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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
同甜土植物相比，盐生植物具有较强的耐盐
碱能力，其中蕴含着丰富的耐盐碱基因资源，是研
究植物耐盐碱分子机制和分离耐盐碱基因的良好材
料。星星草（Puccinellia tenuiflora）是禾本科碱矛属
单子叶盐生草本植物，耐受 NaCl 的最高浓度可以
达到 600 mmol/L，耐受 Na2CO3 的浓度可以达到 200
mmol/L［1］，能在 pH9-10 以上的盐碱地上生长发育［2］。
对星星草耐盐碱性的生理学研究已经获得了较为系
统和全面的认识［1-5］。对星星草耐受 NaHCO3 的转录
应答分子机制的研究也取得了重要的进展［6-9］，鉴
定了 400 mmol/L NaHCO3 胁迫条件下星星草基因的
表达谱，以及 40 g/L （~476 mmol/L）NaHCO3 胁迫下
星星草的差异表达基因。
收稿日期 ： 2012-12-17
基金项目 ：哈尔滨师范大学青年学术骨干资助计划项目（09KXQ-01）
作者简介 ：付畅，博士，副教授，研究方向 ：生化与分子生物学 ；E-mail: fuchanghnu@yahoo.com.cn
盐碱地星星草根 cDNA 文库的构建及初步分析
付畅  王胜楠  郭敏
（哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，哈尔滨 150025）
摘 要 : 以盐碱地原位取材的星星草根为材料，利用 SMART 技术构建了 cDNA 文库。扩增后文库的滴度为 1.747×109 CFU/
mL，插入片段分布在 0.5-2 kb 之间，重组率为 92％。文库 ESTs 序列的初步分析表明，从盐碱地星星草根的 cDNA 文库中筛选到
耐盐相关基因 S-腺苷甲硫氨酸合成酶 2 基因和钙牵蛋白基因的 EST 片段。该文库可用于进一步从中筛选星星草耐盐基因。盐碱地
星星草根 cDNA 文库的构建为揭示星星草耐盐分子机制、挖掘星星草耐盐基因、培养耐盐植物奠定了重要基础。
关键词 : 盐碱地 星星草 根 cDNA 文库 表达序列标签
Construction and Preliminary Analysis of cDNA Library of Puccinellia
tenuiflora Roots Grown in Saline-alkaline Land
Fu Chang Wang Shengnan Guo Min
（College of Life Sciences and Technology，Harbin Normal University，Harbin 150025）
Abstract:  Puccinellia tenuiflora roots gathered from saline-alkaline land were used to construct a cDNA library by using SMAT
technology. The titer of the amplified cDNA library was 1.747×109 CFU/mL, the inserted fragments were distributed from 0.5 kb to 2 kb, and
the recombinant rate is 92%. Preliminary analysis of ESTs indicated that S-adenosylmethionine synthetase 2 gene and caltractin gene associated
closely with plant salt-responsive reactions were screened in this cDNA library, which can be used to further screen salt-tolerant genes from
Puccinellia tenuiflora. This cDNA library of Puccinellia tenuiflora roots laid important foundations for revealing salt tolerant mechanism in
Puccinellia tenuiflora, mining salt tolerant genes, and cultivating engineered salt-tolerant plants.
Key words:  Saline-alkaline land　Puccinellia tenuiflora　Roots　cDNA library　ESTs
根是植物抵御盐碱胁迫的第一道防线，根对
盐碱胁迫的敏感程度制约着整个植株的产量 ［10］。
植物感受盐胁迫信号后将其转变成引起根部生长
和发育变化的生理过程。盐胁迫下转录因子 AP2/
EREBP1207 和 MYB119 的表达水平在整个根部中的
变化微小，而在根尖中却被强烈诱导 ［11］。这提示我
们，以整株植物为材料分析盐胁迫下的差异表达基
因，可能会影响一些根部差异表达基因的检测。因此，
根是研究植物盐碱胁迫应答机制的重要位点。
本研究以盐碱地上生长的星星草的根为材料，
利用 SMART 技术构建 cDNA 文库，旨在为揭示星星
草耐盐分子机制、挖掘星星草耐盐基因、培养耐盐
