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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-02-27
基金项目 : 国家自然科学基金项目（30800202）,留学回国人员科研启动基金 ,国家自然科学基金和英国皇家学会双边交流合作项目（31011130157）
作者简介 : 凌小芳 , 女 , 硕士 , 研究方向 : 生物工程 ; E-mail: lingxf@qibebt.ac.cn
目前，纤维素乙醇因底物丰富、清洁和环境
友好等优点而受到重视［1］，而生产成本高是困扰
其产业化的一大障碍。为此，科研工作者试图通
过改进发酵方法和选育新的发酵菌种来降低其生
产成本［1］。其中，采用耐高温菌生产纤维素乙醇
具有很大的潜力［2］。耐高温菌在纤维素乙醇生产
中有诸多优点 ：节约冷却费用、节水、节能 ；维持
夏季高温下正常生产 ；高温下进行耦合发酵可提
高粗产物乙醇浓度，降低后序蒸馏阶段的能耗［3］；
当发酵底物为广泛的纤维素资源时，可解决高温
菌发酵时纤维素糖化温度和发酵温度不协调的矛
盾 ；缩短发酵周期，提高发酵效率，减少染菌机会
嗜热厌氧杆菌 X514生长及代谢的初步研究
凌小芳1 谢天2 杨静1
（1 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 生物燃料重点实验室，青岛 266101 ；2 中国科学院成都生物研究所应用与
环境微生物中心，成都 610041）
摘 要： 嗜热厌氧杆菌 X514（Thermoanaerobacter sp. X514）是纤维素乙醇生产中最具潜力的菌株之一。对 X514在 3种培养
基中的生长及代谢特征进行分析后发现，培养基 1190比 GS-Ⅱ和 2473更适合运用于 X514的代谢研究及乙醇发酵。其次，分别在
1190培养基中添加不同浓度的酵母提取物和葡萄糖，对 X514的生长及代谢作进一步研究。结果表明，在 0.5-2 g/L范围内，酵母
提取物浓度的增加有助于提高 X514的生物量，乙醇等产物的产量及乙醇产率，说明酵母提取物对 X514生长及乙醇发酵有促进作用；
在 2-10 g/L范围内，葡萄糖浓度的增加可提高乙醇等产物的产量而不会改变各产物的产率；糖消耗量并不随着初始底物浓度的增
加而线性增长，而是在一定阶段趋于消耗最大值。反映了 X514在底物充分的条件下，只有通过改进其他制约条件，才有可能提高
底物的利用率及产物的产率。
关键词： 嗜热厌氧杆菌 生物乙醇 1190培养基 酵母提取物
Preliminary Study on Growth and Metabolism of
Thermoanaerobacter sp. X514
Ling Xiaofang1 Xie Tian2 Yang Jing1
（1The Key Laboratory of Biofuels，Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266101；
2Applied and Environmental Microbiology Center，Chengdu Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Chengdu 610041）
Abstract: Thermoanaerobacter sp. X514 is a promising strain to be applied in cellulosic ethanol production. After analyzing the growth
and metabolic characteristics of X514 in three different media，1190 medium is found to be more suitable than GS-II and 2473 media in respect
of research on the metabolic characteristics and ethanol fermentation of X514. Furthermore，different concentrations of yeast extract and initial
glucose are added into 1190 medium to study the growth and metabolism of it. The results show that increases of yeast extract concentration
within the range of 0.5 g/L to 2 g/L lead to an improvement in biomass，glucose consumption，ethanol yield and also the ethanol conversion
rate. Results of the investigation in 1190 culture media added with different quantities of initial glucose illustrate that increase of initial substrate
concentration can increase the yield of ethanol and other products，but the conversion rate of products will not have a substantial change. The
glucose consumption will not increase accompanied with substrate addition，but reach its maximum at some stage，which indicates that the only
method for enhancing the substrate consumption and ethanol yield is to break up the restrict conditions when the substrate is sufficient.
