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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):166-173
天然吩嗪类衍生物是一类对环境安全、对植
物病原真菌具有广谱抑菌活性的微生物源抗生物
质［1］。吩嗪类衍生物种类繁多，主要包括吩嗪-1-羧
酸（phenazine-1-carboxylic acid，PCA）、1-羟基-吩
收稿日期 ：2014-12-08
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31270084），国家“863”计划项目（2012AA022107）
作者简介 ：陈亚汶，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物代谢调控 ；E-mail ：moda_yaya@hotmail.com
通讯作者 ：张雪洪，男，博士，教授，研究方向 ：微生物代谢调控 ；E-mail ：xuehzhang@sjtu.edu.cn
绿针假单胞菌 HT66 中 luxR_19 对吩嗪-1-甲酰胺
合成的影响
陈亚汶  彭华松  王威  张雪洪
（上海交通大学生命科学技术学院 微生物代谢国家重点实验室，上海 200240）
摘 要 ： 旨在研究调控基因 luxR_19 对绿针假单胞菌 HT66 中的抑菌物质吩嗪 -1- 甲酰胺（phenazine-1-carboxamide，PCN）
合成及菌体生长的影响，通过分子操作构建了 luxR_19 基因敲除株、回补菌株、过表达菌株以及 luxR_19（G85A）点突变菌株，检
测了目标菌株生长曲线、PCN 发酵结果、细菌泳动性与从动性等。结果显示，将 luxR_19 敲除后 PCN 产量明显降低，对 luxR_19
基因进行过表达，发现能够将 PCN 产量提高 2 倍 ；luxR_19 对于吩嗪合成的多个调控基因以及合成基因表达均产生影响 ；luxR_19
的敲除对 HT66 的生长及泳动性不产生影响，而对细菌的从动性有一定的促进作用 ；luxR_19（G85A）点突变菌株吩嗪产量较野生
型相差很小。结果表明，luxR_19 对 PCN 的合成为正调控基因，一定程度上影响 HT66 的从动性，第 254 位碱基突变对 PCN 合成
产量不产生影响。
关键词 ： 绿针假单胞菌 ；HT66 ；吩嗪 -1- 甲酰胺 ；LuxR 家族转录调控因子
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.024
The Effects of luxR_19 on the Synthesis of Phenzaine-1-carboxamide in
Pseudomonas chlororaphis HT66
Chen Yawen Peng Huasong Wang Wei Zhang Xuehong
（State Key Laboratory of Microbial Metabolism，School of Life Sciences and Biotechnology，Shanghai Jiao Tong University，
Shanghai 200240）
Abstract ： In order to study the potential effects of regulator gene luxR_19 on the synthesis of antibacterial substance phenazine-1-
carboxamide（PCN）and physiological-biochemical characteristics in Pseudomonas chlororaphis HT66, strains of gene luxR_19-knockout,
-complementation, -overexpression and -point-mutation were constructed, and then the growth curve, fermentation production of PCN, swimming
and swarming activities were tested at the target strains. The results showed that the knockout of luxR_19 lowered the production of PCN and the
over-expression of gene luxR_19 increased the double production of PCN compared to the wild type ；luxR_19 gene affected the expression of
several genes relating to the regulation or synthesis of phenazines. Besides, the knockout of luxR_19 had no effects on the growth and swimming
activity, however, promoted the swarming activity of HT66. The production of PCN in point-mutation strain of luxR_19（G85A）was similar to
that in wild type. The above results indicated that luxR_19 was the positive regulator of PCN production, and could affect the swarming activity of
HT66. Besides, the point-mutation at 254th site in luxR_19 did not affect the production of PCN.
