全 文 ：·综述与专论· 2015, 31(1):11-20
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
泛素（Ubiquitin）是真核生物中一种由 76 个
氨 基 酸 组 成， 仅 8.5 kD 的 小 分 子 调 节 蛋 白， 于
1975 年 被 发 现［1］。 泛 素 化 是 一 种 蛋 白 质 的 翻 译
后修饰，是泛素共价结合到蛋白质赖氨酸残基上
收稿日期 ：2014-06-09
基金项目 ：国家重大科学研究计划项目（2012CB910300， 2011CB910202），国家高技术研究发展计划项目（“863”计划）（2012AA020201），
国家自然科学基金项目（31271407），国际科技合作与交流专项（2014DFB30020）
作者简介 ：李杨，硕士研究生，研究方向 ：泛素连接酶底物的生物信息学 ；E-mail ：liyang_bprc@163.com
通讯作者 ：李栋，博士，副研究员，研究方向 ：蛋白质组学和生物信息学 ；E-mail ：lidong.bprc@foxmail.com
泛素连接酶-底物选择关系的研究进展
李杨  李栋
（军事医学科学院放射与辐射医学研究所 北京蛋白质组研究中心 蛋白质组学国家重点实验室，北京 102206）
摘 要 ： 泛素是一种包含 76 个氨基酸的小分子蛋白。泛素共价结合到底物的过程称为泛素化修饰。泛素化修饰过程是一个
由级联的泛素激活酶、泛素结合酶和泛素连接酶所介导的复杂过程，泛素化修饰具有高效、ATP 依赖、高度特异的特点。泛素化
修饰与细胞周期调控、细胞凋亡、转录调控、DNA 损伤修复等一系列生物学过程密切相关。在泛素化修饰过程中，泛素连接酶对
底物的识别，是决定泛素化修饰特异性的关键环节。泛素连接酶底物识别的相关机制研究不断被报道，鉴定泛素连接酶底物的高
通量方法也在不断的改进和发展。随着实验研究的不断深入，实验数据的不断产出，利用生物信息学进行泛素连接酶底物的研究
也开始受到关注。对泛素连接酶识别底物的相关机制、高通量泛素连接酶底物的鉴定方法、泛素连接酶底物的生物信息学研究和
生物信息学在泛素连接酶底物研究中的发展方向进行讨论。
关键词 ： 泛素化修饰 ；泛素连接酶 ；底物 ；生物信息学
DIO ： 10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.01.002
Research Advances in the Selective Relationship Between Ubiquitin
Ligases and Substrates
Li Yang Li Dong
（State Key Laboratory of Proteomics，Beijing Proteome Research Center，Beijing Institute of Radiation Medicine，Beijing 102206）
Abstract: Ubiquitin is a small-molecule protein composed of 76 amino acids. The covalent-bonding process between ubiquitin and
substrates is defined as Ubiquitination. Ubiquitination modification, an efficient, ATP-dependent, and highly specific process, is mediated by a
cascade regulation of ubiquitin activating enzymes, ubiquitin conjugating enzymes, ubiquitin ligase and deubiquitinating enzymes. Ubiquitination
is highly relevant with biological processes like cell cycle regulation, cell apoptosis, transcription regulation, DNA damage response and so on.
In the process of ubiquitination, the recognition between ubiquitin ligases and substrates is critical for the specificity. The mechanisms of such
recognition are being reported moreover the high throughput methods identifying E3’s substrate are being improved and developed. With the
accumulation of ubiquitination data from the deep-going research, the bioinformatics approach studying the selective relationship between E3s
and substrates is becoming a hot spot. This article will discuss the recognition mechanism between E3s and substrates, the high throughput
methods used for the identification of E3’s substrates, review the bioinformatics study about E3s’ substrates and highlight the future research
direction.
