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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第12期
食品中微生物污染是影响我国食品安全的主要
因素之一，每年约 38%-56% 的食源性疾病是由细
菌感染而导致［1］。因此，快速、准确检测食源性致
病菌是直接影响食品安全的重要因素。基于核酸检
测的分子生物学技术，是近些年感染性疾病临床实
收稿日期 ： 2013-06-06
基金项目 ：国家重大传染病防治科技重大专项（2008ZX10004-001）
作者简介 ：高兴，男，主管技师，博士研究生，研究方向 ：细菌检测新技术 ；E-mail ：gaolao6688@aliyun.com
通讯作者 ：王景林，男，研究员，博士生导师，研究方向 ：细菌和毒素检测与防治 ；E-mail ：wangjl6481@hotmail.com
11 种（株）食源性细菌基因芯片检测方法的建立
高兴  辛文文  高姗  康琳  王景林
（军事医学科学院微生物流行病研究所 病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071）
摘 要： 建立多重 PCR 反应结合基因芯片技术的 11 种（株）食源性致病菌检测方法。以金黄色葡萄球菌、志贺菌、霍乱弧菌、
单增李斯特菌等 11 种（株）食源性细菌的特异性基因为靶基因，利用 Premier 5.0 和 Oligo 6.0 软件设计引物和探针，BLAST 比对
分析特异性。寡核苷酸探针点制醛基玻片制备基因芯片，13 对引物分为 3 组扩增，PCR 产物混合后与基因芯片杂交检测。鼠伤寒
沙门菌、产气荚膜梭菌、奇异变形杆菌等 11 种（株）细菌使用该方法检测均能准确鉴定，基因组 DNA 灵敏度为 10-100 pg，6 组
模拟 DNA 混合样本芯片检测结果与预期一致，18 株沙门菌临床分离株检测均为阳性。从样本 PCR 扩增开始至检测完成，整个操
作时间不超过 3 h。该方法能够对 11 种（株）食源性致病菌快速准确鉴定，可以满足部分食源性致病菌通量检测的要求，具有较
好的临床应用前景。
关键词 ： 食源性细菌 基因芯片 多重 PCR 特异性基因 检测
Development of a DNA Microarray for Detection of 11
Food-borne Pathogens
Gao Xing Xin Wenwen Gao Shan Kang Lin Wang Jinglin
（State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity，Institute of Microbiology and Epidemiology，Academy of Military Medical Sciences，
Beijing 100071）
Abstract:  It was to develop a microarray technique coupled with multiplex PCR for the detection and identification 11 food-borne
pathogens. The specific gene of each pathogen such as Staphylococcus aureus, Shigellae, Vibrio cholerae and Listeria monocytogenes was chosen
as the amplification target. The primers and probes were designed by Premier 5.0 and Oligo 6.0, and then were validated by BLAST. The
oligonucleotide probes were immobilized on aldehyde-coated slides, and thirteen pairs of primers were divided into three groups. After the mixed
PCR products had hybridization with DNA microarray, the hybridization images were acquired by ScanArray software. 11 food-borne bacteria
such as Salmonella typhimurium, Clostridium perfringens and Proteus mirabilis were successfully identified by the array, and the detection limit
of this assay was around 10-100 pg. The corresponding hybridization maps of six mixed bacteria DNA samples were obtained, and eighteen
clinical isolates of Salmonella spp. were successfully tested. The testing process from PCR can be completed within 3 h. The results indicated
that the method can be applied to identify 11 food-borne pathogens rapidly and accurately, and can meet the flux detection demand of multiple
food-borne bacteria and has good prospect of clinical application.