Key words ： Pseudomonas chlororaphis ；HT66 ；phenazine-1-carboxamide ；transcriptional regulator of LuxR family
2015,31(8) 167陈亚汶等：绿针假单胞菌HT66 中 luxR_19 对吩嗪-1-甲酰胺合成的影响
嗪（phenazine-1-hydroxy）、2-羟 基-吩 嗪（phenazine-
2-hydroxy，2-OH-PHZ）、吩嗪 -1-甲酰胺（phenazine-
1-carboxamide，PCN）等［2］。合成吩嗪类衍生物的微
生物主要是假单胞菌和链霉菌，绿针假单胞菌被公
认为是一种安全、有效的植物根际促生菌，除了良
好的抑菌作用，还能促进作物生长，目前仍然没有
关于其致病性的相关报道，可以认为其是一种环境
友好的促生菌［3-5］。据报道，许多绿针假单胞菌能
够分泌多种具有抑菌活性的次级代谢产物，例如 ：
吩嗪类衍生物、藤黄绿脓菌素、硝吡咯菌素、氢
氰酸以及杀虫蛋白 P. fluroscentinsect toxin D（FitD）
等［6，7］。其中，吩嗪类衍生物的分泌是其最为重要
的抑菌机制之一。在前期的研究报道中，已阐明了
绿针假单胞菌中吩嗪生物合成机理，发现了多个参
与吩嗪合成的调控因子，初步构建了吩嗪的合成调
控网络，这为利用微生物高效合成吩嗪类物质打下
了良好的基础。但吩嗪类物质的产量仍然较低，影
响了其作为生物农药的开发前景，因此，研发吩嗪
类物质的高产菌株十分迫切。
Pseudomonas chlororaphis HT66 是由本实验室从
上海郊区水稻根际分离所得。其除了保留绿针假单
胞菌的普遍性质外，更具有两大优点 ：一是其分泌
的吩嗪类衍生物几乎全为 PCN。据报道，在中性条
件下，PCN 的抑菌性远远高于 PCA，为 PCA 的 10
倍［4］，其他公开报道的绿针假单胞菌，如 GP72、
30-84 以及 O6 等菌株，都产生多个吩嗪类衍生物，
包括 PCA、2-OH-PHZ［5，8-10］，这使得吩嗪类化合物
的分离更为简便。二是在前期的实验中发现野生型
HT66 菌株，其 PCN 的产量高达 400 mg/L，高于目
前所报道的各假单胞菌野生型菌株的吩嗪产量，这
提供了将其作为构建 PCN 高产菌株的研发优势。
在实验室前期对 HT66 进行化学诱变的实验中，
通过多轮诱变最终得到 P3 株，其 PCN 产量达到了
1 597 mg/L，较同一批次发酵的野生型而言产量提
高了 3 倍［11］。经过全基因组测序，发现共有 244 个
碱基发生了突变，其中有 3 个 LuxR 家族转录调控
因子发生了突变。LuxR 家族转录调控因子多与次级
代谢产物调控相关［12］。在 HT66 野生株中，共有 24
个 luxR 家族调控因子，按照 3 个突变的 luxR 基因
在基因组中出现的先后顺序排列，分别是 luxR_13
（M217_04406）、luxR_14（M217_04413） 和 luxR_19
（M217_05833），其中 luxR_19 的第 254 个碱基由 G
突变为 C，导致第 85 位氨基酸由 Gly 突变为 Ala。
通过氨基酸序列分析发现，在第 85 位氨基酸前后
10-20 个氨基酸位点均高度保守，与其活性密切相
关。因此，luxR_19 这个基因是否与吩嗪的合成相
关，其第 85 位氨基酸的突变是否会对吩嗪合成调控
产生影响，是我们首先关心的问题。同时，菌体的
生长状况在一定程度上影响到次级代谢产物的合成，
luxR_19 是否会影响到菌株的生长状况，同样值得
关注。
本研究通过分子操作手段，对 luxR_19 基因进
行敲除，回补以及过表达，以研究 luxR_19 基因对
HT66 合成吩嗪能力的影响，进一步通过 luxR_19
（G85A）点突变菌株的构建，研究其对吩嗪合成的
影响，旨在为进一步了解 PCN 高产的调控机制，构
建高产 PCN 菌株打下良好的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 本研究中所用到的菌株，质粒
以及引物见表 1 和表 2。野生型绿针假单胞菌 HT66
作为构建突变菌株的出发菌株。pK18mobsacB 质粒
用于得到不包含目的片段的基因片段。质粒 pK18CL
用于敲除 luxR_19 基因。质粒 pK18CP 用于在野生
型 HT66 上获得点突变菌株。pME6032 质粒用于构
建回补以及过表达质粒。pME-luxR 分别用于在野生
型 HT66 中过表达 luxR_19 基因以及在 HT66 △ luxR
菌株中回补该基因。
1.1.2 培养基 Luria-Bertani（LB）培养基 ：10.0 g/L
