全 文 ：·综述与专论· 2012年第4期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 : 2011-08-23
作者简介 : 胡琼 , 女 , 博士 , 讲师 , 研究方向 : 植物保护、生物化学和分子生物学 ; E-mail: hangzhouhq@yahoo.com.cn
素有“植物癌症”之称的植物病毒是一种全
球性的病害。因其种类众多且发生受传播介体、寄
主等多种因素制约，传统常用的方法如农业措施、
抗病育种等防治效果并不理想。Sanford 等［1，2］于
1985 年提出利用病原介导使植物产生抗性，随后根
据病毒基因介导的各种抗病毒基因工程手段被大量
应用于多种植物中，从而使防治植物病毒病有了新
的有效的途径。向植物中导入与病毒部分序列同源
的单链或反向重复序列，在体内转录后通过基因沉
默机制使植物产生抗性，是植物获得抗性的一种有
效方法［3, 4］。利用插入外源片段使植物产生抗性受
多种因素的共同影响，下面主要就插入基因来源、
插入序列长度等几方面因素对抗性水平的影响进行
探讨。
1 不同来源插入片段对抗性的影响
1.1 外壳蛋白（coat protein, CP）介导的抗性
1986 年 , Powell 等［5］利用烟草花叶病毒（tobacco
mosaic virus, TMV）的 CP 基因进行了转基因诱导病
毒抗性试验发现，CP 基因诱导的保护水平从免疫到
延迟、减弱症状均有，其保护作用对该病毒的多个
株系均有效，甚至对分类地位相近的病毒也有效，
且其诱导的抗性可以遗传［6］。较早的研究者认为是
在蛋白质水平上产生了对病毒的抑制 ；也有研究者
提出对不同病毒其机制是不同的，从而导致产生不
同水平的抗性［7］。Ma 等［8］认为，由于 CP 基因在
水稻矮缩病毒（rice strip virus, RSV）分离物中的保
守性要强于非结构蛋白（disease-specific proein, SP）
基因，因此，导入了 CP 基因的转基因植物其抗性
多种外源因素对转基因植物抗性影响的研究进展
胡琼 张海松
（杭州万向职业技术学院，杭州 310023）
摘 要： 病毒病对植物的危害在近些年日益严重，培育抗病毒转基因植物是众多防治方法中较为有效的一种。转基因植物在
不同机制介导下会产生抗性，尤其是病毒基因介导的抗性试验最为普遍。众多研究证明，抗性受多种因素作用且表现为不同水平。
对插入序列来源、转录后 hpRNA长度、茎环比和拷贝数等多个因素在近些年的研究进展进行了综述，重点对各自在转基因植物抗
性产生中的特点及影响程度进行了分析，并对其他因素进行了展望。
关键词： 转基因植物 抗性 插入序列 hpRNA 拷贝数
Research Advances in Several Factors of Virus-resistance of
Transgenic Plants
Hu Qiong Zhang Haisong
（Hangzhou Wanxiang Polytechnic, Hangzhou 310023）
Abstract: Plant virus disease is more serious recently, and culturing virus-resistance of transgenic plants is one effective method.
Transgenic plants obtained virus-resistance by some mechanism, especially virus-gene derived resistance, and expressed different resistant
level functioned by many factors. This paper reviewed the advance in the research of insert gene sequences, hpRNA length, stem-loop ratio and
transgene copy number, mainly analyzed the feature and degree of influence of plant virus-resistance by those factors, looking forward about
others.
