓冲液煮沸 10 min 后 SDS-
PAGE 电泳，鉴定目的蛋白的表达情况。
1.2.6 目的融合蛋白的分离纯化及 Western blotting
鉴定 将 100 mL 经 IPTG 诱导后的菌液 6 000×g 离
心 10 min，弃上清，用 20 mL PBS 重悬菌体 ；然后
对其超声波破碎（工作 9 s 间歇 9 s），12 000×g 离
心 20 min ；将上清和沉淀分别过 ProteinIsoTM Ni-NTA
Resin（全式金生物技术有限公司）纯化目的融合蛋
白 ；将收集的洗脱液转入透析袋内，在 0.5 mol/L、
pH 为 8.0 的 Tris-HCl 缓冲液中透析过夜 ；将透析产
物进行 SDS-PAGE 凝胶电泳检测。
将纯化的融合蛋白经 SDS-PAGE，100 mA、1.5
h 转印至 NC 膜上。然后将 NC 膜置于封闭液中浸泡
30 min，加入 His-tag 抗体（天根生化科技有限公司）
孵育 1 h，加入羊抗鼠 IgG-HRP（天根生化科技有限
公司）孵育 30 min。以上各步骤之间用 PBS 缓冲液
清洗 3 次，每次 10 min。将 NC 膜放入避光处加显色
液，10 min 之后在凝胶成像系统观察结果并拍照。
2 结果
2.1 RNA提取结果
利用 RNAiso plus 提取红鳍东方鲀肾脏总 RNA，
1% 琼脂糖凝胶检测，在凝胶成像仪下观察，检测结
果（图 1）显示，28S 和 18S 条带清晰，可用于后续
反转录实验。
2000
28S
18S
bp
M 1
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker DL2000 ；1 ：总 RNA
图 1 红鳍东方鲀总 RNA 琼脂糖凝胶电泳结果
2.2 IFNγ基因的扩增结果
将 提 取 的 总 RNA 反 转 录 后 用 于 IFNγ 基 因 成
熟肽序列的 PCR 扩增，结果（图 2）表明，在约
522 bp 处出现特异性条带，与预期大小一致，因此
初步判断该基因的成熟肽序列已被扩增出来。
2.3 IFNγ氨基酸序列比对及进化分析
经多序列比对发现，T. rubripes IFNγ 的氨基酸
序列与 T. nigroviridis 一致性为 62%，同源性较高，
与 E. coioides 和 H. hippoglossus 的相似性分别为 47%
和 43%，同源性较低。系统进化树分析（图 3）表
明，T. rubripes 与 T. nigroviridis 聚为一支，亲缘关系
最近。
2015,31(12) 177马普等：红鳍东方鲀干扰素 γ基因的原核表达
2000
bp
M 1
1000
750
500
250
100
M ：DL2000 DNA Marker ；1 ：IFNγ 基因 PCR 产物
图 2 IFNγ 基因的 PCR 扩增结果བྷ㾯⌻བྷ∄ⴞ劬H. hippoglossusᯌᑖ⸣ᯁ劬E. coioidesབྷ㾯⌻包劬G. morhua㓒勽ьᯩ劰T. rubripes㔯⋣劰T. nigroviridisབྷ㾯⌻勁S. salar㲩匏O. mykiss৏呭C. livia㖾⍢ᰡ⦝M. monax傜E. caballus
0.2
100
98
100
100
87
68
93
图 3 IFNγ 的系统进化树分析
2.4 原核表达载体pET-32a-IFNγ的鉴定
图 4 显示，重组表达载体 pET-32a-IFNγ 经双酶
切后在 522 bp 处出现单一条带，说明 IFNγ 基因已
连入 pET-32a（+）载体。将经过双酶切验证的重组
质粒测序，结果表明已成功将 IFNγ 基因连接到原核
表达载体 pET-32a（+），重组表达载体构建成功。
2.5 原核表达载体在BL21（DE3）中的诱导表达
将构建好的重组表达载体 pET-32a-IFNγ 导入
表达宿主菌 BL21（DE3），经 IPTG 诱导表达后进行
SDS-PAGE 分析。结果（图 5）表明，与 pET-32a 空载
相比重组质粒 pET-32a-IFNγ 在 BL21（DE3）中表达
的蛋白图谱中明显多出一条特异的诱导表达条带，
大小在 37.8 kD 左右，与预期大小一致，故初步判
断已诱导表达出目的蛋白。进一步优化表达条件发
现 pET-32a-IFNγ 在 IPTG 浓度为 1 mmol/L，诱导 6 h，
诱导温度为 37℃时表达量最多（图 6），而诱导时间
增加到 8 h 时相比 6 h 的表达量并无增加。
2.6 融合蛋白的纯化和Western blotting 分析结果
用 Ni 柱分别对 IFNγ 融合蛋白进行破碎后沉淀
200
kD M 1 2 3
116
97.2
66.4
44.3
29
20.1
M ：蛋白质 Marker ；1 ：pET-32a（+）空载 ；2 ：pET-32a-IFNγ 诱导前 ；
3 ：pET-32a-IFNγ 诱导后
图 5 重组表达载体 pET-32a-IFNγ 的表达分析
2000
bp
M 1 2
1000
750
500
250
100
M ：DL2000 DNA Marker ；1 ：pET-32a-IFNγ 质 粒 ；2 ：pET-32a-IFNγ 质 粒 经
Nco Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切产物
图 4 pET-32a-IFNγ 质粒的双酶切鉴定结果
