全 文 ：第 １１ 卷第 ６ 期
２０１３ 年 １１ 月
生 物 加 工 过 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ． １１ Ｎｏ． ６
Ｎｏｖ． ２０１３
ｄｏｉ：１０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １６７２ － ３６７８． ２０１３． ０６． ００１
收稿日期：２０１２ － １０ － ２０
基金项目：国家自然科学基金（４０８７３０５８）
作者简介：夏天虹（１９８７—），女，四川宜宾人，硕士研究生，研究方向：生物质乙醇；翁焕新（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｇｓｗｅｎｇｈｘ＠ ｚｊｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
海带发酵制取生物乙醇的影响因素与优化条件
夏天虹，翁焕新
（浙江大学 环境与生物地球化学研究所，杭州 ３１００２７）
摘 要：针对海带的碳水化合物不易被单一菌株发酵转化为乙醇的难题，通过酸化、匀浆和消化等预处理和正交试
验，利用多酶系多菌种微生物复合发酵剂的酿酒曲，研究海带发酵制取生物乙醇的影响因素与优化条件。 结果表
明：在预处理试验中，加入一定量的 Ｎａ２ＣＯ３，可以提高海带液中还原性糖和总糖的含量；消化温度对总糖影响相对
较大，而对还原性糖的影响较小；过滤不利于得到较高浓度的乙醇；在优化条件中，发酵液的初始酸碱度是最重要
的，其次是发酵温度和基质浓度，发酵液体积的影响程度相对较小。 在基质（海带）质量浓度为 ０ １５ ｇ ／ Ｌ、温度
３４ ℃、起始 ｐＨ ６ ５ 和发酵液体积 ２００ ｍＬ时，可以获得最大的乙醇产量 ４ ０９ ｇ（以 １００ ｇ海带计）。
关键词：生物乙醇；发酵；海带
中图分类号：ＴＱ５１７ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２ － ３６７８（２０１３）０６ － ０００１ － ０８
Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｋｅｌｐ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ＸＩＡ Ｔｉａｎｈｏｎｇ，ＷＥＮＧ Ｈｕａｎｘｉｎ
（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ＆ Ｂｉｏｇｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００２７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｋｅｌｐ （Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ） ｗａｓ ａｃｉｄｉｆｉｅｄ，ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｄ，ｏｒ ｄｉｇｅｓｔｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ａｄｄｅｄ ｉｎｔｏ ｂｒｏｔｈ
ｏｆ Ａｎｇｅｌ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒ′ｓ ｙｅａｓｔ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．
Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ， ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｓｕｇａｒ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ａｄｄｉｎｇ
