全 文 ：·综述与专论· 2013年第10期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
MicroRNAs 是生物体内一类长约 21-25 nt 的单
链非编码小 RNA，可以通过诱导信使 RNA 降解或
抑制其翻译成蛋白质而调节人类一半以上基因的表
达［1］。研究表明，microRNAs 功能涉及细胞发育、
造血、神经元形成、脂肪代谢、细胞增殖和凋亡等
各个方面［2，3］，其表达量的改变与许多疾病相关［4］。
而 microRNAs 因在循环血液中可以稳定存在［5］，使
它成为了从急性心肌梗死、充血性心力衰竭、药物
诱导的肝损伤到各种各样的恶性肿瘤广泛疾病或组
织损伤的非侵袭性潜在生物标志物［5-7］。
目前，RT-qPCR 因其定量准确、高灵敏性、高
重现性、检测线性范围宽等优势而被广泛的用于
收稿日期 ： 2013-05-16
基金项目 ：国家“十二五”重大专项基金资助项目（2012ZX09302002，2012ZX09505-001-003），国家自然科学基金项目（81273603）
作者简介 ：王雁，女，硕士研究生，研究方向 ：肝脏分子毒理学 ；E-mail ：hanyan20061123@126.com
通讯作者 ：马璟，女，博士，研究员，博士生导师，研究方向 ：药物毒理学 ；E-mail ：jma@ncdser.com
血浆/血清 MicroRNAs 定量分析的校正策略
王雁 汤纳平 邱云良 南雅萍 马璟
（中国医药工业研究总院 国家上海新药安全评价研究中心，上海 201203）
摘 要 ： 血液循环 microRNAs 表达量的变化与各种疾病及组织损伤的相关性研究备受关注。但细胞的污染，RNA 提取和处
理过程中的试验误差都会不同程度的影响 microRNAs 定量分析的结果。各种校正策略的使用可以消除这些影响因素。就目前使用
的不同校正策略的优缺点进行分析，便于研究者正确选择血液循环 microRNAs 定量分析的校正方法，从而获得准确可靠的生物学
意义上的变化。
关键词 ： RT-qPCR 循环 microRNAs 校正策略 内参基因
Normalisation Strategies for Plasma/Serum MicroRNAs
Quantitative Analysis
Wang Yan Tang Naping Qiu Yunliang Nan Yaping Ma Jing
（National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation and Research，China State Institute of Pharmaceutical Industry，
Shanghai 201203）
Abstract: In recent years, the researchs on assossication between the circulating microRNAs from blood and various disease or tissue
damage have attracted much attention. However, the imprecision of microRNAs concentrations may be caused by cellular contamination or
variance attributable to extract and process RNA. Several strategies have been proposed for normalising these causes. In this review we discuss
the relative advantages and disadvantages of different normalisation strategies and instruct researchers to choose a valid normalisation strategy
that will enable the measurement of biologically meaningful results.
Key words: RT-qPCR Circulating microRNAs Normalisation strategies Reference genes
microRNAs 的定量检测尤其是血液循环中 microRNAs
的 检 测。 然 而 一 些 潜 在 的 影 响 因 素 使 分 析 循 环
microRNAs 表达变化的精确性和可靠性得到挑战 ：
首先，血浆或血清中 microRNAs 的表达量并不像组
织中 microRNAs 具有高丰度的表达，其表达量较
低，据文献报道，血浆中 total RNAs 的含量在 6-300
ng/mL［8，9］，而 microRNAs 仅占很少的比例［5］；其次，
循环 microRNAs 提取中抑制剂的引入，反转录和扩
增效率的不同都会对循环 microRNAs 的测量结果造
成差异。因此选择合适的策略来校正这些误差对于
获得准确的 microRNAs 定量结果至关重要。但实际