胰蛋白胨，5.0 g/L 酵母提取物，10.0 g/L NaCl，固
体培养基加入 12.0 g/L 琼脂。E. coli 的培养温度为
37℃，P. chlororaphis 的培养温度为 28℃。
King’s Broth（KB）培养基 ：20.0 g /L 胰蛋白胨，
15.0 mL/L 甘油，0.514 g/L K2HPO4，0.732 g/L MgSO4，
固体培养基加入 12.0 g/L 琼脂，用于培养 P. chloror-
aphis，培养温度为 28℃。
抗生素浓度 ：对于 E. coli ：50 μg/mL kanamycin，
15 μg/mL tetracycline ；对于 P. chlororaphis ：50 μg/mL
kanamycin，125 μg/mL tetracycline 以及 100 μg/mL Am-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8168
表 1 本研究所用的菌株和质粒
材料 特征 来源
E. coli strains
DH5α supE44 ∆lacU169（f80 lacZ∆M15）recA hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA-1 Invitrogen
S17-1（λpir） res- pro mod+ integrated copy of RP4，mob+
P. chlororaphis strains
HT66 Wild-type，AmpR SpR This study
HT66CL Mutant of HT66 in the luxR_19 gene，AmpR SpR This study
HT66PM Point mutant of HT66 in the luxR_19 gene，AmpR SpR This study
HT66/pME HT66 containing pME6032，TetR This study
HT66/pME-luxR HT66 containing pME-luxR，TetR This study
HT66CL/pME HT66CL containing pME6032，TetR This study
HT66CL/pME-luxR HT66CL containing pME-luxR，TetR This study
Plasmids
pK18mobsacB Broad-host-range gene replacement vector ；sacB，KmR
pK18CL pK18mobsacB with Xba II- Hind III insert of 673 bp and 791 bp segments flanking M217_05833，KmR This study
pK18MP luxR gene from P3 in pK18mobsacB，KmR This study
pME6032 IPTG-inducible expression vector，GmR
pME-luxR M217_05833 coding sequence from GP72 in pME6032，GmR This study
表 2 本研究所用引物序列
名称 引物序列（5-3） 名称 引物序列（5-3）
LA GCTCTAGACAGTCGGCCGCTGTTTTTTCCATAC rpeA-R GATGCGCTTTTCGCAATAAC
LB GGATTCTGCCTTTTTCGGAGTGCCC rpoS-F TCAGTAAAGAAGTGCCGGAG
LC CTCCGAAAAAGGCAGAATCCCTGATGCCTGAA-
GCGGTCATAAG
rpoS-R AAGCGGAGTGTTTGGATTTG
LD CGCAAGCTTGGTACGGCAACCGAAGTAG rpoD-F AGAAAGAGATGGTCGAAGCC
LF ACGGAATTCATGCGCAACAGCAACCGGCC rpoD-R CATCAAACCGATGTTGCCTT
LR CGCTCGAGTCAGGCATTCTGCGCCTGGAG rsmE-F ACGACATCACGATCACCATT
gacA-F CGAGAATTGAAACCCGATGT rsmE-R TCAAGGTGTTTCGCGTTTG
gacA-R CTTCTTCACACACAGTGACG phzI-F AGCCATCTGGGAAATGACTC
gacS-F AAGAACTGCAACACAGCATC phzI-R GATCCCGACGATGGTATCTG
gacS-R GATTTCGTGGCTCATGTTGG phzR-F ATATCAGGCGGCTAACTACG