Key words: ubiquitination ；ubiquitin-ligase ；substrate ；bioinformatics
或者 N 末端的过程。泛素化修饰是一个多酶级联
的、消耗 ATP 的反应。参与泛素化过程的酶包括
泛 素 激 活 酶（E1，ubiquitin activating enzymes）， 泛
素 结 合 酶（E2，Ubiquitin conjugating enzymes）， 泛
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素 连 接 酶（E3，ubiquitin ligases）［2］ 和 去 泛 素 化
酶（Deubiquitinating enzyme，DUB）。 泛 素 化 修 饰
最为人们所熟知的功能是利用多聚泛素链标记靶蛋
白，介导被标记蛋白的蛋白酶体降解［3］。泛素化
修饰既能将单个的泛素修饰到底物，发生单泛素化
（Monoubiquitination），也可以将利用泛素本身所包含
的 7 个赖氨酸形成的多聚泛素链修饰到底物发生多
聚泛素化（Polyuniquitination）。除了利用自身所具
有的赖氨酸形成多聚泛素链，泛素还可以通过肽键
形成线性的泛素链［4］。这些复杂的修饰形式决定了
泛素化修饰在多种生物学过程中扮演重要角色。单
泛素修饰影响细胞的膜运输、内吞和病毒出芽等过
程［5，6］；由 48 位赖氨酸（K48）形成的泛素链发生
的修饰，主要介导蛋白质的蛋白酶体降解 ；由 63 位
赖氨酸（K63）形成的泛素链发生的修饰，与内吞
作用、炎症响应、蛋白质翻译和 DNA 修复相关。而
其他形式的泛素链与细胞周期、溶酶体降解、激酶
识别等一系列过程相关。
在泛素化修饰过程中，泛素连接酶对底物的选
择过程是泛素化调控特异性的关键。泛素连接酶负
责将泛素或多聚泛素链从 E2 转移到底物赖氨酸残基
或者蛋白质 N 端残基［7］，决定底物蛋白的命运。泛
素连接酶依据结构的不同主要分为 3 类 ：RING 类、
HECT 类、U-box 类。目前已知的 E3 数目至少超过
600 种［8，9］，多于激酶的数量（518 种）。泛素连接
酶与众多的生物学过程密切相关，如 Pellino 家族 E3
之前被认为通过促进 IRAK1 的泛素化调节天然免疫
信号通路，最近研究表明，Pellino 家族 E3 通过泛素
化参与更多的先天和适应性免疫调节，参与 TLR 信
号通路的调控［10］；PRP19［11］、RNF4［12］、RNF8［13］
等 泛 素 连 接 酶 参 与 DNA 损 伤 应 答 ；SCF（FBW7）
通过靶向 MCL1 发生泛素化降解调节细胞凋亡［14］；
FBXO31 介导 Cyclin D1 的降解，与细胞 DNA 损伤的
G1 期阻滞密切相关［15］。泛素化修饰几乎调控真核
细胞功能的所有方面。因此，泛素化修饰与许多疾
病有密切关系 ：泛素连接酶 Cbl-b 和 TAM 受体能利
用自然杀伤细胞调节癌细胞的转移［16］；FBXO11 的
失活会导致 BCL6 的过表达，从而引发弥散性巨型 B
细胞淋巴癌［17］；c-Cbl 和 Cbl-b 对人的骨细胞形成和
破坏起重要作用［18］。由于 E3 对底物识别具有特异性，
是非常有潜力的药靶。E3 与多种肿瘤的发生发展密
切相关，通过干预 E3 的功能，可以对多种癌症起到
治疗作用。目前，有多个团队正在研发针对泛素连
接酶 HDM2，或者干扰 HDM2-p53 相互作用的抑制
剂以稳定 p53 的表达，进而用于肿瘤治疗［19，20］。
E3 与底物特异性的选择机制和调控作用的发
