全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４５(３): ３０７￣３１６(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０６￣３０ꎻ 修回日期: ２０１５￣０１￣１２
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(３１２０１５５５)ꎻ 江苏省自主创新基金项目[ＣＸ(１３)５０２７]
通讯作者: 刘邮洲ꎬ副研究员ꎬ主要从事园艺作物病害生物防治研究ꎻＴｅｌ:０２５￣８４３９０２２８ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｓｈｉｔｏｕｒｅｎ８８８８８＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０３.０１０
绿针假单胞菌 ＹＬ￣１抗细菌活性相关基因的克隆和分析
刘邮洲１ꎬ ２∗ꎬ Ｓｈｉ￣Ｅｎ Ｌｕ２ꎬ Ｓｏｎｙａ Ｍ. Ｂａｉｒｄ２ꎬ 乔俊卿１ꎬ 杜 艳１
( １江苏省农业科学院植物保护研究所ꎬ南京 ２１００１４ꎻ ２ 美国密西西比州立大学植物病理系ꎬ密西西比州 ３９７５９)
摘要:绿针假单胞菌 ＹＬ￣１对植物多种重要病原细菌和病原真菌有较强的抑制作用ꎮ 采用转座子插入突变技术电转化绿针
假单胞菌 ＹＬ￣１ꎬ构建随机插入突变体库ꎮ 通过平板抑菌试验从突变体库中筛选对 ３ 种病原细菌荚壳伯克霍尔德菌
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ、解淀粉欧文氏菌 Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ和胡萝卜果胶杆菌 Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ抑菌效果显著下降的
突变体ꎬ并采用 ＰＣＲ和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ验证转座子是否成功插入到 ＹＬ￣１染色体基因组上ꎮ 利用质粒拯救技术克隆转座子
插入位点基因、测序和生物信息学分析ꎮ 结果表明:本研究成功构建了绿针假单胞菌 ＹＬ￣１随机插入突变体库ꎬ筛选出 ７株
对 ３种病原细菌抑制效果明显下降的突变体ꎬ但其对立枯丝核菌的抑制效果与野生型菌株 ＹＬ￣１相同ꎻＰＣＲ和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ
试验结果表明绿针假单胞菌 ＹＬ￣１的 ７株突变体均是单拷贝ꎻ克隆到 ７个突变体插入位点的基因序列并测序ꎬ生物信息学
分析结果表明其中 ６个突变位点是嗜铁素合成基因簇ꎬ１个突变位点是蛋白分泌基因 ｓｅｃＹꎮ
关键词:绿针假单胞菌 ＹＬ￣１ꎻ 突变株ꎻ 抗细菌活性ꎻ 质粒拯救ꎻ 克隆
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ ＹＬ￣１ ｄｅｄｉｃａｔｅｄ ｔｏ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ
ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓ ＬＩＵ Ｙｏｕ￣ｚｈｏｕ１ꎬ ２ꎬ ＳＨＩ￣Ｅｎ Ｌｕ２ꎬ ＳＯＮＹＡ Ｍ.
Ｂａｉｒｄ２ꎬ ＱＩＡＯ Ｊｕｎ￣ｑｉｎｇ１ꎬ ＤＵ Ｙａｎ１ ( １ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｊｉａｎｇｓｕ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ
２１００１４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｓｔａｒｋｖｉｌｌｅꎬ Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ ３９７５９ꎬ ＵＳＡ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｓｔｒａｉｎ ＹＬ￣１ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｙｂｅａｎ ｒｏｏｔ ｔｉｐｓ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｏ ｂｅ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ. Ｔｈｉｓ
ｓｔｒａｉｎ ｓｈｏｗｅｄ ｂｒｏａｄ￣ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｃｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｎ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ. Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｄｅｄｉｃａｔｅｄ ｔｏ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｓꎬ ａ Ｔｎ５￣ｍｕｔａｔｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ＹＬ￣１ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ. Ｐｌａｔｅ ｂｉｏａｓｓａｙｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｓｅｖｅｎ ｍｕｔａｎｔｓ
ＭＴ１￣７ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｈｅｉｒ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅꎬ Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ ａｎｄ Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ｗｈｉｌｅ ｒｅｍａｉｎｅｄ ｓｔｅａｄｙ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ
ｓｏｌａｎｉ. Ａｌｌ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔｓ ＭＴ１￣７ ｗｅｒｅ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ
ＹＬ￣１ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｃｏｐｙ. Ｓｅｖｅｎ ｇｅｎｅｓ ａｒｏｕｎｄ ｔｈｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｓｃｕｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｓ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＥＺ￣Ｔｎ５ ｋｉｔ. Ｔｈｅ
ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｓｉｘ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｐｙｏｖｅｒｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｓｅｃＹ ｇｅｎｅ
ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｅｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ ＹＬ￣１ꎻ ｍｕｔａｎｔꎻ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓꎻ ｒｅｓｃｕｅ ｐｌａｓｍｉｄꎻ ｃｌｏｎｉｎｇ
中图分类号: Ｓ４３２.４４ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０３０７￣０３１６(２０１５)０３￣０３０７￣１０
假单胞菌 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ.是活跃在植物根
际和叶面的一类微生物ꎬ属内许多菌株属于植物根
围促生细菌 ( Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ￣Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅ￣
ｒｉａꎬＰＧＰＲ)类ꎬ能防治植物病害、促进植株生长[１]ꎮ
植物病理学报 ４５卷
这些具有生防促生作用的菌株尤以荧光性假单胞
菌 Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ.为主ꎬ包括铜绿假
单胞菌 Ｐ. ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、致金色假单胞菌 Ｐ. ａｕｒｅｏｆａ￣
ｃｉｅｎｓ、荧光假单胞菌 Ｐ. ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ 和绿针假单胞
菌 Ｐ. ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ等[２]ꎮ
绿针假单胞菌 Ｐ. ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ对多种植物有控
病促生作用[３]ꎬ能增强植物抗逆性[４~５]、对环境友
好、对生物无致病性[６]ꎮ 其中ꎬ有的菌株已成功开发
为商用生防产品ꎬ如瑞士 ＢｉｏＡｇｒｉ ＡＢ公司研制的基
于绿针假单胞菌的生防药剂 Ｃｅｄｏｍｏｎꎬ主要用于大
麦和燕麦种子处理ꎬ可防治苗期多种真菌病害[７]ꎮ
目前ꎬ国际上研究报道较多的是利用绿针假单胞菌
防治真菌和卵菌病害ꎮ 如ꎬ防治番茄枯萎病[８~９]、烟
草疫霉病[１０]、辣椒疫霉病[１１~１２]、油菜菌核病[１３]、柏
树溃疡病[３]和豆类炭疽病[１４]等ꎮ 然而ꎬ关于绿针假
单胞菌对细菌病害的防治国际上未见相关报道ꎮ
绿针假单胞菌 ＹＬ￣１ 是本实验室从大豆根围
分离获得的一株细菌ꎬ室内抑菌试验结果表明:该
菌株对多种农业重要病原真菌和卵菌(尖孢镰刀
菌 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、辣椒疫霉病菌 Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏ￣
ｒａ ｃａｐｓｉｃｉ、立枯丝核菌 Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、核盘菌
Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍｉ)菌丝生长具有很强的抑制
作用ꎻ进一步研究发现绿针假单胞菌 ＹＬ￣１对参试
的几种农业重要病原细菌 (荚壳伯克霍尔德菌
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ、解淀粉欧文氏菌 Ｅｒｗｉｎｉａ
ａｍｙｌｏｖｏｒａ、密执安棒杆菌 Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｓｉｓ、
胡萝卜果胶杆菌 Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、丁香
假单胞菌 Ｐ.ｓｙｒｉｎｇａｅ、野油菜黄单胞菌Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ)均具有明显的抑制作用ꎬ这个特性区别
于目前已报道的同种内其他菌株ꎮ
本研究采用转座子突变技术建立随机突变体
文库ꎬ进而筛选绿针假单胞菌 ＹＬ￣１抑制细菌能力
明显下降或丧失的突变菌株ꎬ采用质粒拯救
( ｒｅｓｃｕｅ ｐｌａｓｍｉｄ)等方法ꎬ克隆绿针假单胞菌 ＹＬ￣１
抗细菌活性的相关基因并进行分析ꎮ 研究结果能
挖掘绿针假单胞菌的抗细菌病害能力ꎬ开发相关抗
细菌病害生物农药ꎬ提升该菌的生防应用前景ꎻ同
时对于遗传改良绿针假单胞菌ꎬ解析该菌对细菌病
害的生防机理提供理论依据ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 材料
供试菌株绿针假单胞菌 Ｐ. ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓＹＬ￣１ꎬ
是本实验室从大豆根围分离获得的对多种病原真
菌和细菌均具有较强抑菌活性的菌株ꎮ 立枯丝核
菌 Ｒ. ｓｏｌａｎｉ 由本实验室保存ꎮ 荚壳伯克霍尔德菌
Ｂ. ｇｌｕｍａｅ、解淀粉欧文氏菌 Ｅ. ａｍｙｌｏｖｏｒａ、胡萝卜
