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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第1期
韭 菜（Allium tuberosum Rottl. Ex Spreng） 别 名
草钟乳、起阳草，是百合科葱属多年生宿根草本植
物，具有一种特殊而且强烈的韭香气味，主要以叶
片、假茎供食，为我国特有的一种蔬菜［1］。韭菜不
仅营养丰富，而且具有多方面的保健功能［2］。另外，
韭菜的自然群体内缺乏有效的抗病、虫、草等基因，
因此应用转基因技术进行韭菜新品种的开发是相当
必要的。
收稿日期 ：2013-09-06
基金项目 ：山西省农业科技攻关项目（20090311022，0110311015-1），山西省人事厅人才引进项目
作者简介 ：常婧，女，硕士研究生，研究方向 ：蔬菜育种及生物技术 ；E-mail ：412567956@qq.com
通讯作者 ：李梅兰，女，博士，教授，博士生导师，研究方向 ：蔬菜育种及生物技术 ；E-mail ：limeilan_2@hotmail.com
农杆菌介导韭菜遗传转化相关因素的研究
常婧1  高行英1  李小东2  侯雷平1  李梅兰1
（1. 山西农业大学园艺学院，太谷 030801 ；2. 方兴现代农业有限公司，长治 046600）
摘 要 ： 以“汉中冬韭”韭菜品种为试验材料，用含有 pCAMBIA3301 质粒的根癌农杆菌菌株 EHA105 对影响韭菜遗传转化
效率的多种因素进行研究。结果表明，诱导 40 d 的愈伤组织，GUS 基因瞬时表达率达到 93%，且最适宜于不定芽的分化 ；当乙酰
丁香酮（AS）的浓度为 100 μmol/L 时，愈伤的 GUS 表达率达到 91%，植株再生率为 7.9%，AS 浓度增加时其值也不会增加 ；菌液
OD600 值为 0.6 侵染 10 min 时，与其他组合相比，外植体受伤程度小，GUS 表达率及再生率最高 ；侵染后的愈伤共培养 3 d 后，农
杆菌生长较少，GUS 表达率为 91.1%，而再生率达到 7.2%，为最佳的共培养时间。通过试验得到韭菜遗传转化因素的最佳条件，
为今后的遗传转化提供一些参考。
关键词 ： 韭菜 农杆菌 GUS 染色 遗传转化
Research on the Factors Related to Agrobacterium-mediated Genetic
Transformation of the Chinese Chive
Chang Jing1 Gao Xingying1 Li Xiaodong2 Hou Leiping1 Li Meilan1
（1. College of Horticulture，Shanxi Agriculture University，Taigu 030801 ；2. Fangxing Modern Agriculture Co. Ltd, Changzhi 046600）
Abstract:  Using “Hanzhong Dongjiu” variety and the Agrobacterium EHA105 containing pCAMBIA3301 plasmid as the material, it
studied the factors which could influence transformation efficiency of Chinese chive. The results showed that transient expression rate of GUS
gene reached 93% with the callus cultured for 40 d as the explant and the adventitious buds differentiated well. When 100 μmol/L acetosyringone
was added to the miedium, GUS expression rate of the callus reached 91% and the plant regeneration rate was 7.9%, but did not increase with
increasing of the AS concentration. Compared with other combinations, the calli were soaked in Agrobacterium（OD600 ≈ 0.6）for 10 min, the
injury degree of explants was slight and the GUS expression rate and regeneration rate were the highest. When the calli were co-cultured for 3
days after infection, the bacterium grew less than other period, GUS expression rate and the regeneration rate were 91.1% and 7.2% respectively.
Through the experiment, the best conditions of genetic transformation factors for chinese chive were obtained.