Key words:  Food-borne pathogens DNA microarray Multiplex PCR Specific gene Detection
验室诊断中发展最快速的领域［2］，特别是基因芯片
技术的发展和应用，大大提高了病原微生物的检测
通量。本试验选取 11 种（株）食源性致病菌的毒力
基因等特异性基因为靶基因，建立基于多重 PCR 扩
增的 11 种（株）食源性细菌基因芯片检测方法，并
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期124
进行初步考核。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 本试验所用菌株（表 1）均由军事医
学科学院微生物流行病研究所菌种库提供，18 株沙
门菌临床分离株由中国疾病预防控制中心（CDC）
提供。
表 1 试验菌株名称及编号
菌株 拉丁名 编 号
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ATCC 6538
鼠伤寒沙门菌 Salmonella typhimurium CMCC 50707
痢疾志贺菌 Shigella dysenteriae CMCC 51197
肠致病型大肠杆菌 Enteropathogenic Escherichia coli CMCC 44737
肠出血型大肠杆菌
（O157）
Enterohemorrhagic Escherichia coli CMCC 44752
单增李斯特菌 Listeria monocytogenes CMCC 54001
奇异变形杆菌 Proteus mirabilis CMCC 49005
O1 型霍乱弧菌 Vibrio cholerae 60084
产气荚膜梭菌 Clostridium perfringens C60-2
A 型肉毒梭菌 Clostridium botulinum type A 62A
B 型肉毒梭菌 Clostridium botulinum type B 621
1.1.2 主要试剂及仪器 PCR 相关试剂购自大连宝
生物公司，UNG 酶（Uracil-DNA Glycosylase） 购自
上海闪晶公司，细菌基因组 DNA 提取试剂盒购自
北京天根（TIANGEN）公司，醛基芯片购自上海百
傲公司，DYY-6C 型电泳仪购自北京六一仪器厂，
T-personal 型 PCR 仪（Biometra，德国），GmbH 凝胶
图像分析管理系统（Biostep，德国），ND-1000 紫外
分光光度仪（Nanodrop，美国），SpotArray 72 点样仪、
ScanArray Gx Plus 扫描仪（PerkinElmer，美国）。
1.1.3 引物和探针设计 选取 11 种食源性细菌特异
性基因作为靶基因，使用 Premier 5.0 和 Oligo 6.0 软
件设计引物和探针，引物长度为 20-25 mer，注意
避免发卡结构和二聚体形成等，探针长度为 40-50
mer，所有引物和探针进行 BLAST 比对确保特异性。
选择细菌 16S rRNA 序列作为阳性对照，寄生虫基
因探针作为阴性对照，丙肝病毒探针作为定位探针，
探针和引物均由上海生工公司合成并进行标记修饰，
序列见表 2。
1.2 方法
1.2.1 基因芯片制备 寡核苷酸探针用 MilliQ 水稀
释成 100 μmol/L，DMSO（二甲基亚砜）稀释至终浓
度 40 μmol/L，每种探针取 10 μL 置于 384 孔板中，
点样仪点制到醛基基片上，每种探针重复 3 点，点
样模式见图 1。点样后芯片室温放置 24 h，0.2 % 硼
氢化钠溶液浸泡 5 min，使用 0.2 % SDS 溶液摇洗 2
min，再用蒸馏水漂洗，晾干备用。
图 1 基因芯片点样模式图
HCV-P HCV-P HCV-P 16S-P 16S-P 16S-P Tg-P Tg-P Tg-P
ipaH-P ipaH-P ipaH-P rfbE-P rfbE-P rfbE-P bfpA-P bfpA-P bfpA-P
ipa-P ipa-P ipa-P UreR-P UreR-P UreR-P invA-P invA-P invA-P
ttrB-P ttrB-P ttrB-P bontA-P bontA-P bontA-P ctxA-P ctxA-P ctxA-P
cpa-P cpa-P cpa-P nuc-P nuc-P nuc-P bontB-P bontB-P bontB-P
H2O H2O H2O H2O H2O H2O HCV-P HCV-P HCV-P
1.2.2 多重 PCR 扩增 各菌种在适宜条件下培养，
使用试剂盒提取基因组 DNA，按照说明书操作。为
减少引物对间的交叉反应，引物分组进行扩增，产