Key words: Transgenic plant Virus-resistance Insert gene sequences hpRNA Transgene copy number
2012年第4期 15胡琼等 ：多种外源因素对转基因植物抗性影响的研究进展
范围比导入 SP 基因的广泛。众多试验表明，CP 基
因是 RNA 干扰（RNA interference, RNAi）时最可能
被降解的靶标序列。
1.2 复制酶介导的抗性
Golemboski 等［9］最早报道了利用复制酶介导抗
性培育转基因植物，该转基因植物能明显抑制病毒
在接种部位复制，对 TMV-U1 病毒粒子和 RNA 接种
均表现高抗。而后期大量的试验证明，每一种类型
的转复制酶基因都可以获得高度抗性，有时缺失复
制酶基因比全长复制酶基因介导的抗性更为有效。
近些年众多研究转基因植物抗性的试验都是导入了
复制酶部分基因或与复制酶相关的某些基因，且获
得了抗性较高或较广的转基因植物，说明该酶序列
对植物产生或丧失抗性的重要性［10-12］。与外壳蛋白
介导的抗性相似，复制酶介导的抗性也存在一定的
局限性，即抗性比较单一，只对转入的该种病毒产
生抗性，甚至对该病毒的不同株系都可能是敏感的，
且病毒基因组的快速变异很容易使原先的抗性消失。
这也是利用复制酶介导的抗性所需要解决的一大
问题［13］。
1.3 运动蛋白介导的抗性
有研究表明，与 CP 或复制酶介导抗性机制相
比较，转缺失或突变或异源运动蛋白（movement
protein, MP）的植物能表达更广谱的抗性，而转化
了野生型的 TMV MP 基因则会加强病毒的侵染。试
验发现无论是何种来源插入片段诱导的抗性，其最
终出现的结果都有很大的不确定性。插入了能编码
移动蛋白的 pC4（protein C4）基因和核蛋白的 pC3
（protein C3）基因的反向重复序列后，转基因植物
则比天然抗性品种对水稻矮缩病毒（RSV）更具抗
性，而插入编码另外两种蛋白的基因则不表现为抗
性。故作者认为并不是所有 RNAi 结构都能在抗病
毒 RNA 时发挥作用，确认合适的病毒靶标基因（如
MP 基因）对有效地利用 RNAi 来防治病毒是非常重
要的［14］。正如 Shimizu 等［15, 16］所提到的，虽然靶
标一个与病毒复制有关的蛋白基因是 RNA 沉默诱导
抗性高低的关键，但对于不同的病毒群，该蛋白基
因是不同的。因此，要根据病毒不同的复制机制，
更多地关注蛋白基因的干扰作用与抗性级别之间的
关联信息，这样才能有助于更好地去选育有抗性的
植株。
2 转化载体中插入不同端位片段对抗性的
影响
在构建表达载体时，目的病毒基因组中的 3端
序列和5端序列是构建者优先采用的插入片段序列，
它使转基因植株表现出不同的抗性水平［17-19］。李鹏
等［20］分别用马铃薯 Y 病毒坏死株系（potato virus
YN, PVYN） CP 基因 5端和 3端的反向重复 cDNA
序列构建的植物表达载体对植物进行转化，也发现
PVY-CP 基因的 3端比 5端更能有效地诱发基因
沉默。在其研究中还发现，当转化 PVY CP 基因中
茎的长度缩减到 50 bp 时，用 3端 DNA 片段构建
的 hpRNA（hairpin RNA）能有效诱导基因沉默。朱
常香等［21］分别以 PVY CP 3端长度 100 bp、TMV
CP 3端长度 100 bp 和 CMV（cucumber mosaic virus，
CMV） CP 3端长度 200 bp 的 cDNA 构建反向重复结
构的植物表达载体 pRHPTC，转化后得到转基因烟
草经抗病性检测表明有 23％左右的转基因植株对这
3 种病毒均产生了抗性。而 Vanderschuren 等［11］试
验发现，与沉默相关的长链小 RNA 很可能只来自于
插入的发夹结构的 3、5端和内含子末端。说明这
些部位序列对转基因植物产生抗性的重要性。
3 转录后发夹 RNA长度对抗性的影响
在体外构建的反向重复结构序列在植物体内
转录后形成某种 dsRNA-hpRNA, 由双链的“茎”和
单链的“环”组成。茎是诱发基因沉默的关键部
位，且其长短和来源对 RNA 沉默的效率和稳定性有
较大的影响，也决定了转基因植株抗性的强弱和稳
定性［22, 23］。
3.1 双链“茎”的长度对抗性的影响
Wesley 等［24］研究发现，当插有 98-853 bp 反
向重复片段的不同表达载体 , 在转化后均会使转基
因植物的基因沉默效率高达 90% 以上 , 其中在茎的
长度为 400-800 bp 时，基因沉默的效率最为稳定，
即表现出的抗性最为稳定。2003 年 , Helliwell 等［25］
有类似报道，50-1 000 bp 长度的基因片段均能诱发
基因沉默使转基因植物表现抗性。李鹏等［20］也发现，