现，对揭示泛素化修饰所参与的细胞调控过程，理
解泛素化修饰相关疾病的发病机理，研发高特异性、
低副作用的药物具有重要意义。现在对泛素连接酶
底物的研究，主要采用分子生物学方法，通过体内
或体外的实验，寻找特定泛素连接酶底物。目前也
建立了一些高通量的泛素连接酶底物鉴定方法，同
时生物信息学研究也在泛素连接酶底物的发现中进
行了一些尝试。这些研究为理解泛素连接酶与底物
选择关系，提供了多方面的帮助。本文将从泛素连
接酶底物识别机制、鉴定泛素连接酶底物的高通量
方法和泛素连接酶底物选择关系的生物信息学研究
3 个方面对泛素连接酶和底物选择关系的研究进展
进行综述。
1 泛素连接酶底物识别机制
由于泛素连接酶数目众多，并且存在大量复合
体泛素连接酶。在泛素连接酶识别底物的过程中，
有很多适配体参与其中。并且，泛素化修饰与多种
其它翻译后修饰存在着交互应答，特别是与磷酸化
修饰存在多种多样的相互调控作用。这些原因都导
致泛素连接酶对底物的识别机制变得异常复杂。
1.1 通过特定的序列特征识别底物
泛素连接酶对底物的识别，可能是由特定的序
列所介导的。这里的序列主要指结构域和 motif。结
构域（Domain）是指蛋白中具有特定结构的一段序列，
结构域通常为 60-300 个氨基酸长度。Motif（有翻译
为模体）是一些比较短的（通常小于 10 个氨基酸）、
包含一些特定氨基酸的序列段［21］。目前有许多关于
E3 利用特定的 domain 或 motif 识别底物的特定 motif
或 domain 的研究报道。
APC/C 复合体是一个由多个亚基组成的 RING
类 复 合 体 泛 素 连 接 酶，APC/C 复 合 体 利 用 Cdc20
和 Cdh1 亚基作为底物识别亚基，Cdc20 和 Cdh1 利
用 WD40 domain 识 别 一 些 特 定 的 motif 识 别 底 物。
2015,31(1) 13李杨等：泛素连接酶-底物选择关系的研究进展
APC/C 复合体识别底物的 motif 包括 D-box motif 和
KEN-box motif。D-box motif 又称为 RxxL motif，是指
包含 RxxL 氨基酸的一段序列，其中 x 表示任意氨
基酸。RxxL motif 在所有哺乳动物的 PLK1 同源蛋白
中都出现，具有很高的保守性［22］。利用这个 motif，
APC/C 复 合 体 识 别 PLK1、ID2［23］ 等 蛋 白。KEN-
box motif 可 识 别 多 种 底 物， 包 括 Cdc20，Cdc20 上
的 KEN motif 能被由 Cdh1 形成的 APC/C 复合体泛
素连接酶所识别并泛素化［24］。通过 KEN motif 被识
别的底物，包括与有丝分裂相关的中心体复制因子
STIL［25］、与转录相关的蛋白 TRRAP［26］等。
HECT 类泛素连接酶中也存在类似的底物识别
机 制， 最 典 型 的 是 NEDD4 家 族， 人 类 的 NEDD4
家 族 包 括 9 个 成 员 ：NEDD4、NEDD4-2/NED4L、
ITCH、SMURF1、SMURF2、WWP1、WWP2、
NEDL1 及 NEDL2［27］。该家族的 E3 结构上类似，N
端包含一个 C2 domain，C 端为 HECT domain，中间
段包含 2-4 个重复的 WW domain。该家族能够通过
WW domain 识别底物的 PY motif［28］（包含 PPxY 序
列的氨基酸段，x 代表任意氨基酸），实现底物识别，
如 NEDD4-2 能通过 WW domain 识别上皮细胞钠离
子通道的 β 和 γ 亚基的 PY motif［29］。