psrA-F CATGTCTTCCAGATAACGCC phzR-R ATAAGTTCGAGTCGTTGGCT
psrA-R GAACTGCTGGAAATCCTCGT phzE-F CAATCCATCAGCATCGAACG
rpeA-F GTTCATCGACAGCATTCTCG phzE-R CAGCAGATGGCGAAAGAAC
注 ：下划线分别 Xba I、Hind III、EcoR I、Xho I 酶切位点
picillin。
泳动性（Swimming）实验培养基 ：10.0 g/L 胰蛋
白胨，5.0 g/L NaCl 以及 3.0 g/L 琼脂糖。
从动性（Swarming）实验培养基：5.0 g/L 葡萄糖，
10.0 g/L 胰蛋白胨，5.0 g/L 酵母提取物和 5.0 g/L 琼脂。
1.2 方法
1.2.1 luxR_19 无 痕 敲 除 菌 株 HT66CL 的 构 建 设
计两对引物 LA（Xba I）-LB，LC-LD（Hind III）用
于对 luxR_19 基因的敲除。利用 LA-LB 从 HT66 基
因 组 上 扩 增 M217_05833 基 因 上 游 673 bp， 利 用
LC-LD 从 HT66 基因组上扩增 luxR_19 基因下游 791
bp。利用 LB 与 LC 之间 20 bp 的同源片段，通过融
合 PCR 将两段基因片段连接在一起。利用限制性内
切酶 Xba I 和 Hind III 对获得的 1.5 kb 的融合片段进
行酶切，将所获得的片段克隆至 pK18mobsacB 质粒
中。所获得的质粒 pK18CL 首先被转入 E. coli S17-1
（λpir）， 之 后 通 过 接 合 转 移 至 P. chlororaphis HT66
中，获得 HT66C1 菌株。将 HT66C1 菌株涂布于含有
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100 μg/mL Ampicillin（Amp） 和 50 μg/mL kanamycin
（Kan）的 LB 平板上以筛选出单交换菌株，之后挑
选单菌落涂布于含有 15% 蔗糖的 LB 平板上以获得
双交换菌株。获得的菌株分别点种于含有 50 μg/mL
Kan 的 LB 平板和无抗 LB 平板上，挑选在 Kan 50 平
板上不生长，在无抗 LB 平板上生长的菌株，利用
PCR 以及测序进行验证，最终得到无痕敲除 luxR_19
的菌株 HT66CL。
1.2.2 luxR_19 基 因 回 补 与 过 表 达 利 用 引 物 LF
（EcoR I）-LR（Xho I）从野生型 HT66 基因组中通
过 PCR 扩增 luxR_19 基因，总长度为 861 bp。利用
限制性内切酶 EcoR I 和 Xho I 同时对扩增片段以及
质粒 pME6032 进行酶切，连接得到 pME-luxR 质粒。
将 pME-luxR 质粒分别电击转化至△ luxR 以及 HT66
野生株中，得到回补以及过表达菌株。
1.2.3 点突变菌株 HT66PM 的构建 利用引物 LF
（EcoR I）-LR（Xho I）从诱变高产株 P3 基因组中利
用 PCR 扩增出长达 861 bp 的基因片段，通过酶切连
接获得 pK18CP 质粒。剩余操作同 1.2.2，最后通过测
序筛选得到 luxR_19（G85A）点突变菌株 HT66PM。
1.2.4 生长曲线的测定 挑取单菌落接种到 5 mL
LB 液体培养基中，28℃，180 r/min 过夜培养。利
用分光光度计进行检测，检测波长为 600 nm。将
细菌悬浮液接种于 60 mL KB 培养基中，确保初始
OD600=0.01，28℃，180 r/min 培养。每株菌 3 个平行。
1.2.5 PCN 产量的检测 用 6 mol/L 的 HCl 将发酵液
调至 pH2.0，加入 9 倍体积的乙酸乙酯，充分振荡混
匀，6 000 r/min 离心 5 min 分层，PCN 转移至有机相
中。取上层萃取液于通风橱中，使有机溶剂挥发干
净。取适量乙腈溶解萃取物，HPLC 检测发酵液中
PCN 产量。检测条件 ：流动相为乙腈 -25 mmol/L 乙
酸铵，色谱柱为 WondaSil C18-WR 反相柱（5 μm ；
4.6×250 mm，Shimadzu，Japan），检测波长 254 nm，
检测条件 ：0-2 min，8% 乙腈 -92% 25 mmol/L 乙酸
铵，2-20 min，乙腈浓度从 8% 升至 60%，乙酸铵
浓度从 92% 下降至 40%，20-21 min，8% 乙腈 -92%