Key words: Thermoanaerobacter Bioethanol 1190 medium Yeast extract
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期132
等［4］。在利用耐高温菌进行纤维素乙醇发酵的应
用中，从美国科罗拉多州 Piceance 盆地深层地下环
境中分离的嗜热厌氧杆菌 X514［5］与该属其他产乙
醇 菌 种（ 如 Thermoanaerobacter tengcongensis MB4、
Thermoanaerobacter ethanolicus 39E 等）相比，有许
多优良特性。与 MB4 相比，X514 可以同时利用半
纤维素、木聚糖聚合物以及纤维素生物质中所包含
的己糖、戊糖等糖类产乙醇［6］，而 MB4 却不能利
用木糖或木聚糖［7］。与 39E 相比，X514 有更多乙
醇脱氢酶基因和木糖转运子［8］，且拥有比 39E 更优
越的己糖、戊糖共代谢机制［9］，这使得 X514 在木
糖利用中显示出极大优势。研究发现，嗜热厌氧细
菌热纤维梭菌（Clostridium thermocellum LQRI）和
X514 以纤维素为底物进行混合培养的酒精生产能力
明显高于 LQRI 纯培养和 LQRI+39E［10］。整合生物
加工（Consolidated bioprocessing，CBP）是目前应用
于纤维素乙醇产业中最有潜力的技术［11］，其实现途
径之一正是这种混合培养体系［12］。
培养条件对细菌的生长及代谢特征有重要影
响［13］。本研究首先比较了 X514 在几种常见培养嗜
热厌氧菌的培养基（包括 ：ATCC 推荐使用的 X514
的培养基即 2473 培养基、ATCC 推荐使用的培养
Clostridium thermocellum LQRI 的培养基即 1190 培养
基，文献中使用较多的嗜热厌氧菌培养基即 GS-Ⅱ
培养基［14］）中的生长和发酵结果，找到适合 X514
生长及代谢的较优越的培养基。得到较优培养基后，
在添加不同浓度酵母提取物和不同初始葡萄糖浓度
的情况下对 X514 的生长及代谢进行研究。旨在通
过第一手的试验测量，探索该菌的生长、葡萄糖代
谢及乙醇生产等生理生化特征，为揭示其代谢本质
及加快其成为一个成熟工业应用菌的步伐提供基础
研究资料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 试验所用嗜热厌氧杆菌 X514 由美国俄
克拉荷马大学环境基因组学研究所保藏并提供。
1.1.2 材料 试验所用的试剂如 NH4Cl、NaHCO3、
Mops、KH2PO4、Na2HPO4、 K2HPO4·3H2O、葡萄糖
等均购自国药集团。酵母提取物购自 Oxoid 公司。
乙醇试剂盒购自 Megazyme 公司。
1.1.3 培养基 每升 2473 矿物质培养基含有的基本
成分 ：NHCl4 1.0 g，NaCl 1 g，Urea 0.2 g，CaCl2 0.06
g，MgCl2·6H2O 0.2 g，NaHCO3 2.5 g，Mops 2.5 g，
Wolfe’s mineral［15］ 溶 液 10.0 mL，Wolin vitamin［15］
溶液 10.0 mL。
每升 1190 矿物质培养基的基本成分 ：Na2HPO4
1.7 g，KH2PO4 1.5 g，NH4Cl 1.0 g，Mg2Cl·6H2O
0.2 g，Wolfe’s mineral 溶液 10.0 mL，Wolin vitamin 溶
液 10.0 mL。
每升 GS-Ⅱ矿物质培养基含有的基本成分为 ：
Urea 2.1 g，Mops 10 g，KH2PO4 1.5 g，K2HPO4 2.9
g，Sodium citrate·2H2O 3.0 g，Wolfe’s mineral 溶液