果胶杆菌 Ｐ. ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ由本实验室保存ꎮ
病原真菌用 ＰＤＡ 培养基(马铃薯 ２００ ｇ、葡萄
糖 ２０ ｇ、琼脂 ２０ ｇ、蒸馏水 １ ０００ ｍＬ)培养ꎮ 绿针
假单胞菌 ＹＬ￣１、病原细菌和大肠杆菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ) ＥＣ１００Ｄ ｐｉｒ＋(表 １)用 ＬＢ培养基(蛋白胨 １０
ｇ、酵母粉 ５ ｇ、ＮａＣｌ １０ ｇ、琼脂 ２０ ｇ、蒸馏水 １ ０００
ｍＬ)培养ꎮ 假单胞菌感受态细胞电转化后复苏用
ＳＯＣ液体培养基(胰蛋白胨 ２０ ｇ、酵母粉 ５ ｇ、ＮａＣｌ
０. ５ ｇ、 ２. ５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＫＣｌ、 １０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭｇＣｌ２、 ２０
ｍｍｏｌ / Ｌ 葡萄糖、蒸馏水 １ ０００ ｍＬ)ꎮ 绿针假单胞
菌 ＹＬ￣１ 及突变菌株产荧光色素测试用金氏 Ｂ 培
养基[１５](蛋白胨 ２０ ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ １.５ ｇ、ＭｇＳＯ４ １.５ ｇ、
ｐＨ值 ７.２±０.２、琼脂 ２０ ｇ、蒸馏水 １ ０００ ｍＬ)ꎮ
主要试剂和仪器:ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、限制性内切
酶、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、细菌基因组
ＤＮＡ 提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自美国
Ｐｒｏｍｅｇａ公司ꎻ卡那霉素 ( Ｋａｎａｍｙｃｉｎ )、四环素
(Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ)等购自美国 Ｓｉｇｍａ 公司ꎻ ＥＺ￣Ｔｎ５
<Ｒ６Ｋgｏｒｉ / ＫＡＮ￣２>转座子试剂盒购自美国 Ｅｐｉｃｅｎ￣
ｔｒｅ公司ꎻＤＩＧ试剂盒购自 Ｒｏｃｈｅ 公司ꎻＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａ￣
ｔｏｒ ２５１０电转化仪购自德国 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 公司ꎮ 引物
合成和基因测序由美国 Ｅｕｒｏｆｉｎｓ公司完成ꎮ
１.２ 对病原真菌和病原细菌室内拮抗能力测试
挑取绿针假单胞菌 ＹＬ￣１和 ３ 种病原细菌(荚
壳伯克霍尔德菌 Ｂ. ｇｌｕｍａｅ、解淀粉欧文氏菌
Ｅ. ａｍｙｌｏｖｏｒａ和胡萝卜果胶杆菌 Ｐ. ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ)单
菌落接种到 ５ ｍＬ ＬＢ 液体培养基中ꎬ２８℃ꎬ２００ ｒ /
ｍｉｎ过夜培养ꎬ１０℃ꎬ１０ ０００×ｇ 离心 １０ ｍｉｎ 后用无
菌水稀释至菌含量达 ２×１０８ ＣＦＵ / ｍＬꎮ
在 ＬＢ 平板中央滴绿针假单胞菌 ＹＬ￣１ 菌液
５ μＬꎬ菌含量 ２×１０８ ＣＦＵ / ｍＬꎬ２８℃培养 ４８ ｈ 后ꎬ
用各病原细菌稀释液瞬间喷雾ꎬ２８℃恒温培养过
夜ꎮ 每处理重复 ３ 皿ꎮ 设清水对照ꎮ 待对照平板
病原细菌长满平板时ꎬ测定抑菌圈直径ꎮ
病原真菌 Ｒ. ｓｏｌａｎｉ 在 ＰＤＡ 平板上长满平板
后ꎬ沿菌落边缘用孔径为 ５ ｍｍ 的灭菌打孔器打
孔 ꎮ将病原真菌菌饼置于直径９０ｍｍ空白ＰＤＡ
８０３
３期 刘邮洲ꎬ等:绿针假单胞菌 ＹＬ￣１抗细菌活性相关基因的克隆和分析
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｔｒａｉｎｓꎬ ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｉｔｅｍｓ Ｒｅｌｅｖａｎｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ∗ Ｓｏｕｒｃｅ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＴｒａｎｓｆｏｒＭａｘ
ＥＣ１００Ｄ ｐｉｒ＋
Ｆ￣ ｍｃｒＡΔ(ｍｒｒ￣ｈｓｄＲＭＳ￣ｍｃｒＢＣ) φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１
ａｒａＤ１３９Δ(ａｒａꎬ ｌｅｕ)７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ λ￣ ｒｐｓＬ (ＳｔｒＲ) ｎｕｐＧ ｐｉｒ＋(ＤＨＦＲ)
Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ.
ＹＬ￣１ Ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＭＴ１￣７ Ｔｎ５ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ＹＬ￣１ꎻ Ｋｍｒ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｐｌａｓｍｉｄｓ
ｐＵＣＰ２６ Ｂｒｏａｄ￣ｈｏｓｔ￣ｒａｎｇｅ ｖｅｃｔｏｒꎻ Ｔｃｒ Ｌｕꎬ ｅｔ ａｌ. (２００２)
Ｐｒｉｍｅｒｓ
Ｔｎ ＦＰ ５′￣ＧＣＡＡＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＣＡＡＴＣＴ￣３′ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｔｎ ＲＰ ５′￣ＡＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＣＣＧＣＣＧＴＣ￣３′ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＫＡＮ￣２ ＦＰ￣１ ５′￣ＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＴＣＡＴＣＡＡＣＣ￣３′ Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｒ６ＫＡＮ￣２ ＲＰ￣１ ５′￣ＣＴＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴ￣３′ Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