物通过琼脂糖凝胶电泳观察引物组合的可行性。基
本的多重 PCR 体系 ：2.5 μL 10×PCR Buffer，dATP、
dGTP、dCTP、dUTP（均为 2.5 mmol/L）2 μL，dTTP
（2.5 mmol/L）1 μL，rTaq 酶（5 U/μL）0.4 μL，UNG
酶（1 U/μL）0.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 0.5
μL，模板 1 μL，补充 MilliQ 水至 25 μL。扩增条件
为 ：25℃ 10 min，95℃ 4 min ；94℃ 30 s，58℃ 30 s，
72℃ 30 s 共 30 个循环 ；72℃ 5 min 。
1.2.3 芯片杂交试验 PCR 产物混合后煮沸 3 min，
迅速置于冰上 5 min，与杂交液按 1∶1 比例混匀，
10 μL 杂交混合液（5×SSC，0.2 % SDS，2 % 甲酰胺，
5×Denhardt’s）加入芯片的杂交区域，50℃杂交 1
h，分别用洗液 A（1.8×SSC、0.1 % SDS）、洗液 B
（0.5×SSC、0.1 % SDS）和洗液 C（0.5×SSC）摇洗
3 min，离心甩干后扫描检测。阳性信号判断标准为
探针绝对荧光中位置（F532Median-B532）≥ 800 ；
信噪比（Signal noise ratio，SNR）≥ 2.5 ；探针 3 点
重复中至少 2 点符合上述要求，认定为阳性探针。
1.2.4 特异性和灵敏度试验 所建立的基因芯片方
法对痢疾志贺菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌等供
试菌种进行检测。金黄色葡萄球菌 DNA 倍比稀释，
分别取 1 μL 作模板进行多重 PCR 扩增，将金黄色
葡萄球菌引物的多重 PCR 产物 5 μL 琼脂糖凝胶电
泳，同时对应扩增产物混合后与基因芯片杂交检测，
2013年第12期 125高兴等 ：11 种（株）食源性细菌基因芯片检测方法的建立
表 2 探针和引物序列
菌种及靶基因 引物 / 探针名称 引物与探针序列（5-3） 产物大小（bp）
痢疾志贺菌 /ipaH ipaH-F GTGAACAGGTCGCTGCATGGCT 398
ipaH-R Cy3-GGCAGTGCGGAGGTCATTTGCT
ipaH-P NH2-CTCCTGGTCCATCAGGCATCAGAAGGCCTTTTCGATAATGATACCG
金黄色葡萄球菌 /nuc nuc-F CGAAAGGGCAATACGCAAAGAGGT 335
nuc-R Cy3-TGCACTTGCTTCAGGACCAT
nuc-P NH2-gtgttaactttagttgtagtttcaagtctaagtagctcagcaaatgcatc
单增李斯特菌 /iap iap-F GCGGGAGCTGGTTTTGCAGCTT 488
iap-R Cy3-AGCACTCCTGTTGCACCAACACA
iap-P NH2-tttaggcgcaggtgtagttgcttgtgtagtttgttttacttcagtt
肠致病型大肠杆菌 /bfpA bfpA-F Cy3-CTGCAACCGTTACTGCCGGTGT 464
bfpA-R CGCACATACAGTTGCCGCCTCA
bfpA-P NH2-ccagtataactggtctgcccaatatacagaccattaattgcagacgttg
鼠伤寒沙门菌 /ttrB ttrB-F ACAGACGCGGCAACAGCACATT 179
ttrB-R Cy3-CCGACACCGTTACGCCATGCTT
ttrB-P NH2-tgttcgaccgtcgtacgaaacgcgccttgcggcgtttggttttc
invA invA-F AAGCGCGTTCCGCAACACAT 473
invA -R Cy3-AACGTAGCGCCGCCAAACCT
invA-P NH2-cggcacaagtaatatcaacggtacggtctctgtagagactttatcgagat
肠出血型大肠杆菌（O157）/rfbE rfbE-F AGATTGCGCTGAAGCCTTTGGTTCT 497
rfbE-R Cy3-ACATTGGCATCGTGTGGACAGGG
rfbE-P NH2-ATTTTAAAGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCAATATTGGCATG
奇异变形杆菌 /UreR UreR-F ggggtgccatgttcaagcggta 332
UreR-R Cy3-ccgatgatcgcgatggtatatggtgc
UreR-P NH2-agtaacgtaaaattagttttaaccacctcaggtgttgatagatgataatc