Ｎａ２ＣＯ３ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ． Ｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｈａｄ ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔ ｔｏ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｔｅｎｔ ｔｈａｎ ｔｈｅ
ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｔｅｎｔ． Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｒａｉｓｅｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ． Ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ ｏｎｅ，ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ
ｉｎｉｔｉａｌ ｋｅｌｐ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｃａｍｅ ｓｅｃｏｎｄ． Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｋｅｌｐ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ０ １５ ｇ ／ Ｌ， ｔｈｅ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ３４ ℃， ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ６ ５ ａｎｄ ｔｈｅ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ２００ ｍＬ， ｔｈｅ
ｍａｘｉｍｕｍ ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｒｅａｃｈｅｄ，ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｏｆ ４ ０９ ｇ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｅｒ １００ ｇ ｋｅｌｐ． Ｔｈｉｓ
ｗｏｒｋ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂａｓｉｓ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｒ ｆｉｎｄｉｎｇ ａｎ ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｐａｔｈ ｉｎ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｆｒｏｍ ｋｅｌｐ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｅｔｈａｎｏｌ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｋｅｌｐ
生物乙醇是一种理想的可再生生物能源，它可
以从不同的生物质原料中制取。 海带生长不依靠
土地资源，也不使用化肥和淡水资源，且产量高。
在众多的生物能源原料中，海带具有明显优势，被
认为是典型的第三代生物能源原料［１］。 利用海带
制备生物乙醇不仅可以避免能源与粮食的冲突，而
且海带不含木质素［２］，有利于海带制取乙醇的预处
理。 另外，规模化种植海带一方面有利于沿海污染
海域生态环境的修复，另一方面藻类植物的光合作
用可以固定空气中的 ＣＯ２，减少温室气体的净排放。
因此，大型海藻（海带）是提取生物乙醇最理想的原
料之一。
海带中的碳水化合物含量可达 ３０％ ～５０％ ［３ － ４］，
但其组成较复杂，多以多聚糖的形式存在，如褐
藻酸和纤维素等，难以通过单一菌株使海带进行
糖化同时发酵。 因而依靠单一菌株发酵海带具