∗ Ｋｍｒꎬ Ｔｃｒꎬ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｋａｎａｍｙｃｉｎꎬ ａｎｄ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
平板上ꎬ菌饼中心距平板边缘 ３０ ｍｍꎬ另一侧离平
板边缘 ３０ ｍｍ 处滴绿针假单胞菌 ＹＬ￣１ 菌液 ５
μＬꎬ菌含量 ２×１０８ ＣＦＵ / ｍＬꎬ２８℃恒温培养ꎮ 每处
理重复 ３ 皿ꎮ 设清水对照ꎮ 待对照平板病原真菌
长满时ꎬ测量 ＹＬ￣１ 处理的病原菌菌落生长带宽ꎬ
计算抑制率ꎮ 病原真菌抑制率(％)＝ (对照病原菌
菌丝带宽￣处理病原菌菌丝带宽) /对照病原菌菌丝
带宽×１００ꎮ
１.３ 绿针假单胞菌 ＹＬ￣１ 随机插入突变体库的
构建
绿针假单胞菌 ＹＬ￣１ 感受态细胞的制备参照
文献[１６] (Ｃｏｒｎｉｓｈ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９８ )的方法ꎮ 利用大
肠杆菌￣假单胞菌穿梭载体 ｐＵＣＰ２６(２５ μｇ / ｍＬ 的
四环素抗性)检测菌株 ＹＬ￣１感受态细胞的转化效
率ꎮ 将 ５０ μＬ 绿针假单胞菌 ＹＬ￣１ 感受态细胞加
入 ２ μＬ 浓度为 ２５ ｍｇ / ｍＬ 的 ｐＵＣＰ２６ 质粒ꎬ混合
后转入 ０.２ ｃｍ的提前预冷的电击杯中ꎮ 调节电压
２.５ ＫＶꎬ将电击杯放入电转化仪ꎬ电击 ２ ｓ 后ꎬ迅速
转入 ５ ｍＬ 的 ＳＯＣ 液体培养基试管中ꎬ２８℃ꎬ２００
ｒ / ｍｉｎ复苏 ４ ｈꎮ 转化产物取 １００ μＬ 涂布于含有
２５ μｇ / ｍＬ四环素抗性的 ＬＢ 平板ꎬ２８℃培养２４ ｈꎬ
挑取转化子并计算转化效率ꎮ 转化效率 ＝产生菌
落的总数×稀释倍数 /质粒 ＤＮＡ的总量ꎮ
采用上述同样条件ꎬ每 ５０ μＬ 绿针假单胞菌
ＹＬ￣１感受态细胞中加入 ２ μＬ 的 ＥＺ￣Ｔｎ５ <Ｒ６Ｋ
gｏｒｉ / ＫＡＮ￣２>质粒ꎬ电转化后复苏ꎬ转化产物取 １００
μＬ涂布于含有 １００ μｇ / ｍＬ 卡那霉素抗性的 ＬＢ
平板ꎬ２８℃培养 ２４ ｈꎬ挑取转化子ꎮ 重复 ３次ꎮ
１.４ 突变株的筛选
从转化平板上用灭菌牙签挑取单菌落ꎬ移入
５ ｍＬ ＬＢ培养液中ꎬ２８ ℃ꎬ２００ ｒ / ｍｉｎ 过夜培养后ꎬ
测试其对病原细菌的拮抗能力ꎬ试验方法见 １.２ꎮ
２８℃恒温培养ꎬ待清水对照平板病原细菌长满时ꎬ
挑选出与野生型菌株 ＹＬ￣１ 的抑菌圈对比抑菌效
果明显下降的分离物ꎮ 单菌落纯化后ꎬ－７０ ℃甘油
保存ꎮ 测试突变株对病原真菌 Ｒ. ｓｏｌａｎｉ 的拮抗能
力ꎬ试验方法见 １.２ꎮ
１.５ 随机插入突变株的 ＰＣＲ 验证和 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
杂交验证
将 １.４抑菌试验中筛选的 ７株突变体分别接种
于含 １００ μｇ / ｍＬ 卡那霉素的 ＬＢ 液体培养基中ꎬ
２８℃ꎬ２００ ｒ / ｍｉｎ培养过夜ꎬ提取突变体的染色体基
因组ＤＮＡꎮ 采用引物 Ｔｎ ＦＰ和 Ｔｎ ＲＰ(表 １)扩增转
座子 ＤＮＡ中卡那霉素的部分片段ꎬ大小约 ７５０ ｂｐꎮ
９０３
植物病理学报 ４５卷
扩增程序:９５℃ ３ ｍｉｎꎻ９５℃ ３０ ｓꎻ５５℃ ３０ ｓꎬ７２℃
４０ ｓꎻ３０个循环ꎻＥＣ１００Ｄ ｐｉｒ＋ １０ ｍｉｎꎻ ４℃维持ꎮ
参照 Ｌｕ 等[１７]的方法ꎬ利用 ｎｐｔ ＩＩ 基因(赋予
细胞卡那霉素抗性)片段经 ＤＩＧ 标记为探针ꎬ用
ＥｃｏＲ Ｉ限制性内切酶对 ７ 株突变株的 ＤＮＡ 进行
酶切ꎬ电泳ꎬ转膜进行 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔꎮ 杂交及探针
标记采用 Ｒｏｃｈｅ公司的 ＤＩＧ试剂盒ꎮ
１.６ 突变株插入位点基因的克隆及生物信息学分析
利用转座子 ＥＺ￣Ｔｎ５ <Ｒ６Ｋ gｏｒｉ / ＫＡＮ￣２>自身
的多酶切位点ꎬ用限制性内切酶 Ｐｓｔ Ｉ 对突变株的
基因组 ＤＮＡ随机进行酶切ꎬ参照转座子试剂盒方
法ꎬ酶切后的 ＤＮＡ 片段进行环化自连ꎬ构建拯救
质粒ꎬ电转化宿主大肠杆菌 ＥＣ１００Ｄ ｐｉｒ＋ꎮ ３７℃过
夜培养后提取质粒ꎬ用试剂盒自带引物 ＫＡＮ￣２
ＦＰ￣１和 Ｒ６ＫＡＮ￣２ ＲＰ￣１(表 １)测序ꎬ获得 ＹＬ￣１ 突
变株染色体基因组 ＤＮＡ插入位点的侧翼序列ꎮ
对绿针假单胞菌 ＹＬ￣１ 进行了全基因组测
序[１８]ꎬ根据获得的插入位点的侧翼序列ꎬ进行序列
分析ꎬ获得的完整基因在 ＮＣＢＩ 网站进行数据分析
(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ / )ꎮ
１.７ 嗜铁素(Ｐｙｏｖｅｒｄｉｎｅ)选择性培养基上检测
突变株发光表型
将突变株 ＭＴ１￣７划线于嗜铁素选择性培养基
(金氏 Ｂ培养基)上ꎬ２８℃培养 ２ ｄꎬ紫外光 ３６６ ｎｍ
下观察突变株发光情况ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 绿针假单胞菌 ＹＬ￣１突变体库构建
用大肠杆菌￣假单胞菌穿梭载体 ｐＵＣＰ２６ (２５
μｇ / ｍＬ的四环素抗性) 检测菌株 ＹＬ￣１ 感受态细
胞的电转化效率ꎮ 试验结果表明:绿针假单胞菌
ＹＬ￣１感受态细胞电转化效率较高ꎬ为 ２×１０７ＣＦＵ /
μｇ ＤＮＡꎮ 随机挑取 ２０个转化子于 ＬＢ培养液(２５
μｇ / ｍＬ 四环素抗性)中 ２８℃ꎬ２００ ｒ / ｍｉｎ 培养过夜
后提质粒ꎬ限制性内切酶 ＢａｍＨ Ｉ 和 ＥｃｏＲ Ｖ 对质
粒进行双酶切验证ꎬ产生分子量约为 ２ ０００ ｂｐ 和
３ ０００ ｂｐ的条带ꎬ与相同酶切的质粒 ｐＵＣＰ２６结果一
致ꎬ证明这些转化子中均含有质粒 ｐＵＣＰ２６(图 １)ꎮ
利用 ＥＺ￣Ｔｎ５ <Ｒ６Ｋ gｏｒｉ / ＫＡＮ￣２>转座子试剂
盒随机转化菌株 ＹＬ￣１ 感受态细胞ꎬ分 ３ 次进行ꎬ
共获得 ５ １００个转化子ꎮ
２.２ ＹＬ￣１突变株对几种病原菌的抑菌活性测定
以 ３ 种病原细菌 (Ｂ. ｇｌｕｍａｅ、 Ｅ. ａｍｙｌｏｖｏｒａ、
Ｐ. ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ)和病原真菌 Ｒ. ｓｏｌａｎｉ作为试验指示
菌进行室内抑菌能力筛选试验ꎮ 与野生型菌株相
比ꎬ７个突变菌株 (ＭＴ１￣７) 对 ３ 种病原细菌抑菌
能力有不同程度的明显下降ꎬ但是对病原真菌 (Ｒ.
