全 文 ：
研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 1期
异育银鲫 BMP15基因片段的克隆及序列分析
刘志伟
陈阿琴
魏华
冷向军
(上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306)


摘
要:
根据斑马鱼骨形态发生蛋白 15( bone m orphogene tic pro tein, BM P15)基因的保守区序列设计引物, 采用 RT-PCR
法扩增出异育银鲫 BMP15基因的部分序列,该片段长 811 bp,编码 270个氨基酸。经过 BLAST比对, 该氨基酸序列与斑马鱼、
欧洲海鲈及人等动物 BMP15基因的同源性分别为 80%、38%及 29%。本试验结果为进一步研究该基因的结构与功能提供了
资料。
关键词:
异育银鲫
BM P15基因
序列分析
C loning and Sequencing Analysis of BMP15 Gene in
Allogynogenetic Silver Cruican Carp
L iu Zhiwei
Chen Aqin
W eiH ua
LengX iangjun
(College of F isheries and L ife Science, Shanghai O cean University, Shanghai 201306)


Abstrac:t
Accord ing to zebrafish BMP15 gene conservative reg ion o f nucleotide sequence, prim ers w as designed and the BMP15
gene fragm ent w as am plified byRT-PCR. The leng th o f the fragm ent is 811 bp, wh ich could encode a pro te in o f about 270 am ino ac ids.
A lignm ent ana lys is showed that the am ino ac ids sequence was 80% , 38% and 29% sim ilar to those o f zebrafish, European sea bass and
hum an, respectiv ely. The research would be the reference of the preparation of study the gene struc ture and b io log ica l functions.
Key words: A llogynogenetic silver cru ican carp
BM P15 gene
Sequencing analysis
收稿日期: 2010-10-08
基金项目:上海市重点学科建设项目 ( S07301 ) ,上海海洋大学博士启动基金项目 ( B-8201-08-0277) ,上海高校选拔培养优秀青年教师科研专
项基金项目 ( ssc08005)
作者简介:刘志伟,男,硕士研究生,研究方向:水产动物基因工程; E-m ai:l 87305453@ qq. com
通讯作者:陈阿琴,女,博士,讲师,研究方向:水生生物生殖生理学; E-m ai:l aqch en@ shou. edu. cn
骨形态发生蛋白 15( BMP15)是转化生长因子-

( transform ing grow th factor
, TGF-
)超家族的成
员之一。BMP15对哺乳动物的繁殖性能起重要作
用,可通过自分泌和旁分泌的方式,调控早期卵泡的
生长和分化, 影响卵母细胞发育和控制排卵过
程 [ 1]。对于 BMP15在鱼类性腺发育过程中发挥作
用的研究刚刚起步, 国内外学者只在斑马鱼和欧洲
海鲈中克隆出 BMP15基因,并发现其能够影响斑马
鱼卵泡的生长发育及抑制斑马鱼近成熟卵母细胞的
发育, 进而调控斑马鱼卵母细胞的成熟、排卵和受精
过程 [ 2- 4]。
异育银鲫是以方正银鲫 ( Carassius auratus gibe-
lio)为母本, 兴国红鲤 ( Cyprirus carp io )为父本异精
雌核发育的后代, 具有生长速度快, 适应性强等优
点, 是我国主要的淡水养殖对象之一。研究表明,蛋
白激酶基因、Vasa基因、C1q类似因子等基因在银
鲫卵母细胞中表达,参与银鲫卵母细胞发育,但对于
BMP15基因是否参与异育银鲫卵母细胞的发育及
其具体作用机制国内外均未见报道 [ 5- 7]。本试验通
过克隆测序异育银鲫的 BMP15基因, 旨在了解异育
银鲫 BMP15基因的结构、功能, 为今后进一步研究
异育银鲫性腺发育的机理及鱼类人工增养殖技术的
改进提供理论依据。
1
材料与方法
1
1
试验材料
性成熟的异育银鲫购自上海奉城水产批发市
场。取部分卵巢液氮速冻后置 - 80
冻存用以总
RNA的提取。
2011年第 1期







刘志伟等:异育银鲫 BMP15基因片段的克隆及序列分析
1
2
菌株和试剂
大肠杆菌 JM 109、胰蛋白胨、酵母提取物购自上
海生工生物工程有限公司; RNA iso Plus、反转录试
剂盒、dNTPs、rTaq聚合酶、pMD19-T Simple载体试
剂盒、X-Ga l、IPTG、琼脂糖、DNA M arker购自大连宝
生物工程有限公司; 琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒、
氨苄青霉素购自北京天根生化科技有限公司; 其他
试剂均为国产分析纯。
1
3
总 RNA的提取与反转录反应
异育银鲫卵巢总 RNA的提取按照 RNA iso Plus
操作说明书进行, 提取后溶于 RN ase free dH 2O中。
经琼脂糖凝胶电泳检测 RNA完整度、分光光度法检
测 RNA纯度后, 根据反转录试剂盒操作说明取 1