上，选择合适的校正策略对于循环 microRNAs 定量
2013年第10期 53王雁等 ：血浆 / 血清 microRNAs 定量分析的校正策略
分析来说仍是一个难题。
1 血液循环 microRNAs 分析过程中的可能影
响因素
如图 1 所示，血液循环 microRNAs 的分析主要
包括 4 个步骤 ：（1）血清或血浆样本的制备 ；（2）
RNA 的 提 取 ；（3）RNA 的 逆 转 录 ；（4） 使 用 RT-
qPCR 对 microRNA 表达水平进行检测。由于循环
microRNAs 检测技术流程涉及多个环节，因此每一
步骤误差的控制对于血液循环 microRNAs 的最终定
量结果都至关重要。首先，血浆或血清的制备是首
要考虑的问题，如血浆 / 血清标本收集时潜在的残
余细胞污染 ；其次，血浆 / 血清样品中脂类及蛋白
质成分的高低可能会对 RNA 抽提产生影响，导致不
同样品总 RNA 抽提效率产生差异 ；最后，不同血
浆 / 血清样本总 RNA 逆转录酶或 DNA 聚合酶反应
效率的不同，人为的试验技术操作误差等。这些潜
在的影响因素都将会最终影响血液循环 microRNAs
的准确定量。因此，选择合适的校正策略以减少检
测标本间的差异是必须的。目前被提倡用于血浆
microRNAs 定量分析的校正策略，见表 1。
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图 1 血液循环 microRNAs 分析的整个流程
表 1 常用血浆 microRNAs 定量分析校正方案
校正方法 优点 缺点 注释
样品质量的评价 避免了不必要的消耗 没有统一规范化的方法 血液循环 microRNAs 分析前的挑战
样本体积 相对容易 该方法不能控制 RT-qPCR 过程中酶的
逆转录和扩增效率
是比较简单的降低试验误差的第一步
外源校正基因（Spike-in
Control）
可以校正 cDNA 合成和 PCR
扩增反应的效率
不能校正样本的初始量，与血液循环
内源性 microRNAs 的稳定性与提取效
率不同
其可靠性具有争议
内参基因 与目标 microRNAs 处于相
同的条件下，可以校正 RT-
qPCR 中的每一步误差
需要筛选适合自身试验体系的稳定的
内参基因
是目前比较理想的校正方法
2 样品质量的评价
样品质量的评价是血液循环 microRNAs 准确
定 量 关 键 的 第 一 步。Kirschner 等［11］ 通 过 检 测 全
血、血浆、红细胞和外周血单个核细胞中 miR-16 和
miR-451 的表达水平发现，miR-16 和 miR-451 在红
细胞中高表达，且他们在血浆中的浓度随着溶血程
度的加重而显著性升高。Pritchard 等［12］通过分析目
前文献已经报道的肿瘤相关的血液循环 microRNAs
生物标志物，发现在这些 microRNAs 中 58% 的循
环 microRNAs 在一个或多个血细胞类型中高度表
达，进一步研究表明溶血或血细胞污染可以使血浆
中某些 microRNAs 的水平升高甚至 50 倍以上。溶
血或血细胞污染对血液循环 microRNAs 表达水平的
干扰，直接影响到疾病状态或组织损伤下血液循环
microRNAs 表达变化的正确解释。因此，在对血浆
或血清样本 microRNAs 分析前，首先要对样本的质
量进行评价，排除溶血或细胞污染的样本，从而节
省了对质量不高样本继续分析的成本。为了保证制
备血浆或血清的质量，国家癌症研究所早期检测研
究网络（EDRN）最近出版了关于血浆和血清处理的
标准操作规程［13］，Kroh 等［14］建议在收集血浆时最
好采用 EDTA 和柠檬酸抗凝剂，而肝素钠抗凝剂将
会抑制后续 PCR 的扩增。
试验过程中，我们可以通过测定游离血红蛋
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期54
白含量作为溶血程度的判定指标。使用简单、性价
比高的分光光度计方法，测定氧合血红蛋白在波长
414 nm 处的吸光度值，通过对其特有的吸收峰的
判断可以及时的排除具有溶血现象的样本从而避免
了下游成本比较高的处理步骤［15］。如果是检测已
经纯化的 RNA 是否有血细胞的污染，可以直接检
测红细胞富集的 miR-451 和 miR-144［16］。但是这些
microRNAs 也会受其他因素的影响，如疾病、组织 /
器官损伤而变化，因此简单的阈值检测不能作为溶
血或血细胞污染指标。我们需要进一步确定在血细
胞，如红细胞中特异性表达的 microRNAs，来监测
是否有溶血或细胞污染。
值 得 注 意 的 是， 并 不 是 所 有 的 血 液 循 环 中
microRNAs 的检测都需要考虑溶血的影响。例如，
McDonald 等［10］在比较溶血样本和未溶血样本中血
浆 microRNAs 表达变化时发现，血清中 miR-16 和
miR-15b 在溶血样本中含量明显增加，而 miR-122 却
没有显著性的改变。因此，对于那些由特定的组织
分泌而血细胞中不存在的 microRNAs，可以不考虑
这些影响因素。但是这些组织特异性的 microRNAs
需要经过大量的试验筛选和验证。