25 mmol/L 乙酸铵。柱温 30℃，流速 1.0 mL/min。
1.2.6 泳 动 性（Swimming） 和 从 动 性（Swarming）
的检测 挑取单菌落接种于 LB 液体培养基中 28℃，
180 r/min 过夜培养。将细菌悬浮液稀释至 OD600=0.1，
取 2 μL 添加于置于平板中央的无菌滤纸片。28℃培
养 24 h。
1.2.7 qRT-PCR 实验 由上海桑尼生物科技有限
公司完成，所用引物如表格 3 所示。内参基因为
16S rRNA，以 ΔΔCt 值的方法分析基因的相对表达
量。分别检测了 HT66 以及 HT66CL 两株菌的 rpeA、
phzR、phzI、phzE、rpoS、rpoD、psrA、gacA、gacS
以及 rsmE 基因的相对表达量变化情况。
2 结果
2.1 HT66菌株中luxR_19基因的比对
将 luxR_19 基因与 NCBI 数据库中的序列比对，
结果（表 3 和图 1）显示，luxR_19 基因为转录调控
因子，属于 LuxR 家族。比对还表明 luxR_19 基因与
Pseudomonas protegens CHA0、Pseudomonas sp. UW4、
Pseudomonas fluorescens Pf0-1 三 株 菌 的 luxR 序 列 相
似度较高，在核苷酸水平达到了 80% 以上，而与
Pseudomonas putida KT2440 和 Burkholderia cenocepa-
cia J2315 相比，相似度仅为 69%。进一步的氨基酸
序列分析结果显示，在第 85 位氨基酸前后的 10-20
个氨基酸序列均具有很高的同源性，高度保守，属
于 LuxR_19 的活性区域。
表 3 luxR_19 基因相似性比对
菌株 相似性 /%
P. protegens CHA0 81
P. sp. UW4 82
P. fluorescens Pf0-1 80
P. sputida KT2440 69
B. cenocepacia J2315 69
图 1 LuxR_19 蛋白序列第 74-107 位氨基酸多序列比对图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8170
2.2 重组菌株HT66CL、HT66PM以及HT66/pME-
luxR和HT66CL/pME-luxR的构建
成功构建了 pK18CL 与 pK18PM 质粒，利用热
激转化导入 S17 菌株中，之后再通过接合转移导入
HT66 野生型中，经过两轮同源重组，最终提取基因
组，PCR 扩增后送上海华大基因公司测序，结果表
明成功构建了重组菌株 HT66CL 和 HT66PM。
构建 pME-luxR 质粒，利用电击转化分别导入
HT66 以及 HT66CL 菌株中，从含有四环素抗性的平
板上挑取单克隆，提取质粒进行 PCR，PCR 扩增结
果经测序表明 HT66/pME-luxR 和 HT66CL/pME-luxR
构建成功。
2.3 luxR_19基因敲除株HT66CL的生长影响
以 HT66 野生株为对照，同时测定 luxR_19 基
因敲除株 HT66CL 与 HT66WT 生长曲线，在 28℃，
180 r/min 的条件下检测 48 h。结果（图 2）显示，
HT66CL 与 HT66 的 生 长 情 况 十 分 相 似，6 h 以 前
处 于 适 应 期， 约 6 h 进 入 对 数 期， 到 24 h 以 后，
HT66CL 与 HT66 均 进 入 稳 定 期。 由 此 可 以 推 断，
luxR_19 基因的敲除对于 HT66 菌体生长情况而言，
无较大影响。
0
0 10 20 30ᰦ䰤/h 40 50246OD 600 81012
14 HT66
HT66CL
图 2 HT66 与 HT66CL 生长曲线测定
对 HT66 的泳动能力产生较大影响，可能是由于其
基因本身与控制泳动能力相关的基因无太多作用 ；
luxR_19 基因的敲除导致 HT66 从动能力的增加，说
明其在一定程度上能够影响或者控制 HT66 的从动
能力。
A B
C D
A ：HT66 生长 24 h 泳动性记录 ；B ：HT66CL 生长 24 h 泳动性记录 ；
C ：HT66 生长 24 h 从动性记录 ；D ：HT66CL 生长 24 h 从动性记录
图 3 HT66 与 HT66CL 的泳动性及从动性
700
600
500
400
300
200PC
N
ӗ䟿/mg·L-1 
100
0
HT66 HT66CL HT66
PM
HT66/
pME㧼Ṛ HT66/pME-luxR HT66CL/pME HT66CL/pME-luxR
图 4 各菌株发酵 24 h 后的 PCN 产量