10.0 mL，Wolin vitamin 溶液 10.0 mL，GS-Ⅱ basic salt
10 mL（其成分中 3 种盐和其他盐同时灭菌会引起
沉淀，需单独配置分开灭菌。配置方法 ：将 10 g
MgCl2·6H2O，1.2 g CaCl2，0.0125 g FeSO4·6H2O 在
100 mL 蒸馏水中加热溶解，待冷却并厌氧密闭后，
在 121℃下灭菌 15 min，4℃冰箱保存，使用时用注
射器注入）。
1.2 方法
1.2.1 培养方法 试验所用的厌氧瓶分装 50 mL 培
养基后，以纯氮为厌氧保护气充气并密闭。不含葡
萄糖、维生素等的培养基在 115℃下灭菌 20 min。
高浓度葡萄糖溶液在 115℃下灭菌 20 min，维生素
溶液以及培养基中使用的还原剂通过 0.22 μm 滤菌
器过滤注入预先充氮气并灭菌的厌氧瓶中备用。厌
氧无菌的葡萄糖，Wolin vitamin 溶液等在接种前用
无菌注射器注入培养基。批次试验在 60℃培养箱进
行，每次取样用注射器从厌氧瓶中抽取。不同试验
中，细菌生长对数期每隔 4 h 左右取样一次，对数
期前后取值间隔时间为 8 h 左右，试验数据均来自 3
次平行样。
1.2.2 分析测定方法 乙醇产量测量按照乙醇测定
试剂盒说明书进行。培养基中乙酸、乳酸以及葡萄
糖的浓度使用 ics-3000 离子色谱仪（Dionex）测量。
乳酸、乙酸的检测器为电导检测器，糖为电化学检
测器，测量温度 30℃。乳酸及乙酸测量使用 IonPac
AG11-HC 分离柱（Dionex），所用的梯度程序为：0-17
2012年第9期 133凌小芳等 ：嗜热厌氧杆菌 X514 生长及代谢的初步研究
min 为 1 mmol/L 的 KOH，18-30 min 为 40.0 mmol/L
的 KOH，31 min 为 1 mmol/L 的 KOH，流速 1 mL/min。
葡萄糖的测定使用 CarboPac PA-10 分离柱（Dionex），
所用梯度程序为 ：0-15 min 为 100 mmol/L 的 NaOH，
16-17 min 为 200 mmol/L 的 NaOH，18-22 min 为
100 mmol/L 的 NaOH，流速 1 mL/min。
2 结果
2.1 培养基的筛选
2.1.1 X514 在 3 种不同矿物质培养基中的生长 由
图 1 可知，在起始葡萄糖浓度为 2 g/L 培养基中，
X514 在 1190 和 GS-Ⅱ两种矿物质培养基中的生长较
接近，其 OD600 最大值接近 0.20 ；X514 在 2473 培养
基中的生长较差，其 OD600 最大值仅约为前二者的
1/2，且 X514 在 2473 培养基中的生长明显滞后于前
二者。结果证明，1190 和 GS-Ⅱ两种培养基更适合
X514 的生长，因此后续的研究只考虑 X514 在 1190
和 GS-Ⅱ两种培养基中的产物代谢分布。
图 1 X514在含 2 g/L葡萄糖的三种不同培养基中的
生长曲线
2.1.2 X514 在 1190 和 GS-Ⅱ矿物质培养基中的代谢
比较 为进一步寻找适合 X514 的培养基，本研究
对 X514 在 1190 和 GS-Ⅱ培养基中的代谢进行了比
较。对图 2 进行分析可知 ：（1）在同样的测量条件
下，当产物浓度较低时（乳酸及乙酸含量约低于 0.5
mmol/L），GS-Ⅱ培养基中的乳酸和乙酸含量未检测
到，而 1190 培养基却可以。这是由于 GS-Ⅱ培养基
中 Mops 干扰了发酵产物的测定。而很多研究中，对
发酵产物各个时间点产物的检测是不能避免的。（2）
1190 培养基中 X514 的乙醇产率（本研究中特定义
产物产率为 ：产物产量和葡萄糖消耗量的摩尔比）
为 0.89，比 GS-Ⅱ培养基的乙醇产率高 10%。综上
所述，在对 X514 的代谢进行研究及改造中，1190
培养基更具优势。
2.2 X514在添加不同浓度酵母提取物和葡萄糖的