L总 RNA反转录生成 cDNA模板, 其余 RNA置
- 80
冰箱中保存。
1
4
引物设计和 PCR扩增反应
根据 GenBank中斑马鱼 BMP15基因 ( NM _
001020484)保守区序列设计 1对引物。引物由上海
生工生物工程有限公司合成。
BMP15-F: 5
-GCAGATGGACGACCAAAGCA-3

BMP15-R: 5
-AAGGAACGCAGGAGGGCAAC-3

PCR反应体系: cDNA模板 1
L, dNTP M ixture
(各 2
5mmo l/L ), 上下游引物各 0
5
L, 10
PCR
buffer 2
L, rTaq酶 ( 5 U /
L) 0
25
L, 加灭菌超纯
水至总体积 25
L。 PCR反应程序: 94
预变性
5 m in; 94
变性 30 s, 57
退火 30 s, 72
延伸 30 s, 30
个循环; 72
延伸 5m in。PCR产物经 1
2%的琼脂糖
凝胶电泳检测。
1
5
目的基因的回收与克隆
将目的片段产物按照琼脂糖凝胶 DNA回收试剂
盒说明书进行回收纯化后, 取 1
L 回收产物与
pMD19-T载体连接,连接产物经热激法转化至大肠杆
菌 JM109感受态细胞中,转化产物在 37
200 r/m in条
件下振荡培养 1 h后涂布于含有 X-Gal、IPTG以及 Amp
的 LB固体培养基上,置恒温培养箱中 37
培养过夜
( 12- 16 h)。次日在长出的蓝白斑菌落中挑选白斑,接
种于含 Amp的 LB液体培养基中继续振荡培养 4 h后,
进行菌液 PCR验证并筛选出阳性重组克隆。
1
6
DNA序列的测定与分析
阳性菌液委托上海美季生物技术有限公司进行
测序。序列分析采用 BLAST ( www. ncb.i n lm. n ih.
gov /BLAST)和 DNAMAN等软件进行。
2
结果与分析
2
1
异育银鲫 BMP15基因 PCR扩增结果
以异育银鲫卵巢 cDNA为模板, 进行 PCR反
应, 之后将 PCR所得产物以 1
2%琼脂糖凝胶电泳
检测结果 (图 1), 在约 800 bp处得到一条特异性的
清晰条带,该片段大小与设计引物时预期目的片段
大小一致。
M. DL2000 DNA M arker; 1. BMP15基因扩增结果
图 1
异育银鲫 BMP15基因 PCR扩增结果
2
2
异育银鲫 BMP15基因的克隆
将目的片段同 T载体进行连接并转化至大肠
杆菌感受态细胞后进行过夜培养, 次日挑选 8个白
色单菌落继续培养 4 h, 然后进行菌液 PCR鉴定, 电
泳结果得到符合预期大小的特异性条带,可以确定
目的片段已经插入到 T载体中,基因克隆成功。
2
3
测序结果及序列分析
对测序结果进行分析,得到 811 bp长度的序列。
用 DNAMAN、B last等程序推测得出该基因序列编码
270个氨基酸 (图 2)。经序列分析发现,该序列包含
有 TGF-
超家族基因所特有的 RIRR保守剪切位点
及 4个半胱氨酸残基。经 BLAST分析,获得的片段
与斑马鱼 BMP15基因有较高的同源性 (相似度为
83% ),表明这一序列为 TGF-
超家族中的 BMP15基
因。将该序列提交 GenBank,登录号为 HQ179985。
131
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 1期
图 2
异育银鲫 BMP15基因部分核苷酸序列及其推测的氨基酸序列
2. 4
BMP15基因同源性比较与进化树的构建
利用异育银鲫和其他 10个物种的 BMP15氨基
酸序列,采用 C lustalX和 MEGA 4软件进行多重比对
以及构建系统进化树, 结果 (图 3)表明, 异育银鲫
BMP15基因的氨基酸序列与斑马鱼 ( AA I24107)、欧
洲海鲈 ( CAP71885)、猫 ( NP _001159370)、鸡 ( AAU-
94351)、猪 (NP _001005155)、牛 (NP_001026922)、山
羊 (ACG69781)、鼠 ( EDL33879)、兔子 (ACD49804)和人
图 3
异育银鲫 BMP15与其他动物 BMP15
的系统进化树分析
( NP_005439 )的相似度分别为 80%、38%、35%、
34%、34%、34%、34%、33%、29%和 29%。
3
讨论
性腺发育是鱼类繁殖的基础,鱼类卵巢发育和
卵母细胞的成熟除受促性腺激素 ( GtH )、成熟诱导
激素 (M IH )和成熟启动因子 (MPF)等激素调节之
外, 还受到生长因子、脑肽、神经递质等因素的调
节 [ 8]。因此研究 BMP15基因在不同鱼类的结构、功
能及其作用机制十分有意义。
本试验通过 PCR扩增获得 811 bp的序列,编码
270个氨基酸,经 BLAST进行比对发现,与 NCBI提
交的斑马鱼的 BMP15基因的编码区同源性较高, 为
80%。同时, 氨基酸序列分析表明, 该序列包含
BMP15的特征序列,如 RIRR保守剪切位点、4个保守
的半胱氨酸残基,证明本试验所得到的目的基因片段
是目前尚未报道的异育银鲫 BMPA15基因的部分编
码区序列。进化树分析表明,异育银鲫 BMP15与斑
马鱼 BMP15和欧洲海鲈 BMP15这两种鱼类聚为 1
枝,属于鱼类 BMP15基因大家族,再次证明了获得序
列是预期的基因。通过比对也发现,异育银鲫 BMP15
编码序列与欧洲海鲈及其他脊椎动物 BMP15编码序
列之间的同源性较低,这与斑马鱼 BMP15与人和鼠
132
2011年第 1期