同时，考察了 HT66CL 菌株的泳动性（Swimm-
ing）以及从动性（Swarming）变化。28℃条件下培
养 24 h，拍照记录菌落大小与形态。Swimming 实验
结果（图 3-A 和图 3-B）显示，HT66 与 HT66CL 菌
株边缘均呈现锯齿状，菌落大小相近，无明显差异。
Swarming 实验结果（图 3-C 和 3-D）表明，HT66 与
HT66CL 边缘不规则且界限模糊，HT66CL 形成的
生长圈大小明显大于 HT66。luxR_19 基因的敲除未
2.4 luxR_19基因对PCN产量的影响
将 HT66、HT66CL 以及 HT66PM 菌株发酵至 36
h，萃取发酵液，利用 HPLC 检测 PCN 产量。结果
（图 4）显示，野生型 HT66 菌株发酵至 24 h，PCN
产量为 402.8 mg/L 和 473.5 mg/L。HT66CL 发酵至 24
2015,31(8) 171陈亚汶等：绿针假单胞菌HT66 中 luxR_19 对吩嗪-1-甲酰胺合成的影响
h，PCN 产量为 153.7 mg/L 和 198.9 mg/L。就 PCN 的
产量而言，HT66CL 比 HT66 下降了约 50%。反观
HT66PM，24 h 的 PCN 产量为 387.3 mg/L，整体而言
虽然比 HT66 略有下降，但是下降幅度不明显，点
突变后无明显变化。
将 HT66、HT66/pME、HT66/pME - luxR、
HT66CL、HT66CL/pME 以及 HT66CL/pME-luxR 菌株
接种于大瓶 KB 培养基中发酵，培养至 OD600=0.1，
添加终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG，发酵至 24 h，萃
取发酵液，利用 HPLC 检测 PCN 产量，结果如图 4
所 示。 首 先 是 luxR_19 的 回 补 ：HT66CL/pME-luxR
在 24 h PCN 产量为 475.3 mg/L，与 HT66CL 的 153.4
mg/L 相比有明显回升 ；较 HT66 的 405.2 mg/L 略高，
说明通过 luxR_19 基因的回补，其产吩嗪能力回复
到野生型 ；同时，HT66CL/pME-luxR 的吩嗪产量明
显高于 HT66/pME 的 203.5 mg/L，是 HT66/pME 的 2
倍 ；一般来说，由于 pME6032 质粒较大，可能对菌
株的生长带来一定影响，HT66CL/pME 的 PCN 产量
最低，仅有 103.5 mg/L。然后是 luxR_19 基因的过表
达，HT66/pME-luxR 的 PCN 产量达到了 623.7 mg/L，
较 HT66 提高了约 50%，较 HT66/pME 提高了 2 倍。
2.5 利用qRT-PCR检测相关基因表达水平
根据之前研究和文献报道，选取了参与吩嗪
合成和调控吩嗪合成的重要基因，包括双元调控基
因 gacS/gacA， 全 局 性 调 控 基 因 rpeA、psrA、rsmE、
rpoS，群体感应调控基因 phzI/phzR，吩嗪合成必需
基因 phzE 等进行 qRT-PCR 实验，以研究 luxR_19 基
因的敲除对其产生的影响。以 HT66 野生型为参照
对象，基因表达量的变化如表 4 所示。
表 4 HT66 菌株及其基因敲除株中基因表达量变化
基因 HT66CL 中表达量变化 基因功能
gacA 0.593 Response regulator
gacS 1.170 Sensor protein
psrA 0.759 Pseudomonas sigma regulator
rpeA 1.894 Sensor kinase
rpoS 1.020 Sigma factor
rpoD 0.728 Sigma factor
rsmE 0.367 16S rRNA methyltransferase
phzI 0.822 Autoinducer synthase
phzR 0.739 Transcriptional activator protein
phzE 0.901 Phenazine biosynthesis protein
表 4 显示，在 HT66CL 菌株中，直接参与吩嗪
合成的基因 phzI/phzR 以及 phzE 基因，其表达水平
都有一定的降低，其中 phzI 为野生型的 0.822，phzR
为野生型的 0.739，phzE 的表达量较 phzI 与 phzR 而
言下降的较少，为野生型的 0.901 倍。这一结果与
发酵结果，即 PCN 产量有一定下降所一致，从分子
层面给上验证了 luxR_19 基因的敲除会导致吩嗪合
成的降低。