和上清的纯化发现，在破碎后的沉淀中纯化得到以
包涵体形式存在的 IFNγ 融合蛋白。Western blotting
检测（图 7）表明，在 37.8 kD 处出现一条单一条带，
带有 His 标签的重组蛋白得到表达，进一步说明纯
化得到的蛋白即为重组红鳍东方鲀 IFNγ 蛋白。
3 讨论
近年来，红鳍东方鲀的病害不断增多，对其病
害的防治除了提供良好的养殖环境和进行药物治疗
等措施外，还需提高鱼体自身的免疫能力。已有的
研究表明，干扰素作为一种细胞因子在增强机体免
疫力方面具有重要的作用。在哺乳动物和鸟类中，
重组的 IFN-α/β已被广泛用于肿瘤的治疗和病毒性疾
病的研究，一些鱼类重组干扰素的活性已通过 ZF4
细胞进行了检测，该细胞来源于斑马鱼的胚胎细
胞［20］。实验证明加入了重组 IFN 的 ZF4 细胞能够增
强对黑鱼弹状病毒（Snakehead rhabdovirus，SHRV）
的抵抗能力，重组的鲑鱼和鲶鱼 IFNs 能够保护 TO
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12178
细胞免受传染性胰脏坏死病毒（Infectious pancreatic
necrosis virus，IPNV）的侵染和 CCO 细胞免受斑点
叉尾鮰疱疹病毒（Channel catfish herpesvirus，CCV）
的侵染［21，22］。重组的牙鲆 IFNγ 能够增强牙鲆抵抗
爱德华氏菌的能力［23］。
本研究通过克隆红鳍东方鲀干扰素 γ 基因，构
建重组表达载体，在大肠杆菌细胞中得到了融合表
达的 IFNγ。但在对重组载体进行诱导表达时，发现
未加 IPTG 诱导的菌体和含有 pET-32a 空载体的菌体
均出现少量与目的蛋白大小相似的蛋白条带，这可
能是由于菌体中含有与目的蛋白大小相似的其他蛋
白造成的。另外，pET 表达系统中存在目的蛋白的
本底表达也会导致未加诱导剂的情况下同样有目的
蛋白表达的情况。为了进一步证明目的蛋白得到正
确表达，本研究进行了 Western blotting 检测。因为
本实验选用的是 pET-32a 构建表达载体，所表达的
目的蛋白是带有 His 标签的融合蛋白，因此采用 His
标签抗体对诱导表达的蛋白进行了 Western blotting
检测，表明该蛋白能够与抗 His 标签的单克隆抗体
发生特异反应，His 标签得到正确表达，同时也表
明载体按照正确的翻译框架翻译并表达出目的蛋白。
因此，本研究通过诱导表达并纯化得到的蛋白不仅
大小与预期一致而且带有 His 标签，而这种情况只
有目的蛋白具有，可以说明诱导表达的蛋白即为重
组红鳍东方鲀 IFNγ 蛋白。在原核表达中除了目的基
因本身序列对表达量有影响之外，诱导表达的条件
对目的基因表达量同样具有重要影响。在本研究中
通过调整诱导表达时的时间、温度和诱导剂的浓度，
对重组载体的最佳表达条件进行了探索，最终确定
了重组红鳍东方鲀 IFNγ 蛋白在 IPTG 为 1 mmol/L，
37℃条件下诱导 6 h 时达到最大表达量，为今后重
组红鳍东方鲀 IFNγ 的产业化生产奠定基础。
4 结论
本 研 究 克 隆 并 获 得 了 红 鳍 东 方鲀干 扰 素 γ
（IFNγ）成熟肽的基因序列，构建了重组表达载体
pET-32a-IFNγ，经转化和诱导，重组体在大肠杆菌 E.
coli BL21（DE3）细胞中得以表达。利用 Ni 柱分离
和纯化得到的融合蛋白经 Western blotting 分析，证
明为重组的红鳍东方鲀 IFNγ。
参 考 文 献
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与渔业 , 2006（4）：19.
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200
kD M
A 1 2 3 4 5
116
97.2
66.4
44.3
20.1
14.3
6.5
29.0
B
200
kD M 1 2 3 4
116
97.2
66.4
44.3
20.1
14.3
6.5
29.0
C
200
kD
M 1 2 3 4
116
97.2
66.4
44.3
20.1
14.3
29.0
A ：1 ：pET32a 空 载 ；M ： 蛋 白 质 Marker ；2 ：0.2 mmol/L IPTG 诱 导 ；3 ：0.5 mmol/L IPTG 诱 导 ；4 ：1 mmol/L IPTG 诱 导 ；5 ：2 mmol/L IPTG 诱 导。
B ：M ：蛋白质 Marker ；1 ：诱导 2h 后 ；2 ：诱导 4 h 后 ；3 ：诱导 6 h 后 ；4 ：诱导 8 h 后。C ：M ：蛋白质 Marker ；1 ：37℃ ；2 ：35℃ ；3 ：30℃ ；4 ：27℃
图 6 不同条件下 pET-32a-IFNγ 在 BL21（DE3）细胞中的表达情况
kD
M1 2
116
97.2
66.4
44.3
20.1
14.3
29.0
1 ：纯化后的重组 IFNγ 蛋白 ；2 ：Western blotting 检测结果 ；
M ：蛋白质 Marker
图 7 纯化的 IFNγ 融合蛋白及 Western blotting 检测结果
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（责任编辑 马鑫）