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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(3):191-198
收稿日期 ：2014-08-29
基金项目 ：国家科学自然基金项目（31172430），“863”计划项目（2011AA10A216），公益性农业行业专项项目（201203085）
作者简介 ：赵依妮，女，硕士研究生，研究方向 ：鱼类药物受体，药物代谢动力学 ；E-mail ：zhaoyini21@126.com
通讯作者 ：杨先乐，男，教授，研究方向 ：水产养殖疾病的防治 ；E-mail ：xlyang@shou.edu.cn
异育银鲫 GABA A 受体 γ2 亚基全长克隆及生物信息学
分析
赵依妮1 胡鲲1 孙琪1，2 杨先乐1 阮记明1 周爱玲1
（1. 上海海洋大学国家水生动物病原库，上海 201306 ；2. 上海黛龙生物科技工程有限公司，上海 201414）
摘 要 ： 近年来 GABA A 受体亚基特异性在药物筛选、研发过程中的应用得到广泛地关注，其中有关 α1、β2 和 γ2 三种
功能性亚基的研究最为深入。异育银鲫因其良好的生长、繁殖优势，在国内得到广泛养殖。采用 RACE 法克隆得到了异育银鲫
GABA A 受体 γ2 亚基基因全长 cDNA，并进行了生物信息学分析。该基因长 2 763 bp，其中 CDS 区长 1437 bp，可编码 477 个氨基
酸的前体蛋白。预测蛋白分子量 55.3 kD，理论等电点 9.13。异育银鲫体内 GABA A 受体 γ2 亚基氨基酸序列 N 端存在 1 个长度为
35 个氨基酸的信号肽，4 个长度分别为 23、20、23 和 23 个氨基酸的跨膜区，3 个 N-糖基结合位点和 2 个 O-糖基化位点，1 个特
异性结构域，其氨基酸序列具有明显的氯离子门控通道家族特征。氨基酸序列与其他物种氨基酸序列的同源性都在 89% 以上，表
明该蛋白属于 GABA A 受体亚基家族。系统进化树表明异育银鲫与斑马鱼聚为一支，亲缘关系最近。
关键词 ： 异育银鲫 ；GABA A 受体 γ2 亚基 ；克隆 ；生物信息学分析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.028
Cloning and Bioinformatics Analysis of GABA A Receptor γ2 Subunit
Gene in Carassais auratus gibebiol
Zhao Yini1 Hu Kun1 Sun Qi1，2 Yang Xianle1 Ruan Jiming1 Zhou Ailing1
（1. State Collection Center of Aquatic Pathogen，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306 ；2. Delon Hi-Tech Ltd.，Shanghai 201414）
Abstract: The application of the specificity of GABA receptor subunits in drug screening and drug development got widely attention
recently, of which three function subunits α1, β2 and γ2 studied deeply. Furthermore, Carassais auratus gibebiol as its good growth and
reproduction had been widely farmed in china. In the present study, we cloned and characterized GABA A receptor γ2 subunit full-length gene.
The full-length Carassais auratus gibebiol GABA A receptor γ2 subunit cDNA was 2 763 bp in length, contained a 1437 bp open reading frame
（ORF）, and encoded 477 amino acids which constituting a 55.3 kD protein molecule with an isoelectric point of 9.13. The γ2 subunit protein
was hydrophilic. The protein sequence had one signal peptide, consisting of 35 amino acid residue. The sequence of amino acids contained
four transmembrane regions, which length of 23，20，23 and 23 aa, involving in electronic transfer catalysis between the internal and external
membrane. We found three N-glycosylation sites, two O- glycosylation sites and an extracellular domain which had obvious ligand-gated ion
channels’ characteristics. Sequence comparison revealed that the similarity of the γ2 subunit protein all above 89% with other aquatic animals
showed that it belongs to GABA A receptor subunits’ family. We conducted a phylogenetic analysis using the neighbor joining（NJ）method.