从相关调控基因而言，HT66CL 菌株的 gacA 的
表达量显著降低，仅为野生型的 0.593 倍 ；而 gacS
的表达量基本维持在稳定的水平，为野生型的 1.170
倍。rpeA 的表达量显著升高，为野生型的 1.894 倍，
根据目前报道，rpeA 能够在一定程度上抑制吩嗪类
产物的合成［13］，与本结果一致。对于两个 sigma 因
子而言，rpoS 的表达量保持稳定，rpoD 有一定的下
降，均与本研究的发酵结果一致。luxR_19 基因的敲
除导致 rsmE 与 psrA 基因表达量下降，分别为野生
型的 0.367 与 0.759，但根据相关文献，这两个基因
均属于负调控基因。结果表明 luxR_19 能够影响多
个基因的表达，应属于全局性调控基因。
3 讨论
根际促生菌株 P. chlororaphis HT66 是一株高产
PCN 的菌株，以 HT66 作为出发菌株，通过前期的
菌种诱变，我们得到了 PCN 高产菌株 P3，基于对突
变株的全基因组比较分析，发现 luxR_19 发生了点
突变。通过基因序列的比对，我们发现 luxR_19 在
假单胞菌中具有较高同源性，进一步分析氨基酸序
列，发现第 85 位氨基酸序列附近的氨基酸序列高度
保守，处于 luxR_19 的活性区域。于是我们通过一
系列的分子操作研究了 luxR_19 基因对其生长及吩
嗪产量方面的影响。同时，利用点突变株 HT66PM
验证第 85 位氨基酸的改变对吩嗪产量的可能影响。
由于次级代谢产物的合成在很大程度上会受到
菌株生长情况的影响，LuxR 家族调控因子对于菌体
生长的调控是多方面的，如通过控制群体感应，调
节生物的从动能力以增加生物的环境适应性，如
ppoR，通过调控相关代谢产物的合成以增加其环境
竞争力等［14］。因此在将 luxR_19 基因敲除后，我们
首先对其进行了生理生化能力的检测，包括测定生
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8172
长曲线，菌体泳动性以及群体从动性 3 个指标。结
果表明 luxR_19 基因的敲除不影响菌体的生长状况，
但是会在一定程度上影响其群体从动性。在后期的
工作中，可以尝试通过对该基因进行突变，从而达
到增加群体从动性，确保菌株能够在自然环境中更
有竞争力地定植于植物根部，从而促进合成 PCN，
更好地进行根际促生作用。
luxR_19 基 因 敲 除 后，PCN 产 量 有 一 定 下 降，
在对其进行回补后，产量回到了正常水平，将该基
因进行过表达后，产量较野生菌株有很大的提升。
说明该基因确实对 PCN 的产量有一定影响，且对于
PCN 的合成起正调控作用。通过 qRT-PCR 实验，我
们检测了与 PCN 合成相关基因的表达水平，发现
luxR_19 基因的缺失直接导致 gacA 基因表达量明显
降低，rpeA 负调控因子表达量上升，并在一定程度
上导致 phz 基因簇的表达情况。据此推测 luxR_19 对
于 PCN 合成的调控作用可能是通过 Gac 系统来进行
的，但具体的调控机制还有待进一步的研究。
通过点突变菌株的构建发现，该位点的点突变
与 P3 菌株的高产无直接联系，也说明化学诱变株高
产原因的复杂性。但无论是通过本实验或是相关报
道，我们都能发现 LuxR 家族转录调控因子确实都
参与到次级代谢产物的调控中。后期工作将继续分
析鉴定 P3 菌株高产的影响位点，阐明 P3 菌株高产
PCN 的机制。
虽然 HT66/pME-luxR 较 HT66 而言，吩嗪产量
仅仅提高了 50%，但我们认为这是由于实验所选用
的载体 pME6032 质粒较大，其本身会对菌体的生长
带来一定影响。对比 HT66/pME-luxR 与 HT66/pME
两株菌的吩嗪产量，可以发现前者是后者的两倍，
这足以展现 luxR_19 这一基因在提升吩嗪产量上的
潜在能力。
在后续的实验中，我们可以通过以下两个方面
来提升 luxR_19 在促进吩嗪生成方面的作用 ：选用
拷贝数更加高的载体，减小对细菌生长的影响 ；对
该基因作逐步的片段分析，发现其作用位点，从而
直接在基因组上进行修饰，解除对载体的依赖，构
建吩嗪高产菌株。同时，我们将对诱变株的高产原
因作继续研究，揭示其高产机理。
4 结论
在 Pseudomonas chlororaphisHT66 菌株中 ：luxR_
19 对 PCN 的 合 成 是 正 调 控 因 子 ；luxR_19 对 细 菌
从动性有一定影响，而对菌体生长及泳动性无较
大影响 ；诱变高产株 P3 的 PCN 产量提高不是由于
luxR_19 的碱基点突变造成。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）