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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):155-160
收稿日期：2015-08-24
基金项目：大连市科技计划项目（2014B11NC091），大连海洋大学科研项目（2012HYDX07）
作者简介：郝薇薇，女，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学；E-mail ：276700693@qq.com
通讯作者：仇雪梅，女，教授，研究方向：分子遗传学；E-mail ：xmqiu@dlou.edu.cn
红鳍东方鲀转录因子 GATA4 基因的表达
郝薇薇  高长富  仇雪梅  姜志强  王秀利 
（大连海洋大学水产与生命学院，大连  116023）
摘 要 ： 利用荧光实时定量 PCR（qRT-PCR）技术对红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）成鱼的肾脏、肌肉、脑、脾脏、肝脏、
精巢和卵巢等组织进行了 GATA4 基因的表达分析，并对幼鱼不同发育时间的个体水平上的 GATA4 基因的表达进行分析。结果显示，
红鳍东方鲀成鱼的肌肉、脾脏、肾脏和脑等 4 个组织中的 GATA4 的表达量差异不显著，精巢、卵巢和肝脏的 GATA4 的表达量显著
高于其他组织（P<0.05），GATA4 在精巢、肝脏中的表达量显著高于卵巢中（P<0.05）。在雄性幼鱼 5 个发育时期中（23、30、40、
60 和 80 日龄），GATA4 的表达量从 23 日龄到 30 日龄逐渐升高，30 日龄最高且明显高于同时期雌鱼 GATA4 的表达量（P<0.01），
随后到 40 日龄之间表达量逐渐降低，从 60 日龄到 80 日龄又有上升的趋势。在雌性幼鱼 5 个发育时期中，GATA4 表达量从 23 日
龄到 40 日龄逐渐升高，40 日龄最高且明显高于同时期雄鱼 GATA4 的表达量（P<0.01），到 60 日龄期间表达量降低，从 80 日龄后
又有上升趋势。各时期雌雄幼鱼，除 40 日龄外，其他各个时期在雄性中 GATA4 的表达量均高于在雌性中的表达量。
关键词 ： 红鳍东方鲀；实时定量 PCR ；转录因子 GATA4 ；基因表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.022
The Expression of Transcription Factor GATA4 Gene in Takifugu rubripes
HAO Wei-wei  GAO Chang-fu  QIU Xue-mei  JIANG Zhi-qiang  WANG Xiu-li
（College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023）
Abstract:  In  this study，GATA4 expression were analyzed  in kidney，muscle，brain，spleen，liver，testis and ovary of mature 
Takifugu rubripes，and were analyzed at  individual  level during different  times  in young T. rubripes by  flurescence quantitative Real-time 
Polymerase Chain Reaction（qRT-PCR）. The results showed that no statistically significant difference was observed of expression level among 
muscle，spleen，kidney and brain. There was the significantly higher expressionof GATA4 in testis ，liver and ovary，than that in other organs
（P<0.05）. The GATA4 expression level of testis and liver were significantly higher（P<0.05），than that in ovary. During the different periods
（23，30，40，60，80 days of age（d）） of T. rubripes，the GATA4 expression  level  in males  increased gradually  from 23 d  to 30 d and 
subsequently decreased at 40 d，and the 30 d expression level of GATA4 was higher than that in 30 d female individuals significantly（P<0.01）. 
While from 60 d to 80 d，the GATA4 expression level went steadily up. In females，as the same as the expression tend in males，the GATA4 
expression level increased gradually from 23 d to 40 d and subsequently decreased at 60 d，and the 40 d GATA4 gene expressed higher than that 
in the same time male individuals significantly（P<0.01）. Nevertheless from 80 d，the GATA4 expression level stared to rise. Apart from 40 d 
individuals，the GATA4 expression level were higher in males than in female in every period.