Key words:  Chinese chive Agrobacterium GUS staining Genetic transformation
目前国内外关于韭菜遗传转化的研究较少。仅
张松等［3］以 GUS 报告基因建立了农杆菌介导韭菜
转化体系，尚没有转基因品种成功的报道。但葱蒜
类其他作物的遗传转化已经比较成熟，尤其是洋葱
和大蒜［4］。迄今为止，已经成功获得了抗除草剂［5］、
抗虫［6］和抗逆性［7］等多个品种，尽管转化的方法
法有基因枪法和农杆菌介导法，但大多数采用的是
农杆菌介导的方法。由于农杆菌介导法具有简便、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期126
单拷贝等优点，已经广泛应用于植物的遗传转化中，
但是该方法的建立需要高效的再生系统作为前提。
因此，本试验就影响农杆菌介导韭菜遗传转化效率
的主要因素包括愈伤组织大小、乙酰丁香酮（AS）
浓度、菌液浓度和侵染时间及共培养时间等进行研
究，得到韭菜遗传转化的最佳因素，为今后的研究
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 试验采用韭菜品种“汉中冬韭”，种子
购于山西省侯马市农人种业有限公司。供试根癌农
杆菌菌株为 EHA105，内含 pCAMBIA3301 载体，该
载体携带有选择标记 Bar 基因和 GUS 报告基因。
1.1.2 培养基 本试验过程中所用的培养基，见表 1。
表 1 韭菜遗传转化培养基
成分 播种培养基 诱愈培养基 诱芽培养基 诱导培养基 共培养基 选择培养基
MS 大量元素 1/2 + + 1/2 + +
MS 微量元素 + + + + + +
MS 有机元素 + + + + + +
蔗糖（g/L） 30 30 30 30 30 30
琼脂（g/L） 6.5 6.5 6.5 - 5.5 6.5
BA（mg/L） - 2 1 - 1 1
NAA（mg/L） - 1 0.5 - 0.5 0.5
KT（mg/L） - - 0.5 - 0.5 0.5
AS（μmol/L） - - - - 100 -
Cef（mg/L） - - - - - 400
PPT（mg/L） - - - - - 1
pH 值 5.8 5.8 5.8 5.2 5.5 5.8
1/2 ：元素减半 ；+ ：加入 ；- ：未加。
各种培养基配好后，在 121℃高温高压灭菌 20
min，其中 AS、头孢霉素（Cef）和草丁膦（PPT）
在培养基灭菌后降温到 55℃时再加入。
1.2 方法
1.2.1 韭菜愈伤组织诱导 将韭菜种子冲洗干净，
在 75% 乙醇中消毒 30 s，无菌水冲洗 3-5 次，再用
含 0.1 % 升汞和 0.1 % Tween-20 的混合溶液消毒 10
min，无菌水冲洗 3-5 次，消毒后的种子放置在播种
培养基中，黑暗环境生长 2 d 后，转移到光照条件
下培养。7 d 左右，种子萌发生长获得 1 cm 左右无
菌胚根，切取胚根尖 1.5-2 mm 放置诱愈培养基中诱
导愈伤组织用于转化。
1.2.2 农杆菌培养与活化 取 30 μL EHA105 原菌
接种到 30 mL LB（含 50 mg/L 卡那霉素和 100 mg/L
利福平）液体培养基中，在 28℃ 200 r/min 震荡培
养。16 h 后，菌株处于对数生长期，此时活性最高，
OD600 值在 1.2-1.5 之间，5 000 r/min 离心 5 min。倒
掉上清液，重新悬浮于诱导培养基中，于 200 r/min
震荡培养活化 4 h 即可用于转化。
1.2.3 愈伤组织大小对转化的影响 将分别培养
10、20、30、40、60 d 的愈伤组织（图 1-A）切成
2 mm 大小，在活化的菌液（OD600=0.6）中侵染 10
min，用滤纸吸干多余的菌液，放置在共培养基中
25℃黑暗培养 3 d。之后将愈伤组织转移到选择培养
基中，选择培养 7 d 后，随机抽取 20 个愈伤外植体