The evolutionary tree showed that the γ2 subunit protein was clustered with the zebra fish which indicated that they are the two most closely
related species.
Key words: Carassais auratus gibebiol ；GABA-A receptor γ2 subunit ；cloning ；bioinformatics analysis
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3192
γ-氨基丁酸（GABA）是脑组织内主要的抑制性
神经递质，主要通过 GABA 受体起作用。根据受体
对激动剂及拮抗剂的敏感性差异，可将 GABA 受体
分为 A、B、C 三种类型［1］，其中 A 型受体是一种
跨膜门控氯离子通道，可介导阶段性的抑制突触传
递，也可强直性抑制外周突触传递，因此在神经性
疾病如焦虑和癫痫的病理生理学中起着至关重要的
作用［2］。GABA A 受体上存在 GABA、苯二氮卓类
和神经甾体三种结合位点，它是几种临床常用抗焦
虑、抗癫痫药物和麻醉剂的主要药物标靶［3］。该受
体是一种由 4 次跨膜亚基聚合形成的五聚体，中间
是中空的氯离子通道。迄今，已发现的 GABA A 受
体亚基可分为 7 种（α1-6，β1-3，γ1-3，ρ1-3，δ，ε，θ）［4］。
研究发现，多数 GABA A 受体是由 α、β 和 γ 亚基
组成，且构成比多为 2∶2∶1［4，5］，其中 α1、β2 和
γ2 形成的五聚体约占 40 %［6］。不同亚单位组合成
的 GABA A 受体的生理学和药理学性质不同，γ2 亚
基在发育中和成熟脑以及脊髓中广泛表达，84% 的
GABA A 受体包含 γ2 亚基［7，8］，是 GABA A 受体主
要的功能性亚基之一［9］。研究发现 γ2 亚基在 GABA
A 受体突触聚集、突触后的定位、GABA A 受体的
胞吞作用、BDZ 识别方面起着重要作用［10-13］。 此外，
γ2 亚基也为氯离子通道正常导电所必需［14］。研究发
现 γ2 亚基存在两个剪接变体 γ2L 和 γ2S，而这两种
剪接变体表达的失衡将会导致 GABA A 受体表达的
改变，从而导致疾病的发生 ；进一步的研究表明 γ2
亚基的突变与 GABA A 受体功能障碍和家族性癫痈
综合征有关［10-12，15］。目前，有关 GABA A 受体的研
究主要集中在癫痫病治疗药物、抗抑郁等神经药物
和农用杀虫剂的创新与研制等方面［16-19］，而在水产
动物领域的相关研究鲜见报道。异育银鲫（Carassais
auratus gibebiol）具有生长快、个体大、抗逆性强等
特点，在养殖生产中显示出良好的经济性状，在国
内得到广泛养殖。迄今为止，有关 GABA A 受体 γ2
亚基基因克隆在哺乳动物神经性疾病、新型药物研
发的研究报道中较多，而在鱼类中的研究报道较少。
本研究以异育银鲫为研究对象，利用 RACE 法对
GABA A 受体 γ2 亚基基因进行克隆和序列分析，以
期为后续研究 GABA A 受体 γ2 亚基基因在渔药研发
及安全性评估奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 健康的异育银鲫购买于江苏省南
通某国营农场，体重（61±5.5）g。用 2% NaCl 浸
泡 10 min，然后放置于高锰酸钾消毒后的水族箱
（100×80×80 cm3）内暂养 2 周，饲喂普通颗粒饲料。
试验期间使用自动控温系统控制水温为（20±2）℃，
24 h 充气，2 d 换一次水。试验时取异育银鲫 6 条，
取脑组织样品，液氮迅速冷却，储存在 -70℃条件下
备用。
1.1.2 主要试剂和仪器 Trizol 试剂（美国 Invitrogen
公 司 ）， 反 转 录 酶、Ex Taq DNA 聚 合 酶（ 日 本
TaKara 公司），SMARTerTM RACE cDNA Amplification
Kit（Clontech），DH5α 感 受 态 细 胞（TaKaRa）， 引
物、AXYGEN 柱 式 凝 胶 回 收 试 剂 盒、AXYGEN 小
量质粒提取试剂盒（上海生工生物有限公司）。PCR
仪 为 eppendof Mastercycle Gradient， 核 酸 测 定 仪 为