但是蛋白上具有这些 motif，并不是该蛋白被
E3 识别的必要条件。如 Axin 由 SMURF1 介导发生
K29 多聚泛素化，Axin 上具有 PY motif，但是通过
研究发现，SMURF1 上的 WW 结构域对于 Axin 泛
素 化 不 是 必 须 的，Axin 并 不 被 SMURF1 上 的 WW
domain 所识别［30］。进一步研究发现，SMURF1 上的
C2 domain 是泛素化 Axin 的关键结构域。另外，Zhi
等［31］在对 WWP1 进行综述时也介绍了 WWP1 既能
识别包含 PY motif 的底物，也能识别不包含 PY motif
的底物。并且给出了 19 个包含 PY motif 的底物和 8
个非 PY motif 的底物。在这些例子中，E3 可能依赖
一些人们所未知的 motif 对底物进行识别，但是这些
现象也说明了泛素连接酶与底物选择关系的复杂性。
1.2 利用适配体识别底物
所谓适配体（Adaptor）是一些与 E3 和底物发
生相互作用的蛋白，研究发现，E3 在调节底物泛素
化的过程中，除了直接与底物结合，有时候还有一
些适配体参与调节。这些适配体发挥多种多样的功
能。如 TGFβ 受体是一个复合体，能将信号跨膜传
递给 Smad 信号通路。TGFβ 能够被 Nedd4 家族泛素
连接酶 SMURF1 识别并降解。SMURF1 并不是直接
连接到 TGFβ 受体的亚基上，而是利用适配体 Smad7
结合 TGFβ，并介导 TGFβ 的泛素化降解［32］。
RING 类泛素连接酶中也存在类似的适配体，
特别是复合体泛素连接酶，其多利用 Cullin 蛋白作
为支架，连接用于识别 E2 的包含 RING 结构域的蛋
白（如 ROC1）和用于底物识别的亚基（70 多种 F-box
蛋白）。这些用于底物识别的亚基，某种意义上也可
算作是识别底物的适配体。非复合体的 RING 类泛
素连接酶 TRAF6，也能够利用 p62 蛋白，结合 NGF
受体 TrkA，并介导 TrkA 的 K63 泛素化［33］。
除了作为 E3 和底物连接的支架，适配体还具
有其他的作用，如激活或者抑制 E3 的活性，调节
E3 的细胞定位等。适配体所具有的这些丰富的功能，
除了决定 E3 底物识别的特异性，一定程度上还决定
了 E3 调控底物的时空特异性。
1.3 泛素化修饰与其他翻译后修饰的cross-talk
泛素化修饰与其他翻译后修饰存在广泛的 cross-
talk。目前，研究最多的是泛素化与磷酸化间的 cross-
talk。磷酸化既可激活泛素化修饰，也可抑制泛素化
修饰。如 β-catenin 和 IκB 都可被由 Cul1、skp1 和 f-box
蛋白 β-TRCP 组成的复合体 E3 所识别。但它们在通
常状态下并不被该复合体 E3 所识别，当 IκB 的第
32 位和第 36 位丝氨酸被磷酸化或当 β-catenin 的第
33 位和第 37 位丝氨酸被磷酸化时，才能被由 β-TRCP
形成的复合体泛素连接酶所识别［34］。
在 ITCH 泛 素 连 接 酶 的 活 性 调 控 过 程 中， 磷
酸化发生了更广泛的作用。ITCH 并非组成型活化
的泛素连接酶，前面所述 ITCH 泛素连接酶属于
NEDD4 家族，ITCH 会发生内部折叠和自身相互作
用，HECT domain 会与 WW domain 发生连接，从而
抑制 ITCH 的泛素连接酶活性。而激酶 JNK1 可以磷
酸化 ITCH 的 199 位丝氨酸、222 位苏氨酸和 232 位
丝氨酸，释放与 WW domain 结合的 HECT domain，