进行 GUS 染色，检测 GUS 基因的瞬时表达率。之后，
2 周转接一次，培养 30 d 左右后，统计韭菜愈伤组
织的再生率（图 1-B）。
A B
A ：诱导的愈伤组织，从右向左分别为 10、20、30、40、60 d ；B ：转化后
愈伤分化不定芽
图 1 愈伤组织及不定芽的分化
2014年第1期 127常婧等 ：农杆菌介导韭菜遗传转化相关因素的研究
1.2.4 乙酰丁香酮浓度对转化的影响 在诱导培养
基和共培养中分别加入 0、100、200 μmol/L 的 AS
用于侵染和共培养，共 9 个试验组合。将愈伤组织
在含不同浓度 AS 的诱导培养基中侵染 10 min，之后
步骤及统计观察同 1.2.3。
1.2.5 农杆菌菌液浓度对转化的影响 将摇好的菌
液重悬于诱导培养基中活化后，将菌液 OD600 值分
别调节到 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0，分别与 40
d 大小的愈伤组织（切成 2 mm 大小）侵染 10 min，
之后步骤及统计观察同 1.2.3。
1.2.6 农杆菌侵染时间对转化的影响 将 40 d 大小
的愈伤组织切成 2 mm 的小块，与 OD600 为 0.6 菌液
分别侵染 0、5、10、15、20 min，之后步骤及统计
观察同 1.2.3。
1.2.7 共培养时间对转化的影响 将 40 d 大小愈伤
组织切成 2 mm 的小块，与 OD600 为 0.6 菌液侵染 10
min，分别共培养 0、1、2、3、4、5 d，之后步骤及
统计观察同 1.2.3。
1.2.8 愈伤组织的 GUS 染色 将愈伤组织浸没于
GUS 染色液中，置于 37℃恒温箱中过夜，次日用
70% 乙醇脱色，观察 GUS 染色的效果。
2 结果
2.1 韭菜愈伤组织大小对遗传转化的影响
由韭菜胚根尖诱导不同时期愈伤组织的 GUS 染
色效果（图 2）表明，愈伤培养 10 d 时，愈伤组织
仅有很少面积呈现蓝色 ；培养 20 d 时，愈伤的染色
面积明显增加 ；随着培养时间的增加，愈伤经过切
割后，菌液侵染切面 GUS 染色的面积会更大。统计
结果表明（表 2），愈伤培养 10 d 时，GUS 瞬时表达
仅有 55% ；随着培养时间的增加，GUS 瞬时表达显
著提高 ；培养 40 d 时，GUS 瞬时表达率达到 93% ；
培养时间进一步延长，GUS 瞬时表达率不再增加。
观察植株转化后的再生，培养 10 d 的愈伤经侵
染后褐化严重，逐渐死亡，仅有 1.07% 再生 ；培养
20 和 30 d 的愈伤侵染后，愈伤组织褐化减少，植株
再生率分别达到 3.13% 和 4.93% ；当愈伤培养 40 d
时，再生率达到最大为 7.21%。培养 60 d 时，愈伤
组织的褐化率较低，但愈伤分化不定芽反而下降。
综上所述，在韭菜遗传转化过程中，采用培养 40 d
的愈伤组织为最佳。
10 d 20 d 30 d 40 d 60 d
图 2 不同愈伤组织大小 GUS 染色的效果
表 2 愈伤组织大小对转化的影响
愈伤组织培养时间（d） GUS 瞬时表达率（%） 再生率（%）
10 55.73 ± 1.99dD 1.07 ± 0.15dD
20 72.60 ± 1.96cC 3.13 ± 0.21cC
30 90.50 ± 0.79bB 4.93 ± 0.60bB
40 93.13 ± 0.70aA 7.21 ± 0.36aA
60 94.30 ± 0.41aA 4.79 ± 0.45bB
数据为 3 次重复的平均值 ±SD，各列中大写字母不同表示差异极显著
（P<0.01），小写字母不同为差异显著（P<0.05）；下同
2.2 乙酰丁香酮对韭菜遗传转化的影响
不 同 乙 酰 丁 香 酮 浓 度 下 韭 菜 愈 伤 的 GUS 染
色（表 3）表明，当诱导和共培养基中都不含 AS
时，愈伤染色面积小且颜色较浅，GUS 染色率仅有
32.5% ；仅在诱导培养基中加入 AS 时，当 AS 为 100