1190培养基中的生长及代谢
2.2.1 X514 在 1190 培养基添加不同浓度酵母提取
物下的生长及代谢 研究表明，添加酵母提取物
可以促进 X514 的生长及代谢速度。该节尝试研究
X514 在 1190 培养基中添加不同浓度酵母提取物下
的生长和代谢。初始葡萄糖浓度为5 g/L。由图3可知，
X514 最大 OD600 值及发酵产物的产量随着酵母提取
物浓度的增加而增大。在添加 2 g/L 酵母提取物时，
最大的 OD600 达到 1.0，比添加 0.5 g/L 酵母提取物的
最大 OD600 值提高约 30%。同时，添加 2 g/L 酵母提
取物时，X514 生物量最高点及发酵产物产量趋于稳
定的时间比酵母提取物浓度为 1 g/L 与 0.5 g/L 时提
前了 8 h 左右，显示了酵母提取物对 X514 生长及代
谢的促进作用。
图 2 X514在含 2 g/L葡萄糖的 1190（a）和 GS-Ⅱ（b）两种培养基中的底物利用及产物代谢分布
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期134
由表 1 数据可知，X514 的乙醇产率随着酵母提
取物的增加而增大。在添加 2 g/L 酵母提取物时，乙
醇产率约为 1.39，比添加 0.5 g/L 酵母提取物时的产
率提高了 0.15。与乙醇产率变化相比，乳酸和乙酸
的产率变化较小，显示了添加一定量酵母提取物培
养条件下高效的乙醇产率。
a、b、c、d 及 e 分别为 X514 在添加 0.5 g/L、1 g/L 及 2 g/L 酵母提取物条件下的生长曲线，葡萄糖消耗及产物乙醇、乳酸、乙酸的产出曲线
图 3 X514在初始葡萄糖含量为 5 g/L的 1190培养基中不同量酵母提取物的生长及代谢分布
表 1 X514在不同浓度酵母提取物 1190培养基中的葡萄糖消耗、产物终产量及其比值
酵母提取物添加量（g/L） 葡萄糖消耗（mmol/L） 乙醇（mmol/L） 乳酸（mmol/L） 乙酸（mmol/L） 糖消耗 乙醇 乳酸 乙酸
0.5 19.57±0.67 24.32±0.44 7.27±0.13 1.48±0.08 1 1.24 0.36 0.08
1 22.05±0.61 28.53±1.43 8.16±0.46 1.79±0.07 1 1.29 0.37 0.08
2 22.27±0.98 30.99±1.02 8.78±0.33 2.01±0.10 1 1.39 0.39 0.09
2.2.2 X514 在 1190 培养基添加不同初始浓度葡萄
糖下的生长及代谢 在添加酵母提取物浓度为 0.5
g/L 的 1190 培养基中，研究 X514 在不同浓度葡萄
糖条件下的代谢情况。由图 4 可以看出，X514 最大
OD 600 随着葡萄糖初始浓度的增加而增高，糖的消耗
及各种产物的产量也随之增大。葡萄糖初始浓度为
2 g/L时，X514在24 h左右已基本将葡萄糖消耗完毕，
而初始浓度为 5 g/L 及 10 g/L 的情况下，葡萄糖均有
剩余。在5 g/L初始葡萄糖浓度下，葡萄糖约剩余1/3。
在葡萄糖初始浓度为 10 g/L 的培养基中，每升培养
基约有 22 mmol 葡萄糖被消耗完毕，比初始葡萄糖
浓度为 5 g/L 时仅增加 2.6 mmol，消耗量还不到添加
量的 1/2。结果说明在此时的发酵条件下，X514 已
处于底物充足的状态，限制 X514 发酵的因素不是
底物浓度，而可能是溶液 pH 值或其他培养基成分。
由表 2 数据可知，随着葡萄糖浓度的增加，虽
然 X514 发酵的各种产物的产量随着初始糖浓度的
增加而增大，但产率基本不变。即在一定范围内，
初始葡萄糖浓度的增加不会影响 X514 发酵的乙醇
产率。
3 讨论
培养基中，一些复杂添加物（如酵母提取
物、蛋白胨等）往往对细菌的生长及代谢起着重
要的影响。例如，酵母提取物的添加可以促进 C.