有很大的局限性 ［４ － ５］ 。 Ｌｅｅ 等 ［６］研究发现，这个
局限性可由不同微生物，即多种菌共同发酵来克
服，也可通过基因工程的方法 ［７］以达到高效制取
生物乙醇的目的。 Ｗａｒｇａｃｋｉ 等 ［７］通过基因工程
手段建立了一个可同时降解、摄取以及代谢海藻
酸钠的微生物平台，利用此系统，海带糖分转化
为乙醇可达最大理论产值的 ８０％ 。 但是，这是一
个非常复杂的综合工艺，工业化实施过程存在较
大困难。 我国的酿酒历史悠久，酿酒曲能够提供
丰富的发酵菌种和酶系 ［８］ ，有利于海带的糖化和
发酵同时进行。
为了探索相对简便且可行的海带制取生物乙
醇的工艺路径，笔者对比了几种预处理方法，选择
消化法作为后续发酵的前处理，并通过正交试验，
分析各种影响因素，确定能够获得生物乙醇产量较
高的优化条件，以期为开发大型褐藻（海带）生物能
源提供科学依据和技术支撑。
１ 材料与方法
１． １ 材料
海带（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）购于市场。 将海带试
样剪碎成小块，放入 ６０ ℃的烘箱中干燥，至恒质量
后取出，经粉碎机粉碎至 ０ １７７ ～ ０ ８４１ ｍｍ，密封在
试样袋中待用。
酿酒曲：安琪酵母股份有限公司，属于多酶系
多菌种微生物复合发酵剂，主要含有酿酒酵母和根
霉菌。
１． ２ 方法
１． ２． １ 预处理试验
海带的碳水化合物组成测定见表 １。 从表 １ 可
知：６ 种碳水化合物占被试海带干质量的 ５１ ３２％ ，
其中褐藻酸所占比例最大，达到 ３０ ５２％ ，其次是甘
露醇和粗纤维，分别为 １２ ２７％和 ５ ４３％ ，能被发酵
菌直接利用的淀粉和还原性糖不到 ２％ 。 由此可
见，海带不利于直接发酵，通过预处理可以提高初
始发酵液中的还原性糖和总糖含量。 为了确定合
适的预处理方式，进行方法的选择试验和影响因素
试验。
表 １ 海带的碳水化合物组成［３，９ －１０］
Ｔａｂｌｅ １ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ｋｅｌｐ
成分 褐藻酸 甘露醇 海带淀粉 粗纤维 褐藻糖胶 还原性糖
含量 ／ ％ ３０ ５２ １２ ２７ １ ６６ ５ ４３ １ ２０ ０ ２４
１）预处理方法的选择试验。 称取 １ ５ ｇ 粉碎海
带于 ２５０ ｍＬ烧杯中，加 １００ ｍＬ去离子水，在不同条
件下进行预处理试验：①将试样直接放入 ６５ ℃恒温
水浴中加温消化；②用 ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＨＣｌ 调海带液 ｐＨ
至 ２，在 ６５ ℃恒温水浴中加温消化；③海带液经搅
拌机 １ ｍｉｎ处理后制备为匀浆，放入 ６５ ℃恒温水浴
中加温消化；④匀浆后直接放置于常温消化；⑤加
入 ０ ６ ｇ Ｎａ２ＣＯ３后放置于室温下消化；⑥海带液经
匀浆后加 ０ ６ ｇ Ｎａ２ＣＯ３，在 ６５ ℃恒温水浴中加温消
化。 以上每种处理的消化时间均为 １ ｈ，然后分别测
定还原性糖和总糖的含量。
２）Ｎａ２ＣＯ３含量对消化反应的影响试验。 称取
１ ５ ｇ粉碎海带于搅拌机中，加去离子水 １００ ｍＬ，经
１ ｍｉｎ 处理后制备为匀浆，分别加入 Ｎａ２ ＣＯ３ ０ ３、
０ ６、０ ９、１ ２ 和 １ ５ ｇ，放置于 ６５ ℃的恒温水浴中
加温 １ ｈ，分别测定还原性糖和总糖含量。
３）消化时间和温度的影响试验。 称取 １ ５ ｇ 粉
碎海带于搅拌机中，加去离子水 １００ ｍＬ，１ ｍｉｎ 匀
浆，再加入 ０ ６ ｇ Ｎａ２ＣＯ３制备成一个取样时间的试
样，一组（６ 个试样）放入 ６５ ℃恒温水浴中加温消
化，另一组（６ 个试样）放置于室温消化，分别消化
０、１５、３０、４５、６０ 和 ９０ ｍｉｎ 后取样，测定还原性糖和
总糖的含量。
４）过滤对发酵的影响试验。 称量 １５ ｇ 粉碎海
２ 生 物 加 工 过 程 第 １１ 卷
带，加 １ ５００ ｍＬ 去离子水，制备为匀浆，放入 ３ ｇ
Ｎａ２ＣＯ３ 后于 ６５ ℃恒温水浴 １ ｈ。 预处理后的海带
液分成 ２ 组，一组为原始海带液，另一组海带液经 ４