O1 型霍乱弧菌 /ctxA ctxA-F TGCAAGAGGAACTCAGACGGGA 430
ctxA-R Cy3-ACAACCCGGCGGTGCATGAT
ctxA-PB NH2-GCATACAGTCCTCATCCAGATGAACAAGAAGTTTCTGCTTTAGGTGGGAT
A 型肉毒梭菌 /bontA bontA-F Cy3-cgcgaaatggttatggctct 291
bontA-R actttgcatcatgtccccca
bontA -P NH2-CTCCTCAAAACCAAATGTAAAATCTGGGCTAAATCTAATGTATTGAG
B 型肉毒梭菌 /bontB bontB-F TCAGTAATCCAGGAGAAGTGGAG 410
bontB-R Cy3-GCTGGGATCTTGTCCTCCAAAT
bontB-P NH2-ATGCAATCTACAGATGCTATACAGGCAGAAGAACTATATAC
产气荚膜梭菌 /cpa cpa-F ACCTGACACAGGGGAATCACAA 393
cpa-R Cy3-GCTGCATAATCCCAATCATCCCA
cpa-P NH2-gcactattttggagatatagatactccatatcatcctgctaatgttac
16S rRNA 16S-F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 575
16S-R Cy3-CGTATTACCGCGGCTGCTG
16S-P NH2-ttttttttttttACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
寄生虫 Tg-P NH2-gaggtcatatcgtcccatgaagtcgaccacctgtttcc
定位探针 HCV-P NH2-AGAGCCATAGTGGTCT-Cy3
F ：正向引物 ；R ：反向引物 ；P ：探针 ；Cy3 ：荧光修饰 ；NH2- ：氨基修饰
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期126
肠出血型大肠杆菌 DNA 进行 10 倍稀释后，各浓度
均取 1 μL 作模板进行基因芯片检测，观察灵敏度。
1.2.5 模拟 DNA 混合样本与沙门菌临床分离株检
测 为验证本方法的多重检测能力，制备 6 组 DNA
混合样本（表 3），进行多重 PCR 扩增和基因芯片
杂交检测 ；使用该方法检测 18 株沙门菌临床分离株
DNA。
表 3 模拟混合 DNA 样本组成
分组 样本组成
A A 型肉毒梭菌、肠出血型大肠杆菌（O157）、金黄色葡萄球菌
B 奇异变形杆菌、鼠伤寒沙门菌、单增李斯特菌
C 肠致病型大肠杆菌、O1 型霍乱弧菌
D 鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、A 型肉毒梭菌
E 肠致病型大肠杆菌、肠出血型大肠杆菌（O157）、单增李斯特菌
F B 型肉毒梭菌、产气荚膜梭菌
2 结果
2.1 多重PCR扩增
13 对引物分 3 个体系进行扩增，调节引物终浓
度使各 PCR 产物产量尽量均衡，分别取 5 μL 使用 3
% 琼脂糖凝胶电泳，结果（图 2）显示在各 PCR 体
系中，单种细菌模板均能得到对应的目的条带，但
多种细菌模板共同扩增时，由于部分 PCR 产物片段
大小相近，电泳检测不能有效区分。
2.3 芯片灵敏度试验
金黄色葡萄球菌 DNA 多重 PCR 产物电泳结果
见图 4，PCR 体系中 DNA 含量为 100 pg 时可以看到
目的条带，DNA 含量为 10 pg 的 PCR 产物基本无电
泳条带。肠出血型大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 DNA
基因芯片检测结果见图 5，当 PCR 体系中含量分别
为 100 pg 和 10 pg，检测结果符合阳性判断标准，而
两种细菌 DNA 含量分别为 10 pg 和 1 pg 时，虽然对
应探针有一定的荧光信号，但达不到阳性结果判断
标准，所以两种细菌芯片检测的灵敏度分别为 100
pg 和 10 pg。1 2 3 4 5 6 M 12 13 14 15 16 17 M7 8 9 10 11 M
1：单增李斯特菌；2：O1 型霍乱弧菌；3：产气荚膜梭菌；4：金黄色葡萄球菌；
5：1-4 四种混合细菌；6、11、17：H2O；7：痢疾志贺菌；8：鼠伤寒沙门菌；9：
A 型肉毒梭菌 ；10 ：7-9 三种混合细菌 ；12 ：肠致病型大肠杆菌 ；13 ：肠出
血型大肠杆菌（O157）；14 ：奇异变形杆菌 ；15 ：B 型肉毒梭菌 ；16 ：12-15
四种混合细菌 ；16S rRNA 575 bp ；M ：DL500 分子量标准（自上而下 500、