eppendof Biophotomter。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取与反转录 分离异育银鲫脑
组织，按 Trizol 法提取总 RNA。采用紫外分光光度
计与 1.0 % 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的浓度及完整
性，-80℃保存备用。使用 M-MLV 反转录 cDNA。反
转录体系及反应条件按照试剂盒推荐体系进行。
1.2.2 引物设计、基因片段的克隆及测序 应用
Primer Premier 5.0 软件，根据 GeneBank 发表的斑马
鱼（NM_001256250.1）GABA A 受体的 γ2 亚基序列
设计一对特异性引物 F1&R1（表 1），引物由上海生
工生物有限公司合成。PCR 反应体系及反应条件按
照试剂盒推荐体系进行。1.0 % 的琼脂糖凝胶电泳
检验扩增产物，按琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒操作
说明纯化回收特异性扩增产物，并连接至 pMD19-T
vector 载体，将链接好的质粒转化感受态 DH5α，通
过蓝白斑筛选和菌落 PCR 初步鉴定后，阳性菌落于
37℃震荡培养过夜。提取质粒后将鉴定为阳性的克
隆送上海生工生物科技有限公司进行测序。
1.2.3 5 RACE 和 3 RACE 以获得的基因片段为模
板设计用于 3 和 5 端 RACE 所需引物（表 1）。利
用 BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 试剂
2015,31(3) 193赵依妮等 ：异育银鲫 GABA A 受体 γ2 亚基全长克隆及生物信息学分析
盒反转录得到的 cDNA 第一链为模板，按照试剂盒
推荐体系进行 3 和 5 RACE 反应。反应产物的检验、
纯化、克隆、测序与上述基因片段的克隆所述相同。
表 1 本文所用引物
引物 序列（5-3）
Part 1 F1 GGCGTCTGTACCAGTTCTCTTT
R1 GGGTCTTGTTGGAATCTGTAAC
3 RACE GSP2a CCGCAAGCCCAGCAAAAACAAAG
GSP2b CCGCAAGCCCAGCAAAAACAAAGA
5 RACE GSP1a GGAGCAGTCCTTCCCATCCAGACAC
GSP1b GGAGCAGTCCTTCCCATCCAGACACT
1.2.4 序列拼接与生物信息学分析 利用 DNAStar
软件中的 SeqMan 程序对测序结果进行载体序列的
去除和拼接。序列同源性对比和相似性搜索用 NCBI
BLAST 软 件 进 行 ；开 放 阅 读 框（ORF） 的 寻 找 用
NCBI 上的 ORF Finder 进行 ；信号肽查找用 Sginal P
4.1 Server 程序进行 ；利用 TMHMM 对跨膜域进行预
测 ；蛋白特征模体查找采用 SMART 软件 ；蛋白质
性质分析采用 ExPASy server 软件 ；多序列比对采用
ClustalW 1.8 软件，用 MEGA4.0 的邻接法对异育银
鲫 GABA A 受体 γ2 亚基氨基酸序列与 GenBank 上发
表的氨基酸序列构建系统进化树，1 000 次重复计算
自展分析值，利用 NCBI 在线软件预测结构特征。
2 结果
2.1 GABA A 受体 γ2亚基基因全长cDNA的获得
以异育银鲫脑组织 cDNA 为模板，利用所设计
的特异性引物 F1 和 R1 扩增获得了一条长约 850 bp
的特异性条带（图 1-A），与预期大小相同。以异育
银鲫脑组织总 RNA 为模板，用 RACE 试剂盒进行反
转录、5 RACE 和 3 RACE 反应，分别获得了一条长
约 1 400 bp 和 1 600 bp 的特异性条带（图 1-B，1-C）。
2.2 GABA A 受体 γ2亚基基因序列测定及分析
序列拼接后得到长度为 2 763 bp 的异育银鲫
GABA A 受体 γ2 亚基的 cDNA 序列（图 2），其中 5
非编码区长 64 bp，3 非编码区长 1 262 bp，蛋白质
编码区（CDS）长 1 437 bp，CDS 区可编码 477 个氨
基酸的前体蛋白。
2.3 GABA A 受体 γ2亚基蛋白生物信息学分析