层纱布过滤，两者分别调 ｐＨ至 ６ ５ 后，量取 １５０ ｍＬ
于 ２５０ ｍＬ锥形瓶中，１２１ ℃下灭菌 ２０ ｍｉｎ，冷却至
常温后加入 ０ ２ ｇ 酿酒曲，用厌氧塞封口，在 ３０ ℃
下，１００ ｒ ／ ｍｉｎ恒温振荡器中培养，在不同的时间内
取液，分别测定还原性糖、总糖和乙醇的含量。
１． ２． ２ 发酵试验
将海带经过匀浆后，每克添加 ０ ２ ｇ Ｎａ２ＣＯ３于
６５ ℃恒温水浴中进行预处理 １ ｈ。 然后用 ２ ｍｏｌ ／ Ｌ
ＨＣｌ调节海带液 ｐＨ，量取至 ２５０ ｍＬ锥形瓶中，放入
１２１ ℃灭菌锅中灭菌 ２０ ｍｉｎ，取出后放置于无菌操
作台，待冷却，每 １５０ ｍＬ 海带液中加入 ０ ２ ｇ 酿酒
曲，用厌氧塞密封锥形瓶，于 １００ ｒ ／ ｍｉｎ 恒温振荡器
中培养。 选择基质（预处理后的海带）质量浓度、发
酵温度、灭菌前起始 ｐＨ和发酵液体积 ４ 个因子，进
行正交试验 Ｌ１６（４４），因子水平见表 ２。 发酵 １６０ ｈ，
测定乙醇的浓度值。
表 ２ Ｌ１６（４４）正交设计因子水平
Ｔａｂｌｅ ２ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｌ１６（４４）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ
水平
因子
温度 ／
℃
初始
ｐＨ
Ｖ（发酵液） ／
ｍＬ
ρ（基质） ／
（ｇ·Ｌ － １）
１ ２６ ６ ５ ７５ ０ ０７５
２ ３０ ５ ５ １００ ０ １００
３ ３４ ４ ５ １５０ ０ １２５
４ ３８ ２ ５ ２００ ０ １５０
１． ２． ３ 试样分析
１）还原性糖和总糖测定。 反应液的 ｐＨ 调至
６ ～ ９ 后，取 １０ ｍＬ于离心管中，４ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １５
ｍｉｎ，取上清液。 还原性糖用 ３，５ 二硝基水杨酸比
色法测定［１０］；总糖用苯酚 Ｈ２ＳＯ４ 比色法测定［１１］。
２）乙醇测定。 取 ５０ ｍＬ 发酵液于 ２５０ ｍＬ 圆底
烧瓶中，加入 ５０ ｍＬ去离子水和几颗玻璃珠，装好蒸
馏装置，用 ５０ ｍＬ 容量瓶接收（外用冰水浴），小火
加热蒸馏至接近刻度 ５０ ｍＬ，定容、摇匀。 取 １０ ｍＬ
Ｈ２ＳＯ４和 １０ ｍＬ Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７（１∶ １）于 ５０ ｍＬ 容量瓶中，
冷却后加入 ２５ ｍＬ 蒸馏液，定容后混匀，放置 １０
ｍｉｎ，在 ５９４ ｎｍ下测定吸光度［１２ － １３］。 重复试样的分
析误差小于 ５％ 。
２ 结果与讨论
２． １ Ｎａ２ＣＯ３提高还原性糖和总糖的作用
图 １ 显示了经过不同预处理后海带液中总糖和
还原性糖的含量变化。 从图 １ 可知：将海带颗粒在
６５ ℃恒温水浴中进行加温 １ ｈ 或经过酸处理，溶出
的还原性糖和总糖虽然都略有增加，但不如直接将
试样制备成匀浆效果明显，这表明通过匀浆处理可
以破坏海带组织结构，使部分糖分溶出。 在匀浆中
加入 Ｎａ２ＣＯ３，并在 ６５ ℃下恒温加热消化，可以获得
较高的还原性糖和总糖，分别为 ６ ６８ 和 １３６ ６７ ｍｇ
（以 １ ｇ海带计）。 这是由于褐藻胶是海带细胞壁的
重要组成部分，且 Ｎａ２ＣＯ３可以与褐藻酸钙盐（褐藻
胶在海带中的主要存在状态）发生消化反应［１４］，使
海带细胞膨胀而破坏，结果导致海带中的糖分溶
出，从而使溶液中还原性糖和总糖浓度提高。
颗粒—６５ ℃恒温水浴；酸处理—ｐＨ ＝２，６５ ℃恒温水浴；
匀浆—匀浆后 ６５ ℃恒温水浴；消化 １—常温下加 Ｎａ２ＣＯ３；
消化 ２—匀浆后常温条件；消化 ３—匀浆后加 Ｎａ２ＣＯ３ ６５ ℃恒温水浴
图 １ 不同处理海带液中还原性糖和总糖含量
Ｆｉｇ． １ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｓｕｇａｒ
ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ａｆｔｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ
图 １ 左上角小图显示了消化液中还原性糖和总
糖含量随 Ｎａ２ＣＯ３ 添加量的变化。 可以看到，当
Ｎａ２ＣＯ３的添加量逐渐增大时（０ ～ ０ ３ ｇ），消化液中
还原性糖和总糖浓度快速上升，当添加量为 ０ ３ ｇ
时，还原性糖和总糖质量浓度分别达到 ０ ０９３ 和
２ ０８ ｍｇ ／ ｍＬ。 当 Ｎａ２ＣＯ３的添加量从 ０ ３ ｇ 增加到
０ ６ ｇ时，消化液中的还原性糖和总糖浓度略有增
加，然后随着 Ｎａ２ＣＯ３添加量继续增加，消化液中的
还原性糖和总糖浓度不再增加，这表明了此时消化
反应破坏海带细胞壁已饱和。 季仲强［４］研究发现，
增加 Ｎａ２ＣＯ３会加大消化液中的盐度，尽管酿酒酵母
能耐受一定的盐度，对乙醇产率影响不大［４］，然而
３ 第 ６ 期 夏天虹等：海带发酵制取生物乙醇的影响因素与优化条件
高盐溶液对微生物具有毒害和抑制作用［１５］。 因此，
选择 Ｎａ２ＣＯ３的添加量为 ０ ３ ｇ（相当于 ０ ２ ｇ ／ ｇ干海
带）时，可以较大限度地破坏海带细胞壁，从而获得
较大的还原性糖和总糖含量，同时盐度相对较低。
２． ２ 时间和温度对消化反应的影响
图 ２ 显示了海带液中还原性糖和总糖含量随消
化时间的变化。 由图 ２ 可知：消化液中还原性糖和
总糖的含量开始时随时间的增加而逐渐增加，而后
随着消化时间的延长有下降的趋势。 如常温下消
化反应的总糖在 ３０ ｍｉｎ 时达到最大值 １ ４４
ｍｇ ／ ｍＬ，而还原性糖在 ４５ ｍｉｎ 时达到 ０ ０９９ ｍｇ ／ ｍＬ
的最大值，随着反应的进行，总糖和还原性糖的含
量均开始下降；６５ ℃下消化时，还原性糖和总糖的
增加速率比常温下消化要快，在 ３０ ｍｉｎ 时达到还原
性糖的最大值，之后缓慢下降，总糖在 ６０ ｍｉｎ 时达
到最大值后下降。 消化温度对还原性糖浓度影响
相对较小，在 ４５ ｍｉｎ时， ６５ ℃和常温下的还原性糖
浓度值相差较小；温度对总糖浓度影响比对还原性
糖浓度影响大，６５ ℃下的消化效果明显优于常温消
化，在 ６５ ℃下消化 ６０ ｍｉｎ 时，总糖量达到最大值
（２ ０５８ ｍｇ ／ ｍＬ）。
图 ２ 消化时间对还原性糖和总糖含量的影响
Ｆｉｇ． ２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｎ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ ａｎｄ
ｔｏｔａｌ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｇｅｓｔｉｎｇ ｔｉｍｅ
２． ３ 过滤对发酵影响
图 ３ 显示了海带液过滤前后发酵情况。 从图 ３
（ａ）可以看到，经灭菌后的未过滤海带液总糖比过
滤的总糖质量浓度大 ０ ２ ｍｇ ／ ｍＬ，在之后的发酵过
程中，总糖含量下降，到 ２４ ｈ后，由于酿酒曲中多种
微生物共同作用，与褐藻胶紧密结合的碳水化合物
溶于溶液中，总糖含量明显增加，而后持续下降。
经灭菌后，过滤海带液和未过滤海带液的还原性糖
含量无明显差别，这表明过滤对还原性糖的初始值
影响不大。 由于根霉菌具有较强的糖化力和液化
力 ［１６］，当发酵一段时间后，其转化的还原性糖大于
发酵消耗的还原性糖，还原性糖浓度开始上升，随
着发酵的进行，还原性糖浓度持续下降。
图 ３ 海带液过滤与未过滤处理后的发酵情况
Ｆｉｇ． ３ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｋｅｌｐ ｌｉｑｕｉｄ ｗｉｔｈ ａｎｄ
ｗｉｔｈｏｕｔ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
发酵初期主要由酿酒酵母直接利用易发酵的
原始还原性糖作为发酵底物，因此过滤海带液和未
过滤海带液发酵产生的乙醇含量接近（图 ３（ｂ））。
但随着发酵的进行，乙醇的产生需要根据根霉的水
解和糖化能力。 酿酒曲中微生物的作用与底料浓
度有密切关系，在一定范围内，微生物生长量和酶
反应速度均随着底料浓度的增加而成正比的增大。
由于未过滤的海带液底料浓度比过滤的高，因此，