μmol/L 时染色率为 53.6%，当 AS 为 200 μmol/L 时，
染色率提高为 72.9%，但颜色依然较浅 ；仅在共培
养基中加入 AS 时，当 AS 为 100 μmol/L 时染色率为
66.2%，当 AS 为 200 μmol/L 时，染色效果提高显著
为 84.4%，且随着浓度的升高颜色变深 ；当诱导和
共培养基中同时加入 AS 时，GUS 染色率达到 91%
以上，愈伤组织的染色面积增大，且蓝色很深。因此，
从 GUS 染色的提高程度看，共培养基中添加 AS 对
转化的影响效果更高。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期128
统计植株再生的结果（表 3）表明，当诱导和
共培养基中都不含 AS 时，大部分愈伤组织选择培
养 1 周后严重褐化，再生率仅有 0.4% ；当仅在诱导
或共培养基中加入 AS 时，再生率都随着 AS 的增加
不断地提高 ；当诱导和共培养基中 AS 浓度为 100
μmol/L 时，植株再生率达到 7.9% ；浓度进一步增加
时，再生率达到 8.0% 左右与之前并没有显著增加。
因此，在韭菜遗传转化中需要诱导和共培养基中同
时加入 100 或 200 μmol/L AS，考虑到成本，韭菜转
化中 AS 最佳浓度为 100 μmol/L。
表 3 乙酰丁香酮浓度对转化的影响
AS 浓度（μmol/L）
GUS 瞬时表达率（%） 再生率（%）
诱导培养基 共培养基
0 0 32.50 ± 0.89fF 0.40 ± 0.11fD
100 0 53.60 ± 1.93eE 1.73 ± 0.15eC
200 0 72.90 ± 1.40cC 2.47 ±0.40dC
0 100 66.17 ± 4.37dD 3.67 ± 0.25cB
100 100 91.37 ± 1.40aA 7.87 ± 0.35aA
200 100 93.60 ± 1.25aA 7.97 ± 0.61aA
0 200 84.37 ± 0.83bB 4.33 ± 0.25bB
100 200 92.63 ± 0.67aA 8.17 ± 0.50aA
200 200 94.73 ± 0.35aA 8.53 ± 0.41aA
2.3 菌液浓度对韭菜遗传转化的影响
不同菌液浓度侵染后韭菜愈伤 GUS 染色效果及
百分率表明，当菌液 OD600 为 0.1 时，组织染色面积
小，颜色比较浅（图 3），GUS 基因的瞬时表达率为
44.0%（表 4）；随着菌液浓度的增加，染色位点越
多，颜色也越深，菌液 OD600 为 0.6 时，GUS 瞬时表
达率达到 90% ；当菌液 OD600 为 0.8 时，整个愈伤块
已完全染色，但是 GUS 基因的表达没有显著增加。
从韭菜愈伤再生方面，当 OD600 为 0.1 时，愈伤
的再生率仅有 1.4% ；当 OD600 为 0.6 时，愈伤的分
化达到 7%，显著的高于其他组合 ；浓度较低时，附
着在愈伤表面的农杆菌较少，基因未整合到植株体
内，在抗生素的作用下愈伤逐渐褐化死亡 ；菌液浓
度过高时，附着在愈伤表面的菌液过多，不利除菌
反而影响愈伤的再生效果。综合各方面因素，OD600
值为 0.6 是最适的菌液浓度。
2.4 侵染时间对韭菜遗传转化的影响
不同侵染时间下愈伤的 GUS 染色效果（图 4）
表明，未经过侵染的愈伤染色后呈现白色，外植
体无伤害，GUS 瞬时表达率与再生率均为 0 ；侵染
0.6 0.80.1 0.2 0.4 1.0
图 3 不同菌液浓度下（OD600 值）韭菜愈伤 GUS 染色的效果
表 4 菌液浓度对韭菜转化的影响
菌液浓度（OD600） GUS 瞬时表达率（%） 再生率（%）
0.1 44.00 ± 1.49dD 1.40 ± 0.30eE
0.2 61.27 ± 2.12cC 3.03 ± 0.31dD
0.4 80.73 ± 3.69bB 5.77 ± 0.35bB