当长度为 300-600 bp 时，最可能出现高效的基因沉
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期16
默现象，从而可能使转基因植物表现为高抗或免疫
型。Fuentes 和 Bonfim 等［10, 26］认为，用于产生抗双
生病毒的包含内含子的发夹结构都含有长的内含子
和长于 400 nts 的发夹臂，故其假设抗性与发夹臂诱
导的高水平的小 RNA 有关。
3.2 单链“环”对抗性的影响
虽然环区段并不是诱发基因沉默的靶标部位，
但其长度可影响转基因转录后 hpRNA 的形成和稳定
性，最终会影响基因沉默所诱导的抗性的强弱。Zhu
等 ［17］利用 RNA 介导的抗病性分别转化 PVYN CP
基因 5端茎 202 bp（环 50 bp）和 3端 98 bp（环
50 bp）的 hpRNA 的烟草，其抗病率分别为 60% 和
70%。该试验中茎环的比例接近 4 l 或 2 1。后期
的研究发现 ：由于环的长度可影响转基因转录后
hpRNA 的形成和稳定性，如果在形成的 hpRNA 中
有适宜的如 4 1、2 1 和 1 1 的茎环比例时，则可
能获得高效基因沉默效率和高效基因克隆，从而获
得高抗植株［27，28］。作者推测可能是由于环的长度
增加导致环的灵活性增加，引起茎环结构的不稳定，
hpRNA 不能被有效切割 ；而短的环则相反。报道中
也提到，如果在相同载体中分别插入不同来源的环
序列也能使植株表现出不同程度的抗性。
4 转基因中拷贝数对抗性的影响
关于转基因中形成的拷贝数与抗性的关系问题，
比较早的是 Pang 等［29］在 1996 年提出的，其在研
究转基因莴苣时发现，该转基因植物抗病性很可能
与转基因的拷贝数成正相关。郭兴启等［30］对转化
了 PVYN CP 蛋白基因的多株转基因植株进行杂交分
析后发现，高抗、抗病及感病植株分别含有 5-6、3-4
和 1-2 个转基因拷贝，故其认为转基因植株的抗病
性与转基因的拷贝数成正相关。
随着基因工程手段的不断革新，转基因拷贝数
的插入模式已在多种作物中进行研究，如在番茄［10］
及谷类等［31］中。虽然早期的研究认为拷贝数与转
基因作物的抗性之间似乎存在一定的相关性，但近
些年的报道则认为两者之间并没有一定的关系 , 即
拷贝数与转基因潜在的沉默效率或抗性程度没有相
关性［31-33］。李鹏等［20］对转化了 PVYN CP 蛋白基因
的不同抗病性表型的多株转基因植株基因组进行了
杂交分析后也认为，转基因植株的抗病性与转基因
的拷贝数之间无明显的相关性。类似的报道也先后
出现在其他文章中［8, 34］。
5 讨论
转基因植物所表现的抗病性受一种或多种机制
共同介导，在植物体内多种因子和外界因素的共同
作用下决定转基因植物最后所表现的抗性水平。郭
兴启等［30］虽然认为转基因植株的抗病性与转基因
的拷贝数成正相关，但作者同时也提到在 T1 代转
基因植株中有些株系虽然含有多个拷贝数但仍表现
为感病 , 这意味着转基因植株的抗病性除与转基因
的剂量有关外，还可能与转基因插入方向、插入位
点、插入基因的序列、转基因的甲基化状况，以及
转基因植株的遗传特点等方面有关。抗性的广谱性
也是判断抗性好坏的一个指标，目前的试验报道有
多种结果［35, 36］。Vanderschuren 等［11］提到构建的
反向重复序列中如果能包含多个有效的小片段基因
序列，则有利于转基因植物在田间面对病毒多个株
系的混合侵染。另有大量研究报道转基因植株的抗
病性与转录产物 RNA 的积累量呈负相关，而与小
干扰性 RNA 的积累量呈正相关，即决定这两个指
标的因素也在一定程度上决定了转基因植株的抗
病性［10, 19, 37, 38］。
目前的研究认为，环境因子尤其是温度也可
以对抗性水平产生影响，低温（15℃）会使植物对
病毒抗性减弱，甚至终止 ；而高温通常会使症状
隐藏，使植物表现为抗性［39, 40］。Bonfim 等［26］报
道，当温度低于 15℃或高于 35℃时，小干扰 RNA
的积累量会有轻微地降低，但其并没有就温度不同
对抗性的影响做进一步研究。Hu 等［34］试验也发现
15℃下，转基因植物体内的小 RNA 积累量并没有比
24℃时明显地减少，而两种温度下植物的抗性也无
较大区别。因此低温（15℃）并不一定会影响转基
因植物的抗性。到目前为止，低温对转基因植物抗
性的影响研究还处于起步阶段。高抗或免疫型转基
因植物的获得是试验的主要目的，随着对抗性介导
机制的更深入了解和各种生物技术手段的广泛熟练
应用，关于抗性影响因素的研究在今后还会大量地
展开。
2012年第4期 17胡琼等 ：多种外源因素对转基因植物抗性影响的研究进展
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（责任编辑 狄艳红）