未过滤海带液中的微生物生长量大，酶浓度高，代
谢快，还原性糖消耗快，产生更多乙醇。 在 ４０ ｈ 时
后，过滤的海带液的乙醇含量几乎保持不变，而未
经过过滤的海带液发酵的乙醇浓度则继续增加，并
在 １６０ ｈ达到最大值 ０ ２３２ ｍＬ ／ Ｌ。
褐藻胶黏性较大，４ 层纱布过滤海带液可将大
多褐藻胶及相应的纤维素去除。 酿酒曲中含多种
酶及微生物，在发酵的过程中，主要成分的微生物
根霉可产纤维素酶，能利用转化海带中的纤维素。
因此，未过滤的海带液能进一步利用纤维素发酵得
到较高的乙醇浓度。 这个实验结果表明，过滤不利
于发酵得到较高的乙醇浓度。
４ 生 物 加 工 过 程 第 １１ 卷
２． ４ 最佳发酵条件的确定
采取添加 ０ ２ ｇ Ｎａ２ＣＯ３于 ６５ ℃恒温水浴中１ ｈ
的预处理，不过滤直接进入优化条件试验。 为了确
定最优化的发酵条件，选择发酵温度、初始 ｐＨ、发酵
液体积和基质浓度 ４ 个基本参数，作为控制因子进
行海带发酵的正交试验。 表 ３ 列出了各正交试验的
乙醇含量。
从表 ３ 可以看出，各正交试验组乙醇含量随时
间呈现出不同的变化趋势，其中，９ 号试验产生的乙
醇体积浓度最大，在 １６０ ｈ时达 ０ ７２８ ５ ｍＬ ／ Ｌ，相当
于 １００ ｇ干海带产 ３ ８４ ｇ 乙醇；其次是试验 １０，在
２４ ｈ时乙醇体积浓度为 ０ ６３０ ８ ｍＬ ／ Ｌ（１００ ｇ 干海
带产 ３ ９９ ｇ乙醇），特别是试验 １３，虽然在 １１２ ｈ 时
达到的最大乙醇体积浓度为 ０ ５３７ ２ ｍＬ ／ Ｌ，没有试
验 ９ 和试验 １０ 那样高，但是却获得了全部试验的最
大产率：１００ ｇ干海带可产 ４ ２５ ｇ乙醇。
表 ３ 正交试验结果
Ｔａｂｌｅ ３ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
试验号
φ（乙醇） ／ （ｍＬ·Ｌ － １）
０ ２４ ｈ ６４ ｈ ８８ ｈ １１２ ｈ １３６ ｈ １６０ ｈ
１ ０ ０ ０２８ ２ ０ ０５６ ５ ０ ０６５ ８ ０ ０９４ １ ０ １０３ ０ ０ ０７５ ３
２ ０ ０ ０９４ １ ０ ０７５ ２ ０ １２２ ３ ０ １５０ ６ ０ １３１ ７ ０ １５０ ６
３ ０ ０ ０７５ ３ ０ １０４ ３ ０ １３３ ２ ０ １２１ ６ ０ １２１ ６ ０ １２７ ４
４ ０ ０ ０２８ ９ ０ ０４０ ５ ０ ０４６ ３ ０ ０６３ ７ ０ ０６９ ５ ０ １５０ ６
５ ０ ０ ３７５ ０ ０ ３５３ ６ ０ １０８ ８ ０ ０３２ ６ ０ ０３２ ６ ０ ０３８ １
６ ０ ０ ４７３ ３ ０ ４８４ ０ ０ ４３５ ２ ０ ４１３４ ０ ４７８ ７ ０ ５１１ ４
７ ０ ０ １２４ ３ ０ ３３５ ０ ０ ２５９ ４ ０ ３５６ ６ ０ ３３５ ０ ０ ２９７ ２
８ ０ ０ ０１６ ２ ０ ０２７ ０ ０ ０３７ ８ ０ ０７５ ６ ０ １０２ ７ ０ ０７５ ６
９ ０ ０ ４９２ ６ ０ １８６ ２ ０ １３２ ２ ０ ２８８ ４ ０ ４８６ ６ ０ ７２８ ５
１０ ０ ０ ６３０ ８ ０ ４０２ ５ ０ ２８８ ４ ０ ３４２ ４ ０ ２１６ ３ ０ ２４０ ３
１１ ０ ０ ２３１ ０ ０ １０７ ３ ０ ０４８ ３ ０ ０３２ ２ ０ ０１６ １ ０ ０１０ ７
１２ ０ ０ ０３２ ２ ０ ０１６ １ ０ ００５ ４ ０ ００５ ４ ０ ００５ ４ ０ ００５ ４
１３ ０ ０ ４５３ ３ ０ １４５ ５ ０ １３９ ９ ０ ５３７ ２ ０ ４９２ ４ ０ ５０３ ６
１４ ０ ０ ３４１ ０ ０ ２５１ ８ ０ １７３ ５ ０ １７９ ０ ０ ２３５ ０ ０ ２１２ ６
１５ ０ ０ ３００ ６ ０ ４３１ １ ０ ４７０ ７ ０ ５０４ ８ ０ ４１４ ０ ０ ３１７ ６
１６ ０ ０ ０１７ ０ ０ ０４５ ３ ０ ０３９ ７ ０ ０３９ ７ ０ ０２８ ３ ０ ０５１ ０
表 ４ 列出了各正交试验乙醇最大含量的极差分
析结果，表 ４ 给出的数据显示，对于温度因素，第 ３
水平 ３４ ℃的 Ｔ３值为 １ ６２２ ５，明显大于该因素的其
他水平值；对比初始 ｐＨ一列的各 Ｔｉ值大小，可以确