植物奠定重要基础。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期70
1 材料与方法
1.1 材料
星星草根采自肇东盐碱地。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取及 mRNA 的分离 采用改进的
SDS 法［12］从星星草根中提取总 RNA，用无 RNA 酶
的 DNA 酶Ⅰ去除基因组 DNA 污染，再用 RNAclean
RNA 清洁纯化试剂盒（原平皓公司产品）纯化总
RNA。用 Gene Spec V 核酸蛋白分析仪测定总 RNA
的浓度和纯度。用 1.2% 的琼脂糖凝胶凝胶电泳检
测 总 RNA 的 完 整 性。 用 PolyATtract® mRNA Isola-
tion Systems（Promega 公司产品）从总 RNA 中分离
mRNA。
1.2.2 cDNA 文库的构建 以 0.5 μg mRNA 为模板，
按照 CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construct ion 试
剂盒（Clontech 公司产品）的说明书操作合成 cDNA
第一链， 然后以其为模板通过 LD-PCR（Long-distance
PCR）扩增合成双链 cDNA。利用 Sfi 限制性内切酶
酶切纯化后的双链 cDNA，用 CHROMA SPIN-400 柱
对双链 cDNA 进行分级分离。将分级分离后的双链
cDNA 连接到质粒载体 pDNR-LIB 上。将连接产物以
电转化方法（电压 1 800 V、电容 25 μF、电阻 200 Ω、
脉冲时间 5 ms）转化大肠杆菌感受态细胞 JM109。
1.2.3 cDNA 文 库 质 量 的 检 测 按 照 CreatorTM
SMARTTM cDNA Library Construct ion 试剂盒（Clontech
公司）说明书操作，测定文库的滴度。挑取转化平
板上的菌落，以载体引物 M13-f 和 M13-r 进行菌落
PCR 筛选，以确定插入片段的大小和文库的重组率。
PCR 反 应 体 系 为 ：1 μL 10×PCR 缓 冲 液，0.8 μL
dNTP（2.5 mmol/L），M13-f（10 μmol/L）和 M13-r（10
μmol/L）各 0.1 μL，0.1 μL rTaq （5 U/μL），用无菌牙
签在转化平板中蘸取菌落作为模板加入反应混合物，
加灭菌的去离子水至 10 μL。PCR 反应条件为 ：94℃
预变性 4 min ；94℃ 30 s，56℃ 30s，72℃ 30 s，作
30 个循环 ；最后 72℃ 延伸 10 min。
1.2.4 ESTs 的序列测定与功能注释 随机从平板上
挑取 25 个阳性重组子进行测序，利用 NCBI 网站上
的 VecScreen 程序去除载体序列，利用 Blastx 程序在
NCBI Nr 数据库中对 ESTs 序列进行相似性比对。
2 结果
2.1 盐碱地星星草根总RNA的提取与纯化
按照改进的 SDS 法提取盐碱地星星草根的总
RNA。用 DNase Ⅰ（RNase-free）对总 RNA 进行消化，
去除基因组 DNA 的污染，再用 RNA 清洁纯化试剂
盒纯化消化后的总 RNA。琼脂糖凝胶电泳的检测结
果（图 1）显示，28S rRNA 与 18S rRNA 条带清晰，
且其亮度比例达到 2∶1，表明 RNA 的完整性较好。
紫外分光光度法的检测结果显示，OD260/OD280 的比
值为 2.0，表明 RNA 的纯度较高，可以用于下一步
的反转录反应。
图 1 盐碱地星星草根总 RNA 的电泳检测
28S rRNA
18S rRNA
1 2 3 4
2.2 双链cDNA的合成
用 1％琼脂糖凝胶电泳检测合成的双链 cDNA，
结果（图 2）显示，双链 cDNA 片段分布在 0.5-2 kb
之间，表明合成的 cDNA 双链中具有较多的长片段，
达到构建 cDNA 文库的要求。
M 1 2
M ：DL2000 DNA Marker ；1，2 ：双链 cDNA 的 PCR 产物
图 2 双链 cDNA 的 LD-PCR 产物的电泳检测
2.3 cDNA文库滴度的测定
按 照 CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construct
ion 试剂盒说明书的操作，经过测定，扩增后文库的
滴度为 1.747×109 CFU/mL，已达到文库构建库容量
的要求。
2.4 cDNA文库重组率的计算
从转化平板上随机挑取 24 个单菌落，以载体引
物 M13-f 和 M13-r 进行菌落 PCR。用 0.8% 的琼脂糖
2013年第5期 71付畅等 ：盐碱地星星草根 cDNA 文库的构建及初步分析
凝胶电泳检测 PCR 产物的结果（图 3）显示，插入 片段在 0.25-1 kb 之间，文库的重组率为 92%。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
M ：DL2000 DNA Marker ；1-24 ：阳性重组子
图 3 插入片段的检测
2.5 cDNA文库ESTs的序列测定与分析
从转化平板上进一步挑取单菌落，以载体引
物 M13-f 和 M13-r 进 行 菌 落 PCR 筛 选。 随 机 挑 取
25 个阳性重组子进行测序，利用 NCBI 网站上的
VecScreen 程序去除载体序列，共测得 20 个 ESTs 序