Protparam 在线软件分析表明 γ2 亚基基因编码
蛋白的分子式为 C2515H3891N657O697S26，预测蛋白质分
子量约为 55.3 kD，理论等电点是 9.13。GABA A 受
体 γ2 亚基蛋白质在异育银鲫体内半衰期 30 h，不
稳 定 系 数 为 37.09， 总 平 均 亲 水 性 为 -0.062。 以
ProtScale 程 序 分 析 GABA A 受 体 γ2 亚 基 CDS 区
cDNA 编码的氨基酸，发现亲水性残基所占比列远
大于疏水性残基，因此推测 GABA A 受体 γ2 亚基
CDS 区编码蛋白是亲水性的。
采用 Signal P 预测 GABA A 受体 γ2 亚基 CDS 区
序列特征，结果表明存在 1 个信号肽，长 35 氨基
酸，信号肽序列为 MVIMASSSHRSSKCLNAMMIPAI
SLKLCLWALLIA，故推测 GABA A 受体 γ2 亚基属于
分泌型蛋白。TMHMM 分析（图 3）表明 GABA A 受
体 γ2 亚基含有 4 个明显的跨膜区，长度分别为 23、
20、23、23 个氨基酸，与其进行膜内外 Cl-离子传
递功能有关，属于跨膜蛋白类。通过 NetNGlyc1.0 分
析推测 GABA A 受体 γ2 亚基糖基结合位点，结果表
明 GABA A 受体 γ2 亚基在含有 3 个 N-糖基化位点、
分别位于第 53、第 130 和第 248 氨基酸处，且这 3
处氨基酸都是天门冬酰胺，此外，GABA A 受体 γ2
亚基还含有两个 O-糖基化位点，因此推测 GABA A
受体 γ2 亚基可能是个糖蛋白。
2.4 GABA A受体γ2亚基基因编码蛋白的系统发育
分析
使用 Blast 程序检索异育银鲫 GABA A 受体 γ2
亚基氨基酸序列与其他物种的同源性（图 4）。利用
CLUSTAL 1.83 软件将异育银鲫 γ2 亚基氨基酸序列
与斑马鱼（Danio rerio，NP_001243179.1）、斑马宫
100
250
500
750
1000
2000
M
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M
B
100
250
500
750
1000
2000
M
C
M ：DNA 标准 ；A ：GABA A 受体 γ2 亚基基因 cDNA 中间片段 ；B ：GABA A
受体 γ2 亚基基因 cDNA 3 RACE 产物 ；C ：GABA A 受体 γ2 亚基基因 cDNA
5 RACE 产物
图 1 GABA A 受体 γ2 亚基扩增产物
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3194
1
58
1
115
18
172
37
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75
343
94
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113
457
132
514
151
571
170
628
189
685
208
742
227
799
246
856
265
913
284
970
303
1027
322
1084
341
1141
360
1198
379
1255
398
1312
417
1369
436
1426
455
1483
474
1540
1597
1654
1711
1768
1825
1882
1939
1996
2053
2110
2167
2224
2281
2338
2395
2452
2509
2566
2623
2680
2737
起始密码子 ATG 和终止密码子 TAA 用方框标出，信号肽用下划线标出，跨膜区（TM1-TM4）用灰色背景标出，
组成赖氨酸环的两个保守性赖氨酸用深灰色背景标出，加尾信号用斜体标出
图 2 异育银鲫 GABA A 受体 γ2 亚基基因 cDNA 序列及推导的氨基酸序列
2015,31(3) 195赵依妮等 ：异育银鲫 GABA A 受体 γ2 亚基全长克隆及生物信息学分析
丽鱼（Maylandia zabra，XP_004550435.1）、罗非鱼
（Oreochromis niloticus，XP_005452616.1）、青鱂（Oryzias
latipes，XP_004076169.1）、 红 鳍 东 方 鲀（Takifugu