激活 ITCH 的泛素连接酶活性。激活后的 ITCH 可以
促进 JunB 的泛素化。当该过程需要被减弱或终止时，
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络氨酸激酶 Fyn 能够磷酸化 ITCH 的 371 位络氨酸，
这个位点位于 WW domain，磷酸化修饰后 ITCH 将
无 法 利 用 WW domain 与 底 物 的 PY motif 结 合［35］，
从而抑制 ITCH 的活性。
sumo 化修饰是一种类泛素化修饰，同样修饰底
物上的赖氨酸位点。在 DNA 修复过程中，存在着两
种潜在的泛素化与 sumo 化修饰的 cross-talk，第一
种是 PIAS 可能 sumo 化 RNF168 和 HERC2，HERC2
的 sumo 化造成其内部发生相互作用，使 HERC2 和
RNF8 组装成复合体，这个复合体能够配合 RNF168
在 DNA 损伤的位置附近的蛋白上形成泛素链。另一
种潜在机制是 PIAS 介导 MDC1 的 sumo 化和 DNA 损
伤位置附近蛋白的 sumo 化，sumo 化的 MDC1 能够
募集 RNF4，连同 RNF8 形成泛素链，并结合在之前
修饰在 DNA 损伤位点附近蛋白上的 sumo 蛋白，形
成 sumo-泛素混合链［36］。除了与泛素化修饰协同，
sumo 化修饰还和泛素化修饰存在许多竞争关系。泛
素化修饰能够促进 IKBα 的蛋白酶体降解，而 sumo
化修饰能够与 IKBα 的泛素化修饰发生竞争，从而维
持 IKBα 的稳定［37］。
作为另外一种重要的类泛素化翻译后修饰，
NEDD8 修饰与泛素化修饰之间也存在重要的 cross-
talk。NEDD8 修饰重要的功能之一，就是促进 SCF 复
合体泛素连接酶的活性。但是 NEDD8 并不影响 SCF
复合体泛素连接酶的组装，而是能够帮助募集 E2，
从而达到促进泛素化修饰的作用［38］。
甲基化修饰是组蛋白翻译后修饰中研究最多的
一类。某些组蛋白残基可以通过甲基化抑制或激活
基因表达，从而成为表观遗传。甲基化修饰的位点
通常为精氨酸和赖氨酸。组蛋白同样可以发生泛素
化修饰，组蛋白的甲基化修饰和泛素化修饰之间，
也存在着相互影响。如组蛋白 H2B 的 123 位赖氨酸
能够发生泛素化修饰，该修饰帮助起始组蛋白 H3
的 79 位甲基化修饰。组蛋白 H3 的 79 位甲基化修
饰需要酶 Dot1 的辅助，而 Dot1 促进组蛋白 H3 的
79 位甲基化，同时能够抑制组蛋白 H2B 的 123 位泛
素化修饰，从而形成反馈调节回路，控制组蛋白 H3
的甲基化修饰水平［39，40］。
磷酸化、甲基化等和多种类泛素化修饰与泛素
化修饰之间的 cross-talk，对泛素化修饰产生了帮助
E3 识别底物、激活或抑制 E3 活性、促进泛素链形成、
调控组蛋白甲基化修饰等一系列的调控作用，这些
调控存在非常精细的机制，使得泛素化修饰和其他
翻译后修饰的发生不仅具有底物选择的特异性，更
具有了时空的特异性。这些翻译后修饰借助它们之
间的协同或抑制关系，通过功能的组合，发挥更多
样的调控作用。
2 鉴定泛素连接酶底物的高通量方法
泛素的得名是因其在生物体内广泛的存在。而
数目众多的 E3 也决定了泛素化修饰在体内是大量发
生的。传统的泛素连接酶底物鉴定试验方法，多集
中于对单个 E3 和少数底物的选择关系的实验研究和
验证，这样的研究方法虽能比较精确的得到 E3 和底
物的选择关系，但实验通量低，难以达到全面研究
泛素连接酶和底物选择关系的目的。近些年来，一