ｓｏｌａｎｉ) 抑菌能力几乎不变(图 ２ ~图 ５)ꎮ 而突变
菌株 ＭＴ￣８对 ３种病原细菌抑菌能力几乎不变ꎬ但
是对病原真菌 (Ｒ. ｓｏｌａｎｉ) 完全丧失抑菌能力(另
文发表) ꎮ试验结果表明:７个突变菌株(ＭＴ１￣７)
Ｆｉｇ. １ Ｐｌａｓｍｉｄｓ １￣２０ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ＹＬ￣１ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ
ｐＵＣＰ２６ ｃｕｔ ｉｎｔｏ ２.０ ｋｂ ａｎｄ ３.０ ｋｂ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｂｙ ＢａｍＨ Ｉ ａｎｄ ＥｃｏＲ Ｖ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
０１３
３期 刘邮洲ꎬ等:绿针假单胞菌 ＹＬ￣１抗细菌活性相关基因的克隆和分析
Ｆｉｇ. ２ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｇｌｕｍａｅ ｉｎ ＹＬ￣１ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ (ＷＴ) ａｎｄ ｍｕｔａｎｔｓ
Ｆｉｇ. ３ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ ｉｎ ＹＬ￣１ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ (ＷＴ) ａｎｄ ｍｕｔａｎｔｓ
Ｆｉｇ. ４ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ
ｉｎ ＹＬ￣１ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ (ＷＴ) ａｎｄ ｍｕｔａｎｔｓ
１１３
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. ５ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ｉｎ ＹＬ￣１ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ (ＷＴ) ａｎｄ ｍｕｔａｎｔｓ
的转座子插入突变位点与绿针假单胞菌 ＹＬ￣１ 的
抗细菌活性相关ꎬ与其抗真菌活性无关ꎮ 同时绿针
假单胞菌 ＹＬ￣１ 分泌的抗细菌活性物质具有广谱
的抗细菌活性ꎮ
２.３ 突变株的 ＰＣＲ验证
７个突变菌株 (ＭＴ１￣７)进行转座子插入基因
组上的部分卡那霉素抗性基因编码片段的 ＰＣＲ验
证ꎬ结果如图 ６所示ꎮ ７个突变菌株的染色体基因
组中均可以扩增出大小约为 ７５０ ｂｐ 的部分卡那霉
素抗性基因编码片段ꎬ而对照野生型菌株 ＹＬ￣１没
有扩增出条带ꎬ说明转座子 Ｔｎ５均已进入此 ７株突
变体染色体基因组内ꎮ
Ｆｉｇ. ６ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒｔ ｋａｎａｍｙｃｉｎ
ｇｅｎｏｍｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ＹＬ￣１ ｗｉｌｄ
ｔｙｐｅ (ＷＴ) ａｎｄ ｍｕｔａｎｔｓ (１￣７)
２.４ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ验证 Ｔｎ５质粒单拷贝插入染
色体上
对 ２.２ 中挑选的 ７ 个突变菌株进行 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ
ｂｌｏｔ验证ꎬ结果表明(图 ７):７ 个突变菌株均为单拷
贝插入ꎬ且条带位置各不相同ꎮ 这说明 Ｔｎ５转座子
成功插入绿针假单胞菌 ＹＬ￣１基因组不同位点ꎮ
Ｆｉｇ. ７ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ Ｔｎ５ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｐｉｅｓ ｉｎ ｔｒａｎｓ￣
ｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ＹＬ￣１
２.５ 突变体转座子插入位点侧翼序列分析
参照转座子试剂盒方法ꎬ构建突变体的拯救质
粒ꎬ测序后获得 ＹＬ￣１ 突变株染色体基因组 ＤＮＡ
插入位点的侧翼序列ꎮ 利用绿针假单胞菌 ＹＬ￣１
的全基因组序列ꎬ获得的完整基因在 ＮＣＢＩ 网站进
行数据分析(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / ) (表
２)ꎮ 结果表明:７ 个突变菌株中 ６ 个突变位点和嗜
铁素合成相关ꎬ其中突变菌株 ＭＴ￣１的突变位点是
ｐｖｄＤ基因ꎬ编码嗜铁素非核糖体肽合成酶ꎻ突变菌株
２１３
３期 刘邮洲ꎬ等:绿针假单胞菌 ＹＬ￣１抗细菌活性相关基因的克隆和分析
Ｔａｂｌｅ ２ Ｇｅｎｅｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｔｎ５ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ
Ｓｔｒａｉｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｇｅｎｅ ｎａｍｅ Ｓｉｚｅ / ｂｐ Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ∗ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ / ％
ＭＴ￣１ ｐｖｄＤ １３ ２１５ ＷＰ＿００９０４９９９５.１ ９９
ＭＴ￣２ ｐｖｄＬ １２ ９９９ ＷＰ＿００９０５００７３.１ ９９
ＭＴ￣３ ｐｖｄＥ １ ６５３ ＷＰ＿００９０４９９９３.１ １００
ＭＴ￣４ ｐｖｄＡ １ ３３５ ＷＰ＿００９０４９９８３.１ １００
ＭＴ￣５ ｐｖｄＰ １ ６２３ ＷＰ＿００９０４９９８８.１ １００
ＭＴ￣６ ｓｅｃＹ １ ３２９ ＷＰ＿００７９２４１８２.１ １００
ＭＴ￣７ ｐｖｄＳ ５４９ ＷＰ＿００９０５００７４.１ １００
“∗”:Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｔｏ ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ Ｏ６ (ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＮＺ＿ＣＭ００１４９０.１) .