0.6 90.83 ± 1.00aA 7.03 ± 0.35aA
0.8 92.70 ± 1.22aA 4.67 ± 0.47cC
1.0 93.77 ± 0.65aA 4.50 ± 0.53cC
5 min 的组织呈现浅蓝色，GUS 瞬时表达率为 53.2%
（表 5），愈伤有较少切口变褐，再生率为 3.26% ；侵
染 10 min 的愈伤呈现深蓝色，GUS 表达率达到 90%
以上，有部分伤口变褐，组织再生率最高，达到
5.92% ；侵染 15 min 以上的愈伤颜色继续增大，GUS
瞬时表达率并没有显著增加，愈伤褐化严重，再生
率反而减低 ；总之，随侵染时间的增长，GUS 基因
瞬时表达率越高，但愈伤受菌液伤害的程度也越严
重，再生就越困难。综合上述分析，愈伤组织在菌
液中侵染 10 min 为最佳。外植体受伤程度轻，GUS
基因瞬时表达率很高，再生率也最高。
2.5 共培养时间对韭菜遗传转化的影响
不同共培养条件下愈伤组织的 GUS 染色（图 5）
2014年第1期 129常婧等 ：农杆菌介导韭菜遗传转化相关因素的研究
表明，共培养 0 d 时，GUS 基因在愈伤组织即有表
达，但染色效果较浅，GUS 瞬时表达率为 40.9%（表
6）；共培养 3 d 后，愈伤呈现深蓝色，GUS 表达率
接近最高值达到 91.1% ；共培养时间再长时，愈伤
蓝色更深，GUS 表达不再显著增加。另外，共培养
2 d 内，农杆菌生长不明显，愈伤分化率低 ；共培养
3 d 时，农杆菌生长菌落依稀可见，但不超过外植体
周围，再生率达到 7.2% ；共培养 4 d 后，在外植体
周围出现少量菌落，而共培养 5 d 后，在外植体周
围出现大量菌落，植株再生率反而下降。综合上述
分析，共培养 3 d 后，农杆菌菌落少，GUS 瞬时表
达率也较高，再生率最高，为转化时共培养的最佳
时间。
图 4 不同侵染时间下韭菜愈伤 GUS 染色效果
表 5 侵染时间对韭菜转化的影响
侵染时间（min） GUS 瞬时表达率（%） 再生率（%）
0 0.00 ± 0.00cC 0.33 ± 0.58dD
5 53.20 ± 4.13bB 3.26 ± 0.52bBC
10 90.47 ± 1.89aA 5.92 ± 0.31aA
15 92.47 ± 2.20aA 3.49 ± 0.23bB
20 93.73 ± 1.81aA 2.37 ± 0.16cC
0 min 20 min15 min5 min 10 min
0 d 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d
图 5 不同共培养时间下韭菜愈伤 GUS 染色效果
表 6 共培养时间对韭菜转化的影响
共培养天数（d） GUS 瞬时表达率（%） 再生率（%）
0 40.93 ± 2.87dD 1.07 ± 0.25eE
1 65.53 ± 8.07cC 2.44 ± 0.06dD
2 80.90 ± 1.49bB 4.86 ± 0.14bB
3 91.10 ± 1.59aA 7.23 ± 0.43aA
4 92.50 ± 1.18aA 5.03 ± 0.33bB
5 94.50 ± 0.80aA 3.36 ± 0.14cC
3 讨论
3.1 愈伤组织培养时间对转化的影响
愈伤组织的大小是影响转化的重要因子，前人
的研究表明应用直接诱导的愈伤进行转化效率较低，
而愈伤组织经过多代培养后，可能产生体细胞突变
且愈伤组织逐渐衰老死亡，不利于转化体筛选，转
化效率反而大大降低，所以经过适当继代培养，使
细胞处于最佳转化状态来提高转化效率［8］。郑杰［9］
在水稻的研究中发现表面光滑、质地致密、粒形好
的愈伤组织转化率最高。罗敬萍等［10］用不同龄期
的甘蔗愈伤组织进行转化，25 d 的愈伤组织为适龄
的转化受体。杨爱国等［11］在玉米胚性愈伤的转化
中，采用不超过 2.0 mm 大小的幼胚诱导愈伤组织，
经过 10-12 周不断继代扩繁得到干燥松散、有结构、
生长旺盛的愈伤组织进行遗传转化。Aswath 等［12］