些高通量实验方法可以进行较大规模的泛素连接酶
的底物发现。这些方法包括基于蛋白全局稳定性分
析（Global protein stability profiling，GPS）、 基 于 蛋
白质微阵列和基于质谱技术等的一系列方法。
2.1 基于全局蛋白质稳定性分析方法
蛋白质全局稳定性分析方法，巧妙地将编码
红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的核酸序列构建在同
一个腺病毒载体上，并且在两个荧光蛋白之间加入
核糖体入口，将编码绿色荧光蛋白的核酸和编码目
标蛋白的核酸构建在一起，利用该腺病毒侵染宿主
细胞，就能够在宿主细胞中等比例的表达红色荧光
蛋白和带绿色荧光蛋白的靶蛋白，如果靶蛋白被降
解，则红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的比例会发生
变化，利用流式细胞技术，可以进行蛋白质稳定性
分析［41］。
Hsueh-Chi 等［42］利用显性失活突变技术，替代
RNA 干扰技术，构建显性失活的 Cul1，Cul1 是构成
SCF 复合体泛素连接酶的支架蛋白，如果 Cul1 失活，
即便底物识别亚基能够识别并结合底物，也无法将
泛素修饰到底物。通过多轮的流式细胞筛选，最后
鉴定出因为 Cul1 失活，而导致蛋白质丰度发生显著
变化的蛋白，作为潜在的底物。利用该方法鉴定到
了大于 350 个潜在的底物，并且鉴定到了大部分已
知的底物。利用 GSP 方法鉴定泛素连接酶底物能够
2015,31(1) 15李杨等：泛素连接酶-底物选择关系的研究进展
鉴定稳定性发生变化的底物蛋白。但是造成泛素连
接酶底物降解的泛素化修饰主要是 K48 泛素链修饰，
K63 泛素链主要和信号转导相关。所以针对 K63 位
泛素链或者其他非降解的泛素化修饰形式，难以有
效使用该方法。
2.2 基于蛋白质微阵列的泛素连接酶底物鉴定
基于蛋白质微阵列的泛素连接酶底物鉴定技
术，主要是通过构建体外的泛素化体系，对构建在
微阵列上的蛋白质进行泛素化实验，之后利用多种
方法进行检测和分析。如 Andrews 等［43］利用蛋白
质微阵列鉴定了 SMURF1 的底物。通过给泛素连接
上生物素标签，泛素分子可以利用 streptavidin-Alexa
Flour 进行荧光检测，通过荧光判断是否发生了泛素
化。利用该方法，共有 89 个潜在的 SMURF1 底物
被鉴定。Loch 等［44］利用两块微阵列板，使用两种
泛素抗体与泛素发生抗原抗体反应。一种既能结合
单泛素，又能结合多聚泛素链 ；一种只能结合多聚
泛素链。通过进一步的 GO 分析，选取了部分结果
作为进行后续实验的备选底物。
基于蛋白质微阵列方法鉴定泛素连接酶底物，
相比 GPS 方法简单且高效，并且通过采用合适的泛
素鉴定方法，可以不受所修饰泛素链形式的影响。
但是利用蛋白质微阵列进行泛素连接酶底物鉴定，
需要构建体外的泛素化体系，筛选合适的 E2，然而
根据前面所述，泛素化修饰可能受到其他翻译后修
饰的调控，泛素化的发生也具有一定的时空特异性，
这些在体外泛素化修饰实验中难以模拟。另一方面，
利用蛋白质微阵列进行底物鉴定，所能覆盖的底物
规模，受到微阵列本身的限制。所以基于蛋白微阵
列进行泛素连接酶底物的鉴定，主要用于为后续更
深入的研究进行初步的底物筛选。
2.3 基于噬菌体展示技术的泛素连接酶底物鉴定
噬菌体展示（Phage display）技术是一种高通量
的研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-肽段、蛋白质-DNA