Key words:  Takifugu rubripes ；quantitative Real-time PCR ；transcription factor GATA4 ；gene expression 
红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）隶属于鲀形目
（Telraodontiformes）、 鲀科（Tetradontidae）、东方鲀
属（Takifugu），是暖水性海洋底栖鱼类，其规格较
大、肉质较紧、营养丰富、味道鲜美、经济价值高，
为我国北方地区的优良海水养殖鱼类之一［1］。红鳍
东方鲀作为鱼类中的模式生物，其基因组草图已经
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6156
完成，为后续深入研究相关基因及其功能提供了充
分的参考资料。
GATA 因子是一类具有保守锌指结构域的转录
因子，在脊椎动物生长发育过程中具有多种调控
功能。GATA 家族成员具有 2 个锌指结构 C-X2-C-
X17-C-X2-C（C 为半胱氨酸，X 为可变氨基酸，数
值为氨基酸个数），并分别命名为氨基端（N）锌指
和羧基端（C）锌指［2］。GATA 因子能结合位于靶
基因启动子和增强子部位上的一段共同的核苷酸序
列［T/A（GATA）A/G］，因而这类转录因子被命名
为 GATA 转录因子。根据 GATA 因子的基因结构和
功能，哺乳动物 GATA 家族的 6 个成员可以分为两
个亚家族，GATA1/2/3 亚家族包括 GATA1、2、3，
主要在造血肝细胞中表达；GATA4/5/6 亚家族包括
GATA4、5、6，主要在心脏、肠上皮细胞和性腺中
表达［3-6］。其中 GATA4 在调节胚胎形态发育和细胞
分化过程中具有重要作用。一些研究表明 GATA4 参
与生物体生长发育的多个过程，如个体的存活，细
胞组织的分化和心肌细胞前体的迁移［7］。在小鼠胚
胎早期敲除 GATA4 基因，由于心血管不能形成，导
致小鼠早期死亡［8］。小鼠早期雌雄性腺发育过程中，
均在未分化的生殖脊中发现 GATA4 高表达，而在卵
巢分化结束后，GATA4 的表达迅速下降，在成鼠的
卵泡颗粒细胞中有较高表达。在人类的睾丸发育过
程中，从胎儿时期到成人，GATA4 均有表达［9］。虽
然 GATA4 在鱼类中也有相关研究，如在斑马鱼和青
鳉中 GATA4 调节多种器官的形成［10］，但 GATA4 在
鱼类性腺发育中的功能文献报道较少。
实时定量 PCR（Quantitative real-time polymerase 
chain reaction，qRT-PCR）是检测基因表达最灵敏的
方法之一，尤其是针对表达量较低的基因［11］。qRT-
PCR 具有可直接监测扩增中荧光信号变化获得定量
结果，精确性高，定量和扩增同步进行［12］等优点。
本研究通过 qRT-PCR［13-15］对红鳍东方鲀成鱼
肾脏、脑、肌肉、脾脏、肝脏、精巢和卵巢等组织
进行 GATA4 的组织表达分析以及不同发育时期（23、
30、40、60 和 80 日龄）的红鳍东方鲀幼鱼个体水
平的 GATA4 表达分析，以期为今后进一步研究红鳍
东方鲀 GATA4 的功能提供参考。
1 材料与方法
1.1  材料
实验用 3 龄健康的红鳍东方鲀成鱼采自大连天
正实业有限公司，采集肾脏、脑、肌肉、脾脏、肝脏、
精巢和卵巢，保存在 RNAlater 试剂中。
实验用健康的红鳍东方鲀幼鱼采自大连富谷
水产有限公司，分别于 23 日龄、30 日龄、40 日
龄、60 日龄和 80 日龄时采集幼鱼个体，保存在