400、300、200、150、100、50 bp）
图 2 多重 PCR 扩增产物电泳图
2.2 芯片特异性试验
11 种食源性细菌检测获得的阳性信号均属于
各自特异性探针位置（图 3），表明该方法的特异性
良好。
A B C D
E F G
I J K
H
A ：鼠伤寒沙门菌 ；B ：痢疾志贺菌 ；C ：肠出血型大肠杆菌（O157）；D ：
肠致病型大肠杆菌 ；E ：O1 型霍乱弧菌 ；F ：金黄色葡萄球菌 ；G. ：单增李
斯特菌 ；H ：奇异变形杆菌 ；I ：A 型肉毒梭菌 ；J ：B 型肉毒梭菌 ；K ：产气
荚膜梭菌
图 3 11 种细菌芯片检测结果
M 1 2 3 4 5 6
1-6 ：分别为 10 ng/μL-100 fg/μL 金黄色葡萄球菌 DNA 的多重 PCR 产物 ；
M ：2K Plus DNAMarker（ 自 上 而 下 5000、3000、2000、1000、750、500、
250、100 bp）
图 4 金黄色葡萄球菌 DNA 多重 PCR 产物电泳图
2.4 模拟混合DNA样本及临床分离株检测
细菌 DNA 混合样本检测结果见图 6，阳性信号
探针均属于靶细菌位置，表明该芯片可用于细菌混
合样本检测。18 株沙门菌临床分离株 DNA 芯片检
2013年第12期 127高兴等 ：11 种（株）食源性细菌基因芯片检测方法的建立
测均为阳性。部分芯片检测图谱，见图 7。 寒沙门菌、痢疾志贺菌等食源性细菌作为检测对象，
以各菌特异性基因为靶基因，初步建立了基于多重
PCR 的 11 种（株）食源性细菌基因芯片检测方法。
多重 PCR 扩增反应是影响基因芯片检测效能的
关键因素之一，引物对之间不同程度地存在竞争和
干扰作用，限制了同一扩增体系中引物对的数量［8］，
需要进行复杂的引物设计和扩增反应条件的优化。
本研究在进行大量引物特异性验证的同时，筛选扩
增效率较高的引物并对选取的引物组合优化，最终
确定使用 3 个 PCR 体系进行扩增，从而有效地减少
了多重 PCR 反应中引物对间的交叉反应。环境中存
在的 PCR 产物是本研究面临的主要污染源，因此
在 PCR 扩增步骤使用了 UNG-dUTP 体系，尽量避免
PCR 产物污染对试验的影响。特异性验证中各检测
结果的阳性探针均与靶细菌相一致，6 组模拟 DNA
混合样本也能准确鉴定，表明该方法特异性良好，
具有较好的多重检测能力，基因组 DNA 最低检测限
值为 10-100 pg，比电泳检测灵敏 10 倍，与 Han 等［9］、
龙海等［10］建立的病原菌芯片检测技术灵敏度相似，
18 株沙门菌临床分离株均能得到正确鉴定，说明本
研究建立的检测方法是可靠的。从样本 PCR 扩增开
始至获得检测结果，整个操作过程不超过 3 h，比常
规细菌学检测方法更快速和简便。
4 结论
基于特异性基因的多重 PCR 结合基因芯片技
术，建立了一种食源性细菌检测方法，该方法能够
同时检测和鉴定 11 种（株）食源性致病菌，具有一
定的应用价值。
参 考 文 献
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［3］ Kostrzynska M, Bachand A. Application of DNA microarray
technology for detection, identification, and characterization of food-
1 2 3 4
5 6 7 8
1-4 ：1 ng/μL-1 pg/μL 金黄色葡萄球菌 DNA 芯片检测图谱 ；5-8 ：
1 ng/μL-1 pg/μL 和肠出血型大肠杆菌 DNA 芯片检测图谱
图 5 金黄色葡萄球菌和肠出血型大肠杆菌 DNA 芯片检测
A B C
D E F
图 6 细菌 DNA 混合样本芯片检测结果
1 2 3
4 5 6
图 7 六株沙门菌临床分离株芯片检测结果
3 讨论
基因芯片是分子生物学近些年发展的代表技术
之一，与生物信息学结合在一起，可以同时检测成
千上万基因或靶 DNA 序列，在食源性致病微生物研
究方面有巨大的应用潜力［3］。目前，基于基因芯片
技术检测和鉴定食源性细菌的研究在国内外均有较
多报道，其中核糖体（16S rRNA、23S rRNA）基因［4，5］
是常见的靶基因，但由于序列保守程度较高而无法
鉴定种以下水平的细菌［6］，而且相关基因序列在环
境中普遍存在，容易引起试验污染［7］。选择毒力基
因等特异性基因为靶基因可克服上述缺点，在准确
鉴定病原细菌的同时能够得到样本毒力和耐药等较
详细基因信息。本研究选取金黄色葡萄球菌、鼠伤
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期128
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（责任编辑 李楠）