3 血液循环 microRNAs 的 RT-qPCR 结果的
校正
基因表达定量的最终结果会有两种可能的变化：
一种是技术上或是操作上的误差 ；另外一种是真正
的生物学上的差别。任何一种校正策略都是为了尽
量减少试验技术或操作上的误差，从而检测到生物
学意义上真正的变化。因此，尤其是对于那些变化
幅度比较小的基因，选择合适的校正策略对于潜在
生物标志物的发现具有很重要的意义。目前，用于
血浆 / 血清 microRNAs RT-qPCR 结果的校正方法主
要包括血浆 / 血清体积、外源性小 RNAs 和内源性
校正基因。
3.1 血浆/血清体积
通过使用相同体积的血浆或血清，可以初步的
降低试验样本之间的误差，也是一个最简单最容易
实现的校正方法。Su 等［17］和 Farid 等［18］在检测药
物诱导肝损伤的血液循环 microRNAs 表达时，考虑
到 microRNAs 常用的内参基因 U6 或 5S 在血浆或血
清中容易降解或表达较低，而建议通过控制血浆或
血清的体积对 microRNAs 的定量结果进行校正。但
是 Song 等［19］通过对胃癌患者血清中 microRNAs 定
量表达的不同校正方法的比较发现，使用相同的血
样体积并不能很好的校正不同样本之间 microRNAs
的检测结果，甚至对于变化比较小的基因来说，很
可能会得到错误的结论。因此，虽然通过使用相
同体积的血浆或血清来控制样本的初始量比较方
便，可以初步的降低不同样本之间的试验误差，但
是其不能单独的校正 microRNAs 的提取、逆转录
及扩增效率的差异，需要结合其他方法一起来校正
microRNAs 定量分析的结果。
3.2 外源校正基因（Spike-in control）
通过加入与血浆 / 血清等体积的外源 RNAs，如
线 虫 miR-39、 线 虫 miR-54、 线 虫 miR-238 等， 不
仅可以校正不同样本之间 RNA 提取效率及 cDNA 合
成效率，而且还被用来校正 microRNAs 的 PCR 结
果［20， 21］， 但 是 关 于 该 校 正 方 法 的 可 靠 性， 到 目
前 为 止 仍 有 争 议。 例 如， 考 虑 到 合 成 或 纯 化 的
microRNAs 并不像血浆里 microRNAs 可以以蛋白复
合体或包裹在微囊中的形式存在从而抵制 RNAase
的降解，因此其提取效率及稳定性可能不同。Arroyo
等［22］在研究血浆 / 血清 microRNAs 的稳定性时发
现，当纯化的 microRNA 加入血浆 / 血清中时会立即
降解。因此，spike-in control 虽然可以用来监测不同
样本 microRNAs 的逆转录和扩增效率，但是它不能
单独校正由 RNA 提取过程中所造成的误差，并不是
血浆 / 血清 microRNAs 理想的校正因子。
3.3 内参基因
使用血浆 / 血清内源性基因校正 microRNAs 的
RT-qPCR 结果是目前广泛使用的另外一种校正策略。
理想的内参基因应该是在不同的试验体系或样品类
型中均表达恒定。
目前血浆 / 血清 microRNAs 定量常用的内参基
因主要是默认的未经试验证实的一些传统的内参基
因，如 U6 snRNA、5S 和 miR-16。但是目前有研究
报道，U6 等一些小 RNA 在血浆中表达量较低，因此，
在同样的稀释倍数下，很难同时检测到目标 micro-
RNA 及小 RNA 的转录产物［19］。此外，在肝癌患者
2013年第10期 55王雁等 ：血浆 / 血清 microRNAs 定量分析的校正策略
血浆中检测到 U6 表达下调［23］，而 5S 等普遍使用的
内参基因也被证明并不是在所有的试验条件下恒定
表达［24］。因此，常用的内参基因并不适合血浆 / 血
清 microRNAs 的定量分析。
研究证明，并没有在所有试验条件或样品类型
下表达恒定的内参基因。例如，let-7a 和 miR-16 在
正常和乳腺癌症组织中表达稳定，但是它们却不适
用于肺癌患者中 microRNAs 定量的校正［25，26］，因此，
不同的试验需要筛选适合各自试验体系的特异性稳
定表达的内参基因。
Vandesompele 等［27］、Pfaffl 等［28］ 和 Andersen
等［29］分别编写了 GeNorm、BestKeeper 和 NormFin-
der 算法用于特定试验条件下内参基因稳定性的
筛选。GeNorm 软件通过对各候选内参基因在不同
样品中的表达稳定性（M）的分析来确定最稳定
的内参基因，M 值越大，基因稳定性越差，该软
件具体的评价原理及试验设计原则可以参考网址
http ：//genomebiology.com/2002/3/7/research/0034。
BestKeeper 软件分析主要以标准变异系数（SD）和
变异相关系数（CV）来判断内参基因的稳定性，其
中 SD 越小，CV 值越小，表明该基因越稳定，该
软件可以免费在 http ：//www.gene-quantification.info/
下载。不同于以上两个软件，NormFinder 软件综
合评价了候选内参基因在同一组内和不同组间表
达的稳定性，其软件可以免费在 http ：//www.mdl.