RNAlater 试剂中。 
1.2  方法
1.2.1  引 物 设 计 及 合 成  按 照 SYBR Premix Ex 
TaqTM Ⅱ kit（Tli RNaseH Plus） 引 物 设 计 原 则，
用 Primer Premier 5 软 件［16］ 设 计 GATA4 基 因 的
qRT-PCR 引 物， 利 用 NCBI 上 的 Primer-BLAST 在
Takifugu rubripes 的基因组和转录组下进行比对，结
果显示 GATA4 引物的特异性好［17］。内参基因选用
红鳍东方鲀 β-actin 基因的引物［18］。引物序列由大
连宝生物公司合成，引物信息见表 1。
表 1 本研究所用引物
引物名称 序列（5-3） 产物长度 /bp
β-actin-F TGTGCTGTCCCTGTATGCC 220
β-actin-R GTCACGCACGATTTCCCT
GATA4-F AAACGCAAACCCAAGAACC 191
GATA4-R GCAGGCAGGGCTGAAAT
1.2.2  总 RNA 的提取及 cDNA 的合成  按照 Trizol
说明书（上海生工）的步骤提取成鱼肾脏、脑、肌
肉、脾脏、肝脏、精巢、卵巢组织和各个时期幼鱼
的总 RNA。用浓度为 1% 的琼脂糖凝胶进行电泳确
定总 RNA 的完整性，可以明显看到 28S、18S 和 5S
的三条带。利用分光光度计测定 RNA的 OD值以确
定 RNA 的浓度及纯度，且保证 OD260nm/OD280nm 值在
1.8-2.0 之间。按照 PrimeScriptTM RT reagent Kit（大
连宝生物）说明书的步骤，进行反转录反应，获得
GATA4 的 cDNA。
1.2.3  基因序列的测序及鉴定  利用合成的 GATA4
引物，将获得的 cDNA 进行 PCR 扩增，获得 GATA4
的 DNA 序列，与 pUCm-T vector 载体连接，导入到
DH5α 大肠杆菌感受态细胞中，培养过夜，进行蓝白
2016,32(6) 157郝薇薇等：红鳍东方鲀转录因子 GATA4基因的表达
斑筛选。挑取白斑扩增培养后提取质粒，经琼脂糖
电泳检测后的完整质粒送宝生物公司进行测序，进
而鉴定引物的可用性。
1.2.4  标准曲线的制定  目的基因和内参基因分别
设置 5 组标准品，以水为模板作为阴性对照，每组
设置 3 个平行。β-actin 的模板是将上述 cDNA 原液
按 100 倍、101 倍、102 倍、103 倍和 104 倍进行稀释。
GATA4 的模板是将上述 cDNA 原液按 50 倍、51 倍、
52 倍、53 倍和 54 倍进行稀释。实时定量设备为 ABI
公司的 Stepone plus 荧光定量 PCR 仪。PCR 反应体
系（20 μL）：2×TransStart®Top Green qPCR SuperMix 
10 μL，Passive Reference Dye Ⅰ（50×）0.4 μL，上
下游引物各 0.2 μL，cDNA 模板 1.0 μL，DEPC 水 8.2 
μL。PCR 反应条件：95℃预变性 30 s；95℃变性 5 s，
61℃退火 15 s，72℃延伸 10 s，共 40 个循环。
1.2.5  相对表达定量荧光 PCR  β-actin 和 GATA4 两
个基因分别以上述获得的 cDNA 为模板，进行相对
表达实时定量 PCR，成鱼肾脏、脑、肌肉、脾脏、
肝脏、精巢、卵巢和各时期幼鱼的基因表达分别设
置 3个重复。
1.2.6  数据处理  在 β-actin 和 GATA4 的标准曲线的
斜率接近的情况下，Stepone plus 荧光定量 PCR仪输