定该因素的最佳水平为初始 ｐＨ ＝ ６ ５ （ Ｔ１ ＝
１ ７４３ ７）；同理，分别对比发酵液和基质浓度的 Ｔｉ
值，可得到发酵液为第 ４ 水平 ２００ ｍＬ 时 （ Ｔ４ ＝
１ ６７５ ４）以及基质浓度为第 ４ 水平的 ０ １５ ｇ ／ Ｌ 时
（Ｔ４ ＝ １ ８９５ ３） 效果最佳。 这表明，在此试验范围
内，最优的发酵条件：３４ ℃、初始 ｐＨ ６ ５、发酵液体
积 ２００ ｍＬ和基质质量浓度 ０ １５ ｇ ／ Ｌ。
在温度、初始 ｐＨ、发酵液和基质浓度 ４ 个因子
中，极差（Ｒ）大小的排序：初始 ｐＨ（Ｒ ＝ ０ ３５１ ９）、温
度（Ｒ ＝ ０ ２７１ ２）、基质浓度（Ｒ ＝ ０ ２６５ ６）、发酵液
（Ｒ ＝ ０ １９４ ７）。 从 Ｒ值的这个排序可知：在海带制
取乙醇发酵过程的各影响因素中，发酵液的初始酸
碱度是最重要的，其次是发酵温度和基质浓度，来
自发酵液体积的影响程度相对较小。
５ 第 ６ 期 夏天虹等：海带发酵制取生物乙醇的影响因素与优化条件
表 ４ 酿酒曲正交试验各组乙醇最大含量的极差分析
Ｔａｂｌｅ ４ Ｒａｎｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｂｙ Ａｎｇｅｌ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒ′ｓ ｙｅａｓｔ
ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
试验号 温度 ／℃ 初始 ｐＨ
Ｖ（发酵液） ／
ｍＬ
ρ（基质） ／
（ｇ·Ｌ － １）
φ（乙醇） ／
（ｍＬ·Ｌ － １）
１ ２６ ６ ５ ７５ ０ ０７５ ０ １０３ ０
２ ２６ ５ ５ １００ ０ １００ ０ １５０ ６
３ ２６ ４ ５ １５０ ０ １２５ ０ １３３ ２
４ ２６ ２ ５ ２００ ０ １５０ ０ １５０ ６
５ ３０ ６ ５ １００ ０ １２５ ０ ３７５ ０
６ ３０ ５ ５ ７５ ０ １５０ ０ ５１１ ４
７ ３０ ４ ５ ２００ ０ ０７５ ０ ３５６ ６
８ ３０ ２ ５ １５０ ０ １００ ０ １０２ ７
９ ３４ ６ ５ １５０ ０ １５０ ０ ７２８ ５
１０ ３４ ５ ５ ２００ ０ １２５ ０ ６３０ ８
１１ ３４ ４ ５ ７５ ０ １００ ０ ２３１ ０
１２ ３４ ２ ５ １００ ０ ０７５ ０ ０３２ ２
１３ ３８ ６ ５ ２００ ０ １００ ０ ５３７ ２
１４ ３８ ５ ５ １５０ ０ ０７５ ０ ３４１ ０
１５ ３８ ４ ５ １００ ０ １５０ ０ ５０４ ８
１６ ３８ ２ ５ ７５ ０ １２５ ０ ０５１ ０
Ｔ１ ０ ５３７ ４ １ ７４３ ７ ０ ８９６ ４ ０ ８３２ ６
Ｔ２ １ ３４５ ２ １ ６３４ ０ １ ０６２ ４ １ ０２１ ０
Ｔ３ １ ６２２ ５ １ ２２５ ６ １ ３０４ ９ １ １９０ ２
Ｔ４ １ ４３４ ０ ０ ３３５ ８ １ ６７５ ４ １ ８９５ ３
Ｋ１ ０ １３４ ４ ０ ４３５ ９ ０ ２２４ １ ０ ２０８ ２
Ｋ２ ０ ３３６ ３ ０ ４０８ ５ ０ ２６５ ６ ０ ２５５ ２
Ｋ３ ０ ４０５ ６ ０ ３０６ ４ ０ ３２６ ２ ０ ２９７ ５
Ｋ４ ０ ３５８ ５ ０ ０８４ ０ ０ ４１８ ８ ０ ４７３ ８
Ｒ ０ ２７１ ２ ０ ３５１ ９ ０ １９４ ７ ０ ２６５ ６
注：Ｔｉ为各因素第 ｉ个水平试验指标之和；Ｋｉ为各因素第 ｉ个水平试验指标的平均数；Ｒ极差值。
Ｆ检验结果也表明（表 ５），在显著水平为 ０ ０２５
时，初始 ｐＨ、温度及基质浓度对乙醇含量影响显著，
而发酵液体积对乙醇含量影响不显著；当显著性水
平为 ０ ０５ 时，这 ４ 个因子对乙醇生产浓度的影响都
比较显著。
根据正交试验确定的最佳条件，进行海带发酵
制取乙醇试验，图 ４ 显示了用基质质量浓度为 ０ １５
ｇ ／ Ｌ的发酵液 ２００ ｍＬ，以初始 ｐＨ为 ６ ５ 和 ３４ ℃下
进行发酵制取乙醇的情况， 从图 ４ 可知：发酵进行
２４ ｈ时，乙醇体积浓度达到最大值，为０ ７８７ ３ ｍＬ ／ Ｌ。