dk/publicationsnormfinder.htm 获得。近年来，许多研
究者通过联合使用以上 3 种软件筛选和确定了适用
于一些试验体系或样品类型 microRNAs 定量分析的
稳定表达的内源性校正基因。如 Peltier 等［25］ 通过
对正常组织和癌症患者 microRNAs 表达谱的分析，
结合 GeNorm 和 NormFinder 软件，确定了在癌症患
者组织样本中稳定表达的内参基因 miR-191 和 miR-
103 ；Lardizabal 等［30］ 通过使用 GeNorm、NormFinder
和 BestKeeper 软件，对不同药物诱导的肝损伤类型
肝脏组织中的候选内参基因的稳定性进行评价，结
果证明，肝脏组织 miR-16 和 5S 在不同类型药物性
肝损伤的肝脏组织中表达比较稳定 ；Song 等［19］ 结
合 GeNorm、NormFinder 和 BestKeeper 软件对胃肠癌
患者血清中候选内参基因的稳定性进行了分析，结
果表明，血清 miR-16 和 miR-93 均可以用于胃肠癌
患者血清 microRNAs RT-qPCR 结果的校正。
另外，Vandesompele 等［25］提倡使用多个内参
来校正 microRNAs 的定量数据，通过选择 2 个以上
而不是传统地使用单一内参基因，有利于校正系统
偏差，可以得到更可靠的定量结果。然而，在样本
量比较少的情况下，且从控制成本上说，多个内参
基因并不一定是最佳的选择。
4 展望
血液检测是目前临床上最常用的检测手段，其
结果对于发现生理和病理状态的改变有重要的提
示作用。MicroRNAs 因为其高度稳定性，保守性，
组织特异性和时序性等特点［31］，而成为了目前疾
病诊断和治疗的研究热点。研究表明血浆 / 血清
microRNAs 的表达变化与临床疾病及组织损伤有很
好的相关性，显示出良好的应用前景。然而血液循
环 microRNAs 分析前和分析过程中，血液样本溶
血或血细胞污染、RNA 提取过程中抑制剂的引入、
cDNA 合成和 PCR 扩增效率的变化都会不同程度的
影响 microRNAs 的定量结果。只有这些因素被考虑
或消除，血液循环中 microRNAs 的升高或降低才能
被认为是疾病或组织损伤有意义的指标。
目前，出现了许多不同的策略来校正血液循环
microRNAs 定量分析过程中固有的和试验技术上的
误差。这些方法并不是相互独立的，我们推荐各种
校正方法的结合，例如使用相同体积的血样，消除
不同样本之间初始量的误差 ；溶血的检测，以确保
样本的质量 ；结合稳定表达的内参基因对 RT-qPCR
分析数据进行校正。因此，循环 microRNAs 实时定
量分析过程中不同校正策略的联合使用可以最大化
的降低试验技术上的误差，保证了研究者对血液循
环中 microRNAs 表达变化的正确解释。
总之，校正方法的选择直接影响到血液循环
microRNAs 的检测结果，而每一种校正方法都有
其优缺点，因此试验过程中必须谨慎选择，提高
试验结果的精确度和可靠性。从而促进血液循环
microRNAs 生物标志物在各种疾病和组织损伤中的
发现和应用。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期56
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（责任编辑 李楠）