出的相对表达实时定量结果，以相同模板 β-actin 的
表达进行归一化处理，进行 2-ΔΔCT 数据处理［19-21］，
GATA4 在各个组织的表达量、不同发育时期进行比
较。使用 SPSS20 软件进行数据单因素方差分析［22］
和新复极差法（Duncan 法）多重比较，显著性水平
设为 0.05。
2 结果
2.1  基因序列的测序及鉴定结果
用 BioEdit software 打开经公司测得的 GATA4 
PCR 产物序列峰图，查找 GATA4 引物序列所在位置。
根据表 1 所示上游引物序列 5-AAACGCAAACCCA-
AGAACC-3 进行比对查找，根据表 1 下游序列的
反向互补序列 5-ATTTCAGCCCTGCCTGC-3 进行比
对查找，结果如图 1 所示。由图 1 可以算出 GATA4 
PCR 片段总长度为 191 bp，与用 Primer-BLAST 比
对后的片段长度相同。用 MegAlign software 打开
GATA4 PCR 产物 FASTA 格式的测序结果与 GATA4
的mRNA序列进行比对，完全吻合。
图 1 GATA4 上游和下游引物序列与测序峰图比对结果
2.2  GATA4和β-actin基因引物特异性的验证
通过实时定量 PCR 反应，GATA4 和 β-actin 的
熔解曲线分别在 90.64℃和 87.82℃处有一峰，且无
杂峰，说明此次设计的 GATA4 引物特异性良好，符
合实时定量 PCR的要求，可以继续进行实验。
2.3  β-actin和GATA4引物扩增效率的鉴定
标准曲线由实时定量 PCR 仪自动生成，其中
纵坐标是荧光信号到达阈值时所经历的循环数，横
坐标表示模板的相对浓度（假设原模板的浓度时 1，
根据稀释倍数，浓度依次递减）。β-actin 和 GATA4
引物的扩增效率分别为 99.964% 和 102.344%，均在
90%-105% 之间，线性程度在 98% 以上，说明两对
引物可以用于 2-ΔΔCT 相对定量表达分析。
2.4  红鳍东方鲀GATA4的组织表达
红鳍东方鲀 GATA4 的组织表达结果见图 2。根
据标准曲线中目的基因各个浓度的 CT值的大小，选
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6158
择原液作为模板进行 GATA4 相对表达（2-∆∆ct 法）实
时定量实验，选用性腺发育成熟后的红鳍东方鲀的
肾脏、脑、肌肉、脾脏、肝脏、精巢和卵巢组织作
为本实验的样本，分别获得 3 个个体的肾脏、脑、
肌肉、脾脏、肝脏、精巢、卵巢和各时期幼鱼组织
的 RNA后进行反转录。将模板 cDNA 和实时定量试
剂盒进行混合，用 ABI 公司的 Stepone plus 实时定量
仪进行定量，将获得的结果进行整理，得到的结果
每个组织 3个复孔之间的标准差 SD均 <0.5。
通过 SPSS 软件进行单因素方差分析和 Duncan
法多重比较获得两两组织之间的差异显著性，成鱼
红鳍东方鲀精巢、卵巢和肝脏 GATA4 表达量显著高
于其他组织（P<0.05）；GATA4 在精巢中显著性高于
肝脏中的表达（P<0.05），而肝脏中的表达量显著高
于卵巢中的表达；在肌肉、脾脏、肾脏和脑 4 个组
织中的表达差异不显著。图 2 显示，GATA4 在精巢
中的表达量最高，在脑中最低。精巢中的表达量约
是卵巢中的 2 倍。结果显示，表达量顺序是：精巢
＞肝脏＞卵巢＞肌肉＞脾脏＞肾脏＞脑。
性高于其他时期（P<0.05）。同样，23 日龄幼鱼和
80 日龄幼鱼，60 日龄幼鱼和 40 日龄幼鱼，两两之