rubripesTakifugu rubripes，XP_003970978.1）， 斑 点
雀 鳝（Lepisosteus oculatus，XP_006631877.1）， 美 洲
狼鲈（Morone Americana，AAL50804.1），维多利亚
湖 慈 鲷（Pundamilia nyererei，XP_005727815.1） 进
行 比 对， 结 果 发 现 相 似 性 在 89%-95% 之 间。 根
据 GenBank 上已注册该亚基的氨基酸序列，使用
MEGA 软件构建系统进化树（图 5）。结果显示，异
育银鲫 GABA A 受体 γ2 亚基的氨基酸与斑马鱼的聚
为一支，表明其亲缘性最近。蛋白质二级结构预测
分析发现 GABA A 受体 γ2 亚基前体蛋白结构域包含
1 个配体门控离子通道（LGICs）超家族共有的结构
域，该结构域保守核心区域氨基酸序列具有明显的
氯离子门控超级家族的特征 ：主要位于 N 端细胞外
域，约由 240 个氨基酸组成的亲水性肽链，含有两
个保守性 N 糖基化位点，是主要的胞外配体结合区
域。虽然不同物种之间该结构域氨基酸序列有一定
差异性，但是其总体拓扑和折叠结构是高度保守的。
3 讨论
本 研 究 获 得 了 异 育 银 鲫 GABA A 受 体 γ2 亚
基 2 763 bp 的 cDNA 全 长 序 列， 其 中 5 非 编 码 区
长 64 bp，3 非编码区长 1 262 bp，蛋白质编码区长
1 437 bp，可编码 477 个氨基酸。到目前为止，在
斑马鱼（Danio rerio，NP_001243179.1）、斑马宫丽
鱼（Maylandia zabra，XP_004550435.1）、 罗 非 鱼
（Oreochromis niloticus，XP_005452616.1）、青鱂（Oryzias
latipes，XP_004076169.1）、 红 鳍 东 方 鲀（Takifugu
rubripesTakifugu rubripes，XP_003970978.1），斑点雀
鳝（Lepisosteus oculatus，XP_006631877.1）， 美 洲 狼
鲈（Morone Americana，AAL50804.1），维多利亚湖
慈 鲷（Pundamilia nyererei，XP_005727815.1） 等 水
产动物中都已发现有 GABA A 受体 γ2 亚基的存在。
对 GABA A 受体 γ2 亚基氨基酸序列进行种间相似性
分析及 MEGA4 系统进化树分析，结果表明异育银
鲫与斑马鱼遗传距离更近。鲤鱼、鲫鱼和斑马鱼又
同属于鲤形目鲤科，而异育银鲫是以天然雌核发育
的方正银鲫为母本，以兴国红鲤为父本，经人工授
精繁育的子代，因此异育银鲫与斑马鱼亲缘关系比
较近。陈笑霞［20］对鱼类 GABA A 受体的研究也发
现异育银鲫同斑马鱼的遗传距离更近。斑马宫丽鱼、
罗非鱼、维多利亚湖慈鲷同属鲈形目慈鲷科，因此
聚为一支。而美洲狼鲈虽然也属于鲈形目，却并未
与上述几种鲈形目鱼类聚为一支，显示出 GABA A
受体 γ2 亚基在进化上的差异性。通常认为，蛋白质
的空间结构及其功能较核酸一级序列（基因序列）
具有更大的保守性，因此一般来讲，如果蛋白质序
列间的相似性大于 30%，它们很可能是同源的［21］。
通过蛋白质同源性检索发现，γ2 亚基氨基酸序列种
间相似性在 89%-95% 之间，表明 γ2 亚基氨基酸序
列的折叠结构和拓扑结构具有较高的保守性。在相
似的基础上，不同动物之间 GABA A 受体亚基的氨
基酸序列的相似性有所不同，这在一定程度上反映
了生物进化的关系 ；同时，GABA A 受体亚基的氨
基酸结构具有较高的保守性，但不同物种间仍存在
一定差异，反映出不同种属 GABA A 受体在生理功
能上存在的差异性［22］。
异育银鲫 γ2 亚基氨基酸序列及其蛋白质二级结
构具有明显的 GABA A 受体亚基家族的特征。首先，
所有跨膜区域都是以 α-螺旋形式横过细胞膜，彼此
之间通过亲水性氨基酸相连，并相互作用形成氯离
子通道，而细胞膜内外两侧大量带正电的氨基酸残
基则形成离子通道口，起着阴离子滤膜的作用，这
与其进行调控膜内外氯离子传递这一功能有关［23］。
此外，TM1 部位脯氨酸（P 283）的存在，使肽链
具备弯曲的能力，也使 TM1 在氯离子通道的打开及
关闭过程中起着关键性作用［24］；TM2 构成了受体
氯离子通道内壁且 TM2 中的氨基酸残基决定了受体