ＭＴ￣２的突变位点是 ｐｖｄＬ基因ꎬ编码嗜铁素发光体
合成酶ꎻ突变菌株 ＭＴ￣３的突变位点是 ｐｖｄＥ 基因ꎬ
属于细菌质膜上的 ＡＢＣ 转运器 (ＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒ￣
ｔｅｒ)ꎻ突变菌株 ＭＴ￣４的突变位点是 ｐｖｄＡ 基因ꎬ编
码鸟氨酸羟化酶ꎻ突变菌株 ＭＴ￣５ 的突变位点是
ｐｖｄＰ基因ꎬ编码嗜铁素发光体蛋白ꎻ突变菌株 ＭＴ￣
７的突变位点是 ｐｖｄＳ基因ꎬ属于 σ 因子ꎬ调控嗜铁
素的转录ꎮ 突变菌株 ＭＴ￣６ 的突变位点是 ｓｅｃＹ 基
因ꎬ属于 Ｓｅｃ转运系统ꎬ编码转运蛋白ꎮ
２.６ 突变体紫外线下发光试验
一般荧光性假单胞菌在金氏 Ｂ 培养基上均能
产生水溶性荧光素(青脓素)ꎬ在紫外线(３６６ ｎｍ)
照射下呈黄绿色或蓝白色荧光ꎮ本文２ .５中试验
Ｆｉｇ. ８ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｙｏｖｅｒｄｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｅｄ
ｂｙ ｓｔａｉｎ ＹＬ￣１ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ (ＷＴ ) ａｎｄ
ｍｕｔａｎｔｓ ｕｎｄｅｒ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｌｉｇｈｔ
结果表明ꎬ突变菌株 ＭＴ￣１、ＭＴ￣２、ＭＴ￣３、ＭＴ￣４、
ＭＴ￣５和 ＭＴ￣７的转座子插入位点均为嗜铁素合成
基因簇ꎬ荧光下观察(图 ８)发现突变菌株 ＭＴ￣１、
ＭＴ￣２、ＭＴ￣３、ＭＴ￣４、ＭＴ￣５ 和 ＭＴ￣７ 均丧失发光表
型ꎻ突变菌株 ＭＴ￣６插入位点是 ｓｅｃＹ 基因ꎬ仍具有
发光表型ꎮ
３ 讨论
随着后基因组时代的到来ꎬ基因功能研究越来
越重要ꎮ 转座子突变技术是通过构建突变体研究
基因功能的一种方法ꎬ该方法因其简便易行而备受
关注ꎮ Ｔｎ ５属于复合转座子ꎬ含有编码抗生素的
核心序列ꎮ 由 Ｔｎ ５构建而成的一系列衍生载体具
有以下优点:(１)均为自杀性载体ꎬ必须在特定的
宿主中才能复制ꎻ(２)含有抗生素抗性基因ꎬ便于
突变体筛选ꎻ(３)能抑制自身转座ꎬ保证突变菌株
上单拷贝插入ꎻ(４)插入位点留下一段已知 ＤＮＡ
序列ꎬ容易定位ꎻ(５)转座酶不发生转座ꎬ保证转座
子在 ＤＮＡ上稳定存在ꎬ突变性状稳定[１９]ꎮ
采用转座子插入突变的方法研究生防菌防治
机理有很多报道ꎮ 如:Ｐ. ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ ３０￣８４ 对小
麦全蚀病有比较强的防治效果ꎬ用转座子插入突变
的方法使之失去产生吩嗪￣１￣羧酸 ( Ｐｈｅｎａｚｉｎｅ￣１￣
ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅꎬ ＰＣＡ)的能力ꎬ对小麦全蚀病的防效也
随之下降ꎬ将含有该抗生素合成基因的质粒转入突
变菌株ꎬ抑菌能力和防病效果也随之恢复[２０]ꎮ 硝
吡咯菌素(ＰｙｒｒｏｌｎｉｔｒｉｎꎬＰｒｎ)是生防菌株 Ｐ. ｆｌｕｏｒｅｓ￣
ｃｅｎｓ ＢＬ ９１５产生的抗生素ꎬ研究结果表明:Ｐｒｎ 合
成基因是由 ４个开放阅读框组成的基因簇ꎬ其中任
何一个基因突变都会导致不能产生硝吡咯菌素ꎬ同
３１３
植物病理学报 ４５卷
时丧失生防能力[２１]ꎮ 产生嗜铁素是荧光假单胞菌
生防机制之一ꎬＰ. ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＡＴＣＣ １７４００ 中细胞
色素 Ｃ的生物合成与嗜铁素产生密切相关ꎬ其细
胞色素 Ｃ 生物合成基因 ｃｃｍＣ 被 Ｔｎ ５ 插入失活
后ꎬ嗜铁素产量显著减少ꎬ生防作用也受到影
响[２２]ꎮ Ｇｕ等[２３~２５]利用转座子 ＥＺ￣Ｔｎ５<Ｒ６Ｋγｏｒｉ /
Ｋａｎ￣２>对一株细菌 Ｂ. ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ ＭＳ１４进行随机
突变ꎬ获得了一批抑菌能力下降或丧失的突变菌
株ꎬ随后鉴定抗病相关基因并进行了功能验证ꎬ先
后探明菌株 ＭＳ１４ 中一共有 １６ 个开放阅读框
(ＯＲＦｓ)ꎬ产生一种寡肽类抗菌物质ꎬ命名为 ｏｃｃｉ￣
ｄｉｏｆｕｎｇｉｎꎮ Ｘｕ 等[２６] 利 用 转 座 子 ＥＺ￣Ｔｎ５ <
Ｒ６Ｋγｏｒｉ / Ｋａｎ￣２>随机突变的方法ꎬ发现 ｐｑｑＣ 基因
是假单胞菌属 Ｐ. ｋｉｌｏｎｅｎｓｉｓ ＪＸ２２ 抗真菌活性所必
需的ꎻ蛋白分泌相关基因 ｓｅｃＧ是假单胞菌属 Ｐ. ｊａ￣
ｐｏｎｉｃａ ＹＬ￣２３抗细菌活性所必需的(另文发表)ꎮ
本文利用转座子 ＥＺ￣Ｔｎ５<Ｒ６Ｋγｏｒｉ / Ｋａｎ￣２>对绿针
假单胞菌 ＹＬ￣１随机突变ꎬ７ 个抑制细菌能力明显
下降的突变体中 ６ 个突变位点在嗜铁素合成基因
簇上ꎬ只有突变菌株 ＭＴ￣６的突变位点是蛋白分泌
相关基因 ｓｅｃＹꎮ 上述基因一旦被转座子插入破坏ꎬ
突变体就丧失了抗细菌活性的能力ꎮ
噬铁素是一类低分子量化合物可以特异地螯
合 Ｆｅ３＋的螯合因子ꎮ 嗜铁素在生防作用的研究方
面ꎬ主要以荧光性假单胞菌群分泌的水杨酸、绿脓
杆菌螯铁蛋白、青脓素研究的较多[２７]ꎮ 荧光假单
胞菌ＷＣＳ３７４合成水杨酸的相关功能基因已经被
鉴定ꎬ由 ｐｍｓＣ、ｐｍｓＥ、ｐｍｓＡ和 ｐｍｓＢ ４个基因组成ꎬ
位于 ５ ｋｂ的基因组 ＤＮＡ 序列中[２８]ꎻ绿脓杆菌螯
铁蛋白合成的中间体是水杨酸盐ꎬ在荧光假单胞菌
ＣＨＡ０中 ｐｃｈＤ、ｐｃｈＣ、ｐｃｈＢ、ｐｃｈＡ 是合成绿脓杆菌
螯铁蛋白相关的功能基因ꎬ位于 ４.４ ｋｂ 的基因序
列中[２９]ꎻ青脓素是荧光性假单胞菌通过非核糖体
途径 ( ｎｏｎ￣ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｅｎｚｙｍｅｓꎬ
ＮＲＰＳ)分泌的最常见的铁载体ꎬ使得荧光性假单