间 GATA4 表达差异不显著，但与其他时期存在显著
性差异（P<0.05）。23 日龄、30 日龄、60 日龄雄性
幼鱼GATA4的表达量极显著高于同时期的雌性幼鱼，
在 40 日龄时雌性 GATA4 的表达极显著高于雄性表
达；80 日龄雄性幼鱼的表达显著性高于雌性幼鱼。
1400
1200
1000
800
600
400
200
0G
AT
A4
สഐн਼㓴㓷⴨ሩ㺘䗮
䟿
㛮㜿d d d d
b
c
a
㝁 㝮 㛍 㚼㚹 থᐒ ㋮ᐒ
不同字母的柱形表示两者之间存在显著性差异（P<0.05）；误差线所示标准
差值均扩大 200 倍
图 2 红鳍东方鲀 GATA4 基因的表达谱
标有大、小写字母的柱形分别表示雄性、雌性红鳍东方鲀 GATA4 表达量的
差异显著性水平，不同字母表示存在显著性差异（P<0.05）；** 表示 GATA4
表达量在同一时期的雌雄性间存在的差异极显著（P<0.01）；* 表示 GATA4
表达量在同一时期的雌雄性间存在的差异显著（P<0.05）
图 3 红鳍东方鲀 GATA4 基因在发育过程中的表达
G
AT
A4
สഐн਼ਁ㛢ᰦᵏ⴨ሩ
㺘䗮䟿
23 30 40 60 80ᰦ䰤dbd b a d b BCCB**
**
**
*
** A30
25
20
15
10
5
0
䳴ᙗ䳼ᙗ
2.5  红鳍东方鲀GATA4的不同发育时期表达
红鳍东方鲀 GATA4 的不同发育时期表达结果
如图 3 所示。红鳍东方鲀雌性个体各个发育时期
GATA4 的表达情况为：40 日龄幼鱼 GATA4 的表达量
最高，与其他时期 GATA4 的表达量相比，存在显著
性差异（P<0.05）。23 日龄、30 日龄和 80 日龄幼鱼
之间 GATA4 表达差异不显著；23 日龄幼鱼和 60 日
龄幼鱼之间 GATA4 表达量差异不显著。在雄性个体
不同发育时期，30 日龄幼鱼 GATA4 的表达水平显著
雌性幼鱼 5 个发育时期中，从 23 日龄到 40 日
龄逐渐升高，40日龄最高，随后表达量降低到 60
日龄，从 80 日龄后又有上升的趋势。在雄性幼鱼 5
个发育时期，GATA4 表达量从 23 日龄到 30 日龄逐
渐升高，30 日龄最高，随后表达量降低到 40 日龄，
从 60 日龄到 80 日龄又有上升的趋势。各时期雌雄
幼鱼 GATA4 的表达量比较，除 40 日龄外，其他各
个时期在雄性中的表达量均高于在雌性中的表达量。
3 讨论
3.1  GATA4的组织表达
人们曾对一些动物 GATA4 的结构和功能做了深
入研究，其中，对人、小鼠等哺乳动物中 GATA4 的
研究较广、较全面，研究了各组织中的表达，发现
GATA4 在很多器官的重要发育时期都有表达，如：
心脏、肝脏、胃、胰腺、肠、肾上腺等，并且在雌
雄性腺中均有表达，GATA4 在性腺的发育早期高表
达，之后的发育过程中，在精巢的支持细胞和间质
2016,32(6) 159郝薇薇等：红鳍东方鲀转录因子 GATA4基因的表达
细胞中表达，在卵巢的颗粒细胞中有表达［23］。叶
凯等［24］通过 qRT-PCR 研究罗非鱼 GATA4 组织表
达模式，检测到 GATA4 在心脏、肝脏、肠、精巢、
卵巢和头肾中均有表达。与哺乳动物和罗非鱼中的
GATA4 组织表达情况一样，qRT-PCR 检测红鳍东方
鲀成鱼的 7个组织：肾脏、脑、肌肉、脾脏、肝脏、
精巢和卵巢组织中GATA4在各组织中也有广泛表达。
在哺乳动物中，Hu等［25］通过对小鼠 GATA4 的
沉默，进行包埋荧光免疫切片观察，结果显示实验
组小鼠胚胎中没有性腺发育的痕迹，而在对照组中
发现性腺发育的上皮细胞明显增厚，也发现 GATA4
在性腺的形成中必不可少。红鳍东方鲀在精巢中