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4pr
ob
ab
ili
ty
0.2
0
50 150100 250 350 450400300200
transmembrane inside outside
图中横坐标为氨基酸所在位置，纵坐标为跨膜区域存在的概率，纵坐标 1
位置为细胞膜（颜色标识见电子版）
图 3 GABA A 受体 γ2 亚基蛋白质跨膜区分析结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3196
58
57
53
56
53
56
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54
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128
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123
126
123
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126
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193
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196
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267
263
266
263
266
276
264
266
338
337
333
336
333
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346
334
336
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405
402
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405
477
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471
474
471
475
485
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Consensus
图 4 异育银鲫 GABA A 受体 γ2 亚基氨基酸序列与其他物种 GABA A 受体 γ2 亚基氨基酸序列比较
2015,31(3) 197赵依妮等 ：异育银鲫 GABA A 受体 γ2 亚基全长克隆及生物信息学分析
对氯离子的选择性，进一步的研究表明 TM2 跨膜
区域较多的苏氨酸（T 306、311、312、315、317、
318 和 321）和丝氨酸（S 307，320），将有利于氯
离子在通道内的流动［25］；TM3-TM4 之间有一个大
的细胞内结构域，其上包含了许多潜在的磷酸化位
点，因而它是受体磷酸化调节的主要区域［24］。其次，
GABA A 受体 γ2 亚基包含 1 个氯离子门控超级家族
胞外共有结构域，该结构域主要位于 N 端，是长链
的亲水区域，在 GABA A 受体形成过程中，亲水性
氨基末端大量 N 糖基化部位（N- 53、130 和 248）
形成了各种配体（GABA 等激动剂和苯二氮卓类配
体）的结合部位［26］。本研究还发现位于 N 端的胞外
结构域其上的 3 个 N 糖基化位点在不同物种间都发
生于相同的氨基酸残基处，这一结果同王秀坤等［27］
所得结论相一致。
4 结论
本研究首次克隆得到了异育银鲫 GABA A 受
体 γ2 亚基基因全长序列，并对其进行了详细的位点
分析和结构域预测，填补了国内外在该研究领域的
空缺。同时，γ2 亚基全长基因克隆为异育银鲫体内
GABA A 受体其他亚基基因克隆提供参照，推动鱼
类受体研究的发展，为进一步探讨 GABA A 受体在
渔药安全性评价和新型渔药开发等方面的研究与应
用提供奠定基础。
参 考 文 献
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0.01
图 5 不同物种 GABA A 受体 γ2 亚基的系统进化树
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（责任编辑 李楠）