thermocellum LQR I 和 X514 混合培养基发酵纤维素
的乙醇产量［10］。本研究结果表明，酵母提取物的
添加可以提高 X514 的生物量，缩短代谢周期。这
一结论和 Feng［6］的研究中提到的酵母提取物的添
2012年第9期 135凌小芳等 ：嗜热厌氧杆菌 X514 生长及代谢的初步研究
加可以促进 X514 的生长结论一致 ；酵母提取物添
加量的增加可以提高 X514 发酵的乙醇产量的原因
也可以用已有研究的结论得到解释，即酵母提取物
中的 B 族维生素对 X514 的乙醇发酵起着决定性的
作用［16］；酵母提取物的增加可以提高 X514 发酵的
乙醇产率这一结论则为更多的科研工作者揭示 X514
的代谢本质和促进其工业化指明了方向。
在利用细菌发酵得到目标产物的过程中，底物
的消耗量和产物相对于底物消耗的产率决定着产物
的产量。X514 利用葡萄糖进行发酵的过程中，糖的
消耗量不会随着糖添加量的增加而线性增长，而是
趋于在某个节点达到饱和，但在这一过程中，乙醇
的产率基本不变。这说明单凭提高底物浓度并不能
够促进糖的消耗，需要从改善其他培养条件（如培
养基的 pH 等）着手提高底物的消耗。葡萄糖添加
量的增加并不会影响 X514 发酵的乙醇产率的原因
可能是 X514 缺少完整的甲基乙二醛旁路［17］。该旁
路在碳水化合物丰富的环境中常用于限制能量的产
生［18］，进而导致细菌在较高浓度碳源（如葡萄糖、
木糖等）下发酵产物的产率降低。由于 X514 菌株
最初生长在能量匮乏的环境中［5］，导致代谢途径中
甲基乙二醛旁路不为其生存所必需，所以即使在碳
水化合物丰富的环境中，X514 的能量产生也可能不
受限制，仍可高效产出乙醇。这一点使 X514 具有
很好的工业应用前景。
4 结论
通过 X514 在 2473、1190 及 GS-Ⅱ三种培养基
中 X514 的生长试验证明较适合其生长的培养基为
1190 及 GS-Ⅱ培养基。在对 1190 及 GS-Ⅱ两种培养
基中 X514 的代谢进行分析之后得出，1190 培养基
在 X514 的代谢研究及改造中更具优势。
研究结果显示，在 2 g/L 葡萄糖条件下，X514
在 1190 矿物质培养基中和添加 0.5 g/L 酵母提取物
的 1190 培养基中的生长及代谢的结果表明，酵母提
葡萄糖添加量（g/L） 葡萄糖消耗（mmol/L） 乙醇（mmol/L） 乳酸（mmol/L） 乙酸（mmol/L） 糖消耗 乙醇 乳酸 乙酸
2 10.65±0.17 13.33±0.23 4.05±0.31 1.04±0.14 1 1.25 0.38 0.10
5 19.57±0.81 24.32±2.44 7.27±0.10 1.48±0.25 1 1.24 0.36 0.08
10 22.13±1.06 27.42±1.36 8.16±0.71 2.07±0.11 1 1.24 0.37 0.09
图 4 X514在含有 0.5 g/L酵母提取物的 1190培养基中不同量葡萄糖下的生长及代谢分布
a、b、c、d 及 e 分别是 X514 在添加初始浓度为 2 g/L、5 g/L、10 g/L 葡萄糖条件下的生长曲线、葡萄糖消耗及产物乙醇、乳酸、乙酸的产出曲线
表 2 X514在不同初始浓度底物下的葡萄糖消耗、终产物产量及其比值
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期136
取物的添加可以提高 X514 的生物量，缩短代谢周期。
且 X514 在 1190 培养基中添加不同浓度酵母提取物
下的生长及代谢结果表明，在一定范围内，酵母提
取物添加量的增加不但可以进一步缩短发酵周期，
提高生物量，还可以提高 X514 发酵的乙醇产量和
产率。
不同浓度葡萄糖对 X514 代谢影响的结果可知，
葡萄糖消耗量随着初始糖浓度的增加而增大，且增
加的消耗量逐渐减小。在 2-10 g/L 范围内，乙醇产
率维持在 1.25 左右，受葡萄糖添加量的影响不大。
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（责任编辑 马鑫）