GATA4 表达量最高，其次是肝脏中的表达量，卵巢
中的表达量排第 3，在肌肉中少量表达，肾脏、脑
和脾脏中表达量极少。罗非鱼［26］GATA4 主要在肝
脏中表达，其次是精巢、卵巢和心脏，可以看出
GATA4 在红鳍东方鲀和罗非鱼的性腺中均有较高的
表达，推测 GATA4 对性腺发育过程具有重要作用。
本研究还发现红鳍东方鲀精巢的表达量高于卵
巢，预测红鳍东方鲀中的 GATA4 对雄性性腺发育
至关重要。叶凯等［24］通过 qRT-PCR 研究罗非鱼
GATA4 组织表达模式，发现 GATA4 能上调雄性相关
基因 Amh 的表达，抑制雌雄通路相关基因 cyp19a1a
的表达，通过基因调节苗勒管的退化和雄性激素的
产生来促成雄性生殖腺的发育，从而表明 GATA4可
能是雄性通路上的重要基因。Manuylov 等［27］通过
敲除 GATA4 的小鼠胚胎，发现睾丸间质细胞急剧减
少，而且卵巢特异性表达基因 foxl2 被发现，GATA4
在小鼠中影响性腺的分化［28，29］。这些实验均表明
GATA4 在雄性性腺发育中具有重要作用。
3.2  GATA4在不同发育时期的表达
应用 qRT-PCR 检测红鳍东方鲀不同发育时期
（23、30、40、60 和 80 日龄）个体 GATA4 的表达情
况，各时期雌雄幼鱼的 GATA4 表达量对比发现，除
40 日龄外，其他各个时期 GATA4 表达量在雄性中均
高于在雌性中的表达量，这与前面得出的结果一致。
雌性幼鱼 GATA4 表达从 23-40 日龄之间表达量
逐渐升高，在 40 日龄时表达量最高，之后下降。幼
鱼雄鱼 GATA4 表达从 23-30 日龄之间，表达量逐渐
升高，在 30 日龄时表达量最高，之后下降。斑马
鱼［30］GATA4 在胚胎发育 50%外包之前表达量较低，
从 75%外包开始升高并且在胚胎封口期表达量达到
最高，随后表达量降低，稳定表达到 12 d 左右，之
后有所降低。两者的 GATA4 不同时期表达量的总体
趋势相同，都是先升高后降低，但是出现表达量最
高的时间不同，这是由于红鳍东方鲀和斑马鱼的发
育周期不同。在两种鱼的形态发育早期，GATA4 均
表现出高水平表达。
根据 GATA4 介导类固醇生物合成步骤中所需要
的基因，从而调节雌雄激素的合成，影响性腺的发 
育，成熟。红鳍东方鲀幼鱼性腺分化或者发育的关
键时期，雌雄性激素大量合成，需要 GATA4 进行调 
节，从而导致 GATA4 的高表达。雄鱼 23 日龄，雌
鱼 40 日龄 GATA4 的高表达是否由于性腺的分化引
起，有待进一步探究，例如可以研究 GATA4 调节的
下游雌性相关基因 cyp19a 或者雄性相关基因 gsdf 在
红鳍东方鲀发育过程中的表达及其功能。
4 结论
本研究利用 qRT-PCR 对 GATA4 在红鳍东方鲀
成鱼不同组织中和幼鱼不同发育阶段的表达进行了
初步的分析，GATA4 在精巢中表达量最高，其次是
在肝脏、卵巢中的表达量，且在精巢中的表达量接
近在卵巢中的表达量的 2倍。GATA4 在 23 日龄、30
日龄、40 日龄、60 日龄和 80 日龄各阶段的表达，
除 40 日龄外，其他各个时期 GATA4 在雄性中的表
达量均高于在雌性中的表达量。雌性幼鱼 GATA4 的
表达量从 23-40 日龄，表达量逐渐升高，在 40 日龄
时达到最高值，之后下降。雄鱼幼鱼 GATA4 的表达
量从 23 日龄到 30 日龄，表达量逐渐升高，30 日龄
时表达量最高，之后下降。
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（责任编辑  马鑫）