如果除去酿酒曲自身产出的乙醇，这时，乙醇的产
率相当于 ４ ０９ ｇ乙醇（以 １００ ｇ海带计）。 以海带批
６ 生 物 加 工 过 程 第 １１ 卷
发价 ３ 元 ／ ｋｇ，乙醇 ７ ５００ 元 ／ ｔ［１７］计算，本文的乙醇
产值仍低于生产成本，但可结合褐藻胶和生物碘的
提取共同开发以降低成本和增加产值。 随着发酵
时间的延长，乙醇的浓度迅速降低，当 ６０ ｈ 后，乙醇
体积浓度在 ０ １ ～ ０ ２ ｍＬ ／ Ｌ 之间波动。 乙醇浓度
在发酵 ２４ ｈ达到峰值后开始下降，说明酵母开始消
耗乙醇，一般只有当糖类质量浓度下降至 ４ ｍｇ ／ Ｌ时
才出现这种情况，但此临界浓度随酵母菌种、培养
条件等不同而有所不同［１８］。 实验中海带基质浓度
很低是峰值乙醇浓度值不高的最主要原因，可考虑
液化降黏和补料措施提高乙醇浓度，并维持较高
浓度。
表 ５ 发酵正交试验方差分析
Ｔａｂｌｅ ５ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ
方差来源 偏差平方和 自由度 方差估计值 Ｆ
温度 ０ １７２ １ ３ ０ ０５７ ４ ２０ ７１６ ９
初始 ｐＨ ０ ３０６ ６ ３ ０ １０２ ２ ３６ ９０６ ５
发酵液体积 ０ ０８５ ８ ３ ０ ０２８ ６ １０ ３２８ ６
基质浓度 ０ １６１ ４ ３ ０ ０５３ ８ １９ ４２８ ４
误差 ０ ００８ ３ ３
总和 ０ ７３４ ２ １５
Ｆ０ ０２５（３，３） ＝ １５ ４４ Ｆ０ ０５（３，３） ＝ ９ ２８
图 ４ 右上角小图显示了酿酒曲与海带 ＋酿酒曲
的总糖和还原性糖随发酵时间的变化。 从图 ４ 右上
角小图中可以看到，发酵剂酿酒曲中的还原性糖和
总糖的起始质量浓度分别为 ０ ０１７ ７ 和 ０ １７６ ４
ｍｇ ／ ｍＬ，随着发酵的进行，还原性糖和总糖浓度快速
下降到较低水平，对海带制取乙醇的贡献值不大。
在海带 ＋酿酒曲中，还原性糖和总糖的起始质量浓
度分别为 ０ ０７５ 和 ２ ３ ｍｇ ／ ｍＬ，在 ０ ～ ２４ ｈ 的发酵
时间内，总糖浓度上升，随着发酵时间的延长，总糖
浓度逐渐减少，但发酵进行到 ６４ ～ １１２ ｈ 时，总糖浓
度再次上升，此时，发酵液从原来的稠黏状转变为
了半流体状液体， ｐＨ也明显下降，这可能是随着发
酵的进行，原黏附在褐藻胶上的糖分进入发酵液
中，反映了发酵液的环境因素对总糖浓度产生的影
响。 在发酵 ０ ～ ２４ ｈ时，还原性糖浓度明显上升，这
一方面是由于酿酒曲中含有还原性糖，在加菌的同
时增加了发酵液的还原性糖，另一方面是酿酒曲中
根霉菌的糖化作用，将溶液中的多糖转化为单糖，
从而使还原性糖大于其发酵的消耗量。 随着发酵
时间的延长，还原性糖浓度逐渐下降。
图 ４ 优化条件的发酵情况
Ｆｉｇ． ４ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
３ 结 论
在预处理试验中，向海带液中加入一定量的
Ｎａ２ＣＯ３，可明显地提高消化液中的还原性糖和总糖
浓度，且适宜的 Ｎａ２ＣＯ３剂量为 ０ ３ ｇ。 预处理时间
和温度会影响海带的消化反应，影响总糖和还原糖
的溶出。 消化温度对还原性糖的含量影响较小，而
对总糖含量的影响较大，６５ ℃条件下的消化效果明
显优于常温消化。 ６５ ℃条件下，预处理 ６０ ｍｉｎ 时，
还原性糖和总糖相对较高。 海带液经过滤后总糖
含量相应降低，未过滤的海带液发酵产生的乙醇浓
度明显高于过滤液产生的乙醇浓度。
对于消化预处理，酿酒曲发酵海带制取生物乙醇
的最佳条件：温度 ３４ ℃、初始 ｐＨ ６ ５、发酵液体积为
２００ ｍＬ和基质质量浓度 ０ １５ ｇ ／ Ｌ。 在显著性水平为
０ ０５时，发酵基质浓度、发酵恒温培养温度、灭菌前起
始 ｐＨ和发酵液体积４个因子对乙醇含量的影响都比
较显著，其中，发酵液的初始酸碱度是最重要的，其次
是发酵温度和基质浓度，发酵液体积的影响程度相对
较小。 在优化条件下，海带发酵 ２４ ｈ 时可得到最大
乙醇含量产量 ４ ０９ ｇ（以 １００ ｇ海带计）。
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