在洋葱的遗传转化中，就采用 6 周大的愈伤分割成
表面积为 3 mm2 的小块进行转化。本试验研究表明
韭菜胚根尖诱导愈伤组织培养 40 d 后，愈伤组织直
径达到 5 mm，将其切为 2 mm 大小的转化效果最佳。
3.2 乙酰丁香酮对转化的影响
乙酰丁香酮是基因转化中提高转化频率及基因
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第1期130
稳定遗传和表达的重要试剂。在众多研究中，AS 的
浓度一般为 50-00 μmol/L，浓度过高反而会影响转
化效率或对外植体产生毒害作用［13］。Joubert 等［14］
研究了 AS 对洋葱转化的影响，当 AS 浓度为 100
μmol/L 时对转化的促进效果最高 ；而对洋葱幼胚进
行转化，AS 浓度为 250 μmol/L，组织 GUS 表达率为
60%，浓度过高时表达率反而下降。邸宏等［15］对玉
米幼胚的转化体系进行优化，得到 AS 的适宜浓度
为 200 μmol/L。但是赵军良等［16］在酚类物质对大白
菜遗传转化的研究中表明，其中 AS 转化的影响效果
最佳且转化率提高明显，本试验的研究也表明了这
一点。本试验在诱导和共培养基中同时加入 100 或
200 μmol/L 时显著性不差异，考虑 AS 的伤害作用和
成本问题，AS 的最佳浓度为 100 μmol/L，与 Joubert
等的研究基本一致。
3.3 菌液浓度和侵染时间对转化的影响
菌液浓度和侵染时间是影响遗传转化效率的重
要因素。在葱蒜类蔬菜的遗传转化中大多采用的菌
液 OD600 为 0.6 左右，谭伟等
［17］研究表明，当菌液
OD600 为 0.6 时，大葱愈伤组织的转化率均值最大。
Eady 等［15］在韭菜和大蒜转化时，OD500 下的菌液浓
度为 0.5-1.0 时效果最佳。对于侵染时间，通常为
5-20 min。刘海燕等［19］对洋葱表皮进行转化研究表
明，菌液浓度 OD600 为 0.6，侵染 20 min 时转化率最
高 ；孙传波等［20］在玉米茎尖的转化中表明，当菌
液 OD600 为 0.5 时，浸泡 7 min 后抗性芽的生成率最
高。同时，张明洲等［21］等在高粱转化体系的优化
中也表明，最佳的侵染时间和浓度为 OD600 为 0.5 侵
染 10 min，与本试验结果相一致。
3.4 共培养时间对转化影响
农杆菌共培养是农杆菌进入受体细胞并与其共
生的过程，使细菌中的 T-DNA 转入到受体细胞利于
农杆菌侵染受体。附着在外植体表面的农杆菌并不
能立刻转化，而需要在组织停留一定时间。王沛雅
等［22］的研究表明，当农杆菌与杨树叶盘共培养 4 d
后，分化率可达 80% 并可获得较多生长健壮的抗性
再生芽。Kondo 等［23］研究了共培养 1-6 d 对大葱愈
伤转化的影响表明最佳时间为 3 d。此外，王宏伟
等［24］进一步研究了共培养时间与温度间的关系，
温度为 25℃时共培养 3 d，GUS 表达率最高 ；而温
度为 22℃时共培养 5 d，GUS 表达率也较高。本试
验是在共培养温度 25℃前提下，得到的最佳的共培
养时间为 3 d，与王宏伟的研究结果一致，而对于共
培养温度和时间的关系有待进一步研究。
4 结论
韭菜愈伤组织培养时间 40 d 后，GUS 基因瞬
时表达率达到 93%，且最适宜于不定芽的分化。侵
染韭菜外植体的农杆菌重悬液和共培养基中添加
AS 能大大提高 GUS 表达率和再生率，同时 AS 浓
度为 100 μmol/L 时，愈伤的 GUS 表达率达到 91%，
植株再生率为 7.9%，AS 浓度增加时其值也不会增
加。当菌液 OD600 值为 0.6 侵染 10 min 后共培养 3 d，
外植体受伤程度小，农杆菌生长较少且容易抑制，
GUS 表达率及再生率最高，为最佳的转化。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）