胞菌在波长为 ３６６ ｎｍ紫外线的照射下发蓝绿色荧
光[３０]ꎮ 据报道ꎬ已有 ５０ 个以上不同青脓素结构ꎬ
青脓素合成相关的基因簇已经被鉴定ꎬ由多个具有
特定功能的基因如 ｐｖｄＡ、 ｆｐｖＲ、 ｆｐｖＩ、ｐｖｄＰ、ｐｖｄＥ、
ｆｐｖＡ、ｐｖｄＤ、ｐｖｄＩ、ｐｖｄＪ、ｐｖｄＳ组成[３１]ꎮ
关于嗜铁素的研究ꎬ国内外目前仍处于基础性
研究阶段ꎮ 迄今ꎬ已经发现 ５００多种化学结构不同
的嗜铁素[３２]ꎮ 微生物中大多数细菌和真菌都能产
生一种或几种特殊物质嗜铁素ꎬ而分泌嗜铁素是其
控制真菌病害的一种主要机制[３２]ꎮ Ｍａｒｌａ 等[３３]研
究发现嗜铁素直接通过抑制病原真菌来起到控制
病害目的ꎮ Ｒａｎ等[３４]研究了嗜铁素缺失突变体控
制桉树灰霉病ꎮ 本研究中绿针假单胞菌 ＹＬ￣１ 的
７个突变体ꎬ测序结果显示 ６ 个突变位点在嗜铁素
合成基因簇上ꎬ随后的金氏 Ｂ 培养基上检测发光
试验也进一步证实绿针假单胞菌 ＹＬ￣１ 突变体的
突变位点与嗜铁素合成相关ꎬ这是首次发现嗜铁素
与绿针假单胞菌 ＹＬ￣１ 抗细菌活性密切相关ꎮ 研
究结果还表明:绿针假单胞菌 ＹＬ￣１分泌的嗜铁素
具有广谱的抗细菌活性ꎬ但不具有抗真菌活性ꎬ这
与前人的研究结果不一致ꎮ
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[１６] Ｃｏｒｎｉｓｈ Ｅ Ｃꎬ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓ Ａꎬ Ｍａｄｄｏｘ Ｊ Ｆ. Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ ｆｒｅｓｈｌｙ ｐｌａｔｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｐｓｅｕｄｏ￣
ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｃｅｌｌｓ[ Ｊ] . ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓꎬ １９９８ꎬ ２５
(６):９５４－９５６.
[１７] Ｌｕ Ｓ Ｅꎬ Ｓｃｈｏｌｚ￣Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ｂ Ｋꎬ Ｇｒｏｓｓ Ｄ Ｃ. Ｃｈａｒａｃｔｅ￣
ｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｌＡꎬ ｓｙｒＦꎬ ａｎｄ ｓｙｒＧ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅｓ
ｌｏｃａｔｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｒｉｇｈｔ ｂｏｒｄｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｓｙｒｉｎｇｏｍｙｃｉｎ ｇｅｎｅ
ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｓｙｒｉｎｇａｅ [ Ｊ ] .
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ ２００２ꎬ １５: ４３－
５３.
[１８] Ｌｉｕ Ｙ Ｚꎬ Ｌｕ Ｓ Ｅꎬ Ｂｒａｉｄ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｒａｆｔ ｇｅｎｏｍｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ ＹＬ￣１ꎬ ａ
ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｉｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ ｐｌａｎｔ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ
[Ｊ] . Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎｎｏｕｎｃｅｍｅｎｔｓꎬ ２０１４ꎬ ２(１):１－２.
[１９] Ｎｉａｎ Ｈ Ｊꎬ Ｃｈｅｎ Ｌ Ｍꎬ Ｌｉ Ｋ Ｚ. Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｎ ５
ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ
ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ ｏｆ ｇｒａｍ￣ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ( ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ)[Ｊ] . Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ (中国生物工程
杂志)ꎬ ２００９ꎬ ２９(１２): １１４－１１８.
[２０] Ｐｉｅｒｓｏｎ ＩＩＩ Ｌ Ｓꎬ Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ Ｌ Ｓ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏ￣
ｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｏｃｕｓ
ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ ３０￣８４[ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ １９９２ꎬ ５: ３３０－３３９.