列。通过 Blastx 程序在 NCBI Nr 数据库中对 20 个
ESTs 序列进行同源性比对的结果（表 1）表明，有
8 条序列没有在数据库中找到相似的序列，9 条序列
与数据库中的序列相似性较低，3 条序列与数据库
中的相似性较高。
表 1 盐碱地星星草根 cDNA 文库基因的 Blastx 分析结果
克隆号 功能注释 同源物种 相似性（%）
CYJDR3-17 S-腺苷甲硫氨酸合成酶 2 一粒小麦（Triticum monococcum） 100
CYJDR3-8 钙牵蛋白 玉米（Zea mays） 90
CYJDR3-10 假定蛋白 LOC100822101 二穗短柄草（Brachypodium distachyon） 84
3 讨论
3.1 盐碱地星星草根cDNA文库的构建策略与文库
质量评价
本研究采用CreatorTM SMARTTM cDNA Library Con-
struction Kit 构建了盐碱地星星草根的 cDNA 文库。
采用 LD-PCR 技术扩增双链 cDNA 的第二条链，可
富集文库中的低丰度以及稀有基因，提高文库的代
表 性 ；利 用 CHROMA SPIN-400 柱 对 cDNA 进 行 分
级分离，可有效除去小片段的 cDNA，可富集低丰
度的 mRNA 在文库中出现的频率，一方面保证了文
库的有效滴度 ；另一方面提高文库的代表性。扩增
后文库的滴度为 1.747×109 CFU/mL ；插入的最大片
段为 1 kb，插入的片段主要集中在 0.75 kb 左右 ；文
库的重组率为 92%。文库的质量符合构建 cDNA 文
库的要求。
3.2 cDNA文库ESTs序列的初步分析
编号为 CYJDR3-17 的 EST 序列与一粒小麦（Tr-
iticum monococcum）、二穗短柄草（Brachypodium dis-
tachyon）、玉米（Zea mays）、大麦（Hordeum vulgare
subsp. Vulgare）和茶树（Camellia sinensis）等众多物
种的 S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine
synthetase，SAMS）基因的氨基酸序列具有较高的相
似性，其中与一粒小麦、二穗短柄草和大麦的相似
性达到 100%。SAMS 基因编码 S-腺苷甲硫氨酸合成
酶，该酶可催化甲硫氨酸与 ATP 生成 S-腺苷甲硫氨
酸（S-adenosylmethionine，SAM）。SAM 在生物的生
命活动中发挥重要作用，不仅是激素、核酸、蛋白质、
磷脂等物质合成的甲基供体，还是多胺及乙烯合成
的前体物质［13］。SAMS 在植物逆境生理、衰老生理、
植物生物代谢中发挥重要作用［14］。SAMS 基因能被
外源乙烯、盐胁迫、渗透胁迫、氧化胁迫、高温胁迫、
低温胁迫、镉胁迫诱导表达［13，14］，广泛参与多种逆
境胁迫应答反应。
SAMS 基因在植物的盐胁迫应答中发挥重要作
用。盐胁迫下，SAM 参与植物激素、核酸、蛋白质
和磷脂等物质的合成 ；通过影响多胺和乙烯的含量
调节植株的耐盐性 ；参与植株木质化的形成，通过
质外体途径调节水分运输和离子吸收［13］。盐胁迫可
诱导 SAMS 基因的表达，盐胁迫下黄瓜 SAMS 基因
的表达呈现出先升高后降低的趋势［13］。野生大豆
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期72
SAMS 基因在烟草中的超量表达提高了转基因烟草植
株的耐盐性［14］。SAMS 基因是一个重要的耐盐相关
基因，我们从盐碱地星星草根的 cDNA 文库中筛选
到的 S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因 2 的 EST 片段，在
本研究工作的基础上可进一步通过 RACE 技术克隆
星星草 SAMS2 基因的全长 cDNA 以及 ORF，并鉴定
其功能。星星草 SAMS2 基因的克隆与功能鉴定有助
于理解植物逆境胁迫应答反应，可为该基因的利用
提供理论依据。SAMS2 基因可以作为植物耐盐基因
工程的候选工具基因，有望用于培育耐盐性较强的
植物品种，改良和利用盐碱地。
编号为 CYJDR3-17 的 EST 序列与玉米钙牵蛋白
基因的氨基酸序列具有较高相似性，达到 90％。钙
牵蛋白也被称为中心体蛋白，是真核生物基本 / 中
心体复合物的普遍组成成分，是与钙调素结构类似
的钙调 EF-hand 蛋白。Ko 等［15］从 1.7 mol/L NaCl 条
件下生长的杜氏盐藻（Dunaliella salina）的 cDNA
文库中分离了钙牵蛋白基因 DsCALT。这些信息表明，
钙牵蛋白与耐盐性密切相关。目前关于植物钙牵蛋
白基因的研究较少，深入研究植物钙牵蛋白基因的
功能，将有助于理解植物的耐盐分子机制。
4 结论
利用 SMART 技术构建了盐碱地星星草根的 cD-
NA 文库。扩增后文库滴度为 1.747×109 CFU/mL ；
插入的最大片段为 1 kb，插入的片段主要集中在 0.75
kb 左右 ；文库的重组率为 92%。文库的质量满足构
建 cDNA 文库的要求。从该文库中筛选到耐盐相关
基因 S-腺苷甲硫氨酸合成酶 2 基因和钙牵蛋白基因
的 EST 片段，表明该文库可用于进一步从中筛选星
星草耐盐基因。
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（责任编辑 李楠）