刘志伟等:异育银鲫 BMP15基因片段的克隆及序列分析
BMP15编码序列同源性低,仅为46% - 51%的结果相
似 [ 9]。以上结果表明,尽管 BMP15基因在物种的进
化中比较保守,就哺乳动物和鱼类及不同鱼类之间比
较而言,差异性还是比较大的,在功能上是否也存在
较大的差异还需要进一步的研究。
参 考 文 献
[ 1] G ilchristRB, LaneM, Th omp son JG. Oocyte-secreted factors: regu la-
tors of cumu lu s cel l fun ct ion and oocyte qual ity. H um Rep rod U p-
date, 2008, 14( 2) : 159-177.
[ 2] C lelland ES, Tan Q, B alofsky A, et a.l Inh ib it ion of prm atu re oocyte
m aturation: a ro le for bon e morphogenet ic p rotein 15 in zeb rafish o-
varian follicles. Endocrino logy, 2007, 148 ( 11) : 5451-5458.
[ 3] H alm S, Ibanez AJ, Ty ler CR, et a.l M olecu lar characterisation of
grow th d ifferent iation factor 9 ( gd f9) and bonem orphogenetic p rotein
15 ( bm p15) and their pat terns of gene expression during the ovarian
reproductive cycle in the European sea bass. Mol C ell Endocrino,l
2008, 291( 1-2) : 95-103.
[ 4] Peng C, C lelland E, T an Q. Poten tial role of bon em orphogenetic
p rotein-15 in zebraf ish fol licle d evelopm ent and oocyte m aturat ion.
Comp B iochem Phys iolA M ol In tegr Phys io,l 2009, 153( 1 ): 83-87.
[ 5] 谢京,朱燕,张帆,等.天然雌核发育银鲫与两性生殖彩鲫卵母细
胞中蛋白激酶基因表达差异的比较.科学通报, 1999, 449 ( 10 ):
1055-1059.
[ 6] Xu H, Gu i JF, Hong Y. D ifferent ial express ion of vasa RNA and p ro-
tein during sperm atogenesis and oogenesis in the gib el carp (C aras-
siu s aura tu s gibelio) , a b isexuality and gynogenet ically reprodu cing
verteb rate. Dev Dyn, 2005, 233 ( 3) : 872-882.
[ 7] M ei J, C hen B, YueH, et a.l Iden t if icat ion of a C1q fam ily mem ber
associatedw ith cortical granu les and follicu lar cell apop tosis in Car-
assius aura tu s g ibe loi. M olC ellE ndocrino,l 2008, 289( 1-2) : 67-76.
[ 8] E sther L, G raham Y, Ju l ien B, et a.l Oogenesis in telelosts: how fish
eggs are foum ed. Gen Com p Endocrin o,l 2010, 165 ( 3) : 367-389.
[ 9] C lelland E, Kohl iG, C am pb ell RK, et a.l B one m orphogenetic p ro-
tein-15 in the zebrafish ovary: comp lem en tary deoxyribonu cleic acid
clon ing, genom ic organ ization, t issu e d istribut ion, and role in oocyte
m aturat ion. Endocrinology, 2006, 147( 1) : 201-209.
(责任编辑
李楠 )
(上接第 129页 )
[ 11 ] Barrett AJ, Raw lingsND, W oessner JF. H andbook of Proteolytic En-
zym es, vo.l II [ M ] . London: E lsevier A cadem ic Press, 2004:
1417-1447.
[ 12 ] H edstrom L, Perona, JJ, Ru tterWJ. Convert ing tryps in to chym otryp-
s in: res idue 172 is a sub strate specificity determ inan t. B iochem ist ry,
1994, 33( 29) : 8757-8763.
[ 13 ] BarrettA J, R aw lingsND, Woessn er JF, et a.l H andbook of Proteolytic
E nzym es[M ] . S an D iego, CA: A cadem ic Press, 1998: 30-38.
[ 14 ] Hud
ky P, Kaslik G, Ven ekei I, et a.l The d ifferen tial specificity of
chym otrypsin A and B is d eterm in ed by am in o acid 226. E ur J B io-
chem, 1999, 259 ( 1-2 ) : 528-533.
(责任编辑
李楠 )
133