[２１] Ｐｈｉｌｉｐ Ｅ Ｈꎬ Ｓｔｅｖｅｎ Ｈꎬ Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｔ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｆｏｕｒ ｇｅｎｅｓ
ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ｔｈａｔ ｅｎｃｏｄｅ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎ￣
ｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｙｒｒｏｌｎｉｔｒｉｎ[ Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ １９９７ꎬ ６３: ２１４７－２１５４.
[２２] Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｂꎬ Ｓａｎｄｒａ Ｍꎬ Ｔｈｅｒｅｓａ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ
ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｅｍＡ ａｎｄ ｈｅｍＨ ｇｅｎｅ ｏｎ ｐｙｏｖｅｒｄｉｎｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＡＴＣＣ１７４００
[Ｊ] . ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒꎬ ２００１ꎬ ２０５: ５７－６３.
[２３] Ｇｕ Ｇꎬ Ｗａｎｇ Ｎꎬ Ｃｈａｎｅｙ Ｎꎬ ｅｔ ａｌ. ＡｍｂＲ１ ｉｓ ａ ｋｅｙ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇ ｕｌａｔｏｒ ｆｏｒ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＭＳ１４ [ Ｊ ] . ＦＥＭＳ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒꎬ ２００９ꎬ ２９７: ５４－６０.
[２４] Ｇｕ Ｇꎬ Ｓｍｉｔｈ Ｌꎬ Ｗａｎｇ Ｎꎬ ｅｔ ａｌ. Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｎ ａｎ￣
ｔｉｆｕｎｇａｌ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ
ｓｔｒａｉｎ ＭＳ１４ [ Ｊ ] . Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
５１３
植物病理学报 ４５卷
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓꎬ ２００９ꎬ ３８０: ３２８－３３２.
[２５] Ｇｕ Ｇꎬ Ｓｍｉｔｈ Ｌꎬ Ｌｉｕ Ａꎬ ｅｔ ａｌ. Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｍａｐ ｆｏｒ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｃｃｉｄｉｏｆｕｎｇｉｎꎬ ａｎ ａｎｔｉｆｕｎ￣
ｇａｌ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＭＳ１４
[Ｊ] . Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１１ꎬ
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[２６] ＸｕＪ Ｈꎬ Ｄｅｎｇ Ｐꎬ Ｓｈｏｗｍａｋｅｒ Ｋ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ｐｑｑＣ
ｇｅｎｅ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｋｉｌｏｎｅｎｓｉｓ ＪＸ２２ ａｇａｉｎｓｔ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ.
ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ [ Ｊ] . ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒꎬ ２０１４ꎬ
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[２７] Ｙａｎｇ Ｙꎬ Ｓｕｎ Ｙꎬ Ｌｉ Ｚ. Ｔｈｅ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ) [ Ｊ ] . Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ (西北大学学报.)ꎬ ２０１２ꎬ １０
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[２８] Ｍｅｒｃａｄｏ－Ｂｌａｎｃｏ Ｊꎬ Ｐｅ Ｏꎬ Ｊｅ Ｔꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｐｍｓＣＥＡＢ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ
ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ
ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＷＣＳ３７４
[Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ ２００１ꎬ １８３(６): １９０９－
１９２０.
[２９] Ｓｅｒｉｎｏ Ｌꎬ Ｒｅｉｍｍａｎｎ Ｃꎬ Ｈａａｓ Ｄꎬ ｅｔ ａｌ. Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｏｆ ｐｙｏｃｈｅｌｉｎ ａｎｄ ｄｉｈｙｄｒｏａｅｒｕｇｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ
ｉｒｏｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｃｈＤＣＢＡ ｏｐｅｒｏｎ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ[ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙꎬ １９９７ꎬ １７９
(１): ２４８－２５７.
[３０] Ｏｗｅｎ Ｊ Ｇꎬ Ａｃｋｅｒｌｅｙ Ｄ Ｆ. Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｏｖｅｒ￣
ｄｉｎｅ ａｎｄ ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｉｎ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ.
ｐｈａｓｅｏｌｉｃｏｌａ １４４８ａ [ Ｊ] . ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１１ꎬ
１１: ２１８－２３３.
[３１] Ｍｏｏｎ Ｃ Ｄꎬ Ｒａｉｎｅｙ Ｐ Ｂꎬ Ｍａｔｔｈｉｊｓ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. Ｇｅｎｏｍｉｃꎬ
ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｙｏｖｅｒｄｉｎｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｉｒｏｎ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ￣ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＳＢＷ２５[Ｊ] . ＢＭＣ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００８ꎬ ８: １－１３.
[３２] Ｌｉａｎｇ Ｊ Ｇꎬ Ｈａｏ Ｚ Ｎꎬ Ｗａｎｇ Ｌ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
[Ｊ] . Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ (中国农学
通报)ꎬ ２０１１ꎬ ２７(５): ２８４－２８７.
[３３] Ｍａｒｌａ Ｇ Ｔ Ｒꎬ Ｓａｎｄｒａ Ａ Ｖ Ｐꎬ Ｊａｉｍｅ Ｂ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａꎬ Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ. ａｎｄ
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ.ꎬ ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ ｏｆ ｉｎｄｏｌｅ￣３￣ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ
ａｎｄ ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅꎬ ｆｒｏｍ Ｃｏｌｏｍｂｉａｎ ｒｉｃｅ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ[Ｊ] .
Ｒｅｖｉｓｔａ Ｌａｔｉｎｏａｍｅｒｉｃａｎａ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉａꎬ ２０００ꎬ ４２:
１７１－１７６.
[３４] Ｒａｎ Ｌ Ｘꎬ Ｘｉａｎｇ Ｍ Ｌꎬ Ｂｉｎ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ ａｒｅ
ｔｈｅ ｍａｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｆ
ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｒｅｙ ｍｏｕｌｄ ｉｎ Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ
ｕｒｏｐｈｙｌｌａ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ
Ｓｉｎｉｃａ (植物病理学报)ꎬ ２００５ꎬ ３５(１): ６－１２.
责任编辑:于金枝
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