相互作用的方法。噬菌体展示技术的原理是将需要
研究的蛋白或多肽的基因与噬菌体表面蛋白的编码
基因融合，经过表达并装配成噬菌体后，待研究蛋
白或多肽会以融合蛋白的形式呈现在噬菌体表面。
而导入了多种蛋白的一群噬菌体，就构成了一个噬
菌体展示文库。利用噬菌体展示技术对泛素连接酶
底物进行筛查，首先需要进行阴性选择。将人脑
cDNA 展示文库与仅包含 E1、E2 和 His 标签泛素，
而不包含 E3 的体外泛素化系统以及 Ni-beads 共同孵
育。收集没有与 Ni-beads 结合的噬菌体，并用它们
感染 BLT5403 大肠杆菌进行扩增，扩增后的文库用
于阳性筛选。在阳性筛选过程中，将之前扩增的文
库与包含 E3 的体外泛素化系统及 Ni-beads 共同孵
育，Ni-beads 会结合 His 标签，所以发生泛素化修
饰的噬菌体会被 Ni-beads 所捕获。将这些噬菌体从
Ni-beads 上洗脱后，用这些噬菌体感染 BLT5403 大
肠杆菌扩增，再重复进行阴性、阳性筛选，经过多
轮筛选后，单克隆的噬菌体利用 PCR 进行测序，从
而得到 E3 的底物序列［45］。
该技术的原理决定它可以对非降解的泛素连接
酶底物进行考察，并且只要能够构建 E3 对应的体
外泛素化修饰系统，理论上就可以对底物进行筛查。
但该技术与利用蛋白质微阵列鉴定泛素连接酶底物
的原理类似，所以也存在和利用蛋白微阵列进行泛
素连接酶底物鉴定存在类似的限制。
2.4 基于质谱技术的泛素连接酶底物鉴定
基于质谱技术的泛素连接酶底物鉴定包括多
种方法，这些方法之间存在较大差异，其共同点是
最后都是通过质谱技术进行蛋白质鉴定。Yumimoto
等［46］发展了一种利用差异蛋白质组鉴定 F-box 构成
的复合体泛素连接酶底物的方法 DiPIUS。这两种方
法首先都需要构建野生型和突变的 F-box 蛋白，并
且给它们带上 FLAG 标签。突变的 F-box 蛋白不能
与 skp1 结合，也就不能构成完整的 SCF 泛素连接酶
复合体，无法介导底物发生泛素化。第一种方法是
将 F-box 在分别用 12C 和 13C 标记的细胞中表达，利
用 MG132 抑制蛋白酶体。然后通过免疫共沉淀技术
同时对野生型和突变型 F-box 蛋白进行沉淀，经过
酶切后进行质谱鉴定，进行差异蛋白质组分析。另
一种方法，将两种 F-box 蛋白分别在不标记的细胞
中表达，然后分别用免疫共沉淀技术对 F-box 蛋白
进行沉淀。利用 SDS-PAGE 蛋白电泳分离蛋白，酶
切后分别进行质谱鉴定，进行差异蛋白质组分析。
利用该方法，作者对 Fbxw7α、Skp2 和 Fbx15 的底物
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进行了鉴定，得到一些先前已知的底物，如 Fbxw7α
的底物 c-Myc、Skp2 底物 p27、Fbx15 底物 IPR1 和
IPR2，证明了方法的有效性。
另一种利用质谱鉴定底物的方法，是利用串联
的 UBA 富集泛素的方法进行底物鉴定。UBA 结构
域是泛素结合结构域，能够结合泛素。Shi 等［47］曾
利用 4 个串联的 UBA 拷贝富集泛素化蛋白，并通过
质谱技术鉴定泛素化修饰位点。Rubel 等［48］进一步
利用 4 个串联的 UBA domain 进行泛素化蛋白的富
集，首先分离新生大鼠心肌细胞，作为用于后续泛
素化试验的细胞系。将大鼠的 MuRF1 泛素连接酶包
装成带 Myc 标签的腺病毒，然后侵染之前分离的细
胞系，分别向对照组和试验组加入串联了 4 个 UBA
拷贝的琼脂糖珠（TUBE 组）和不带 UBA 结构域的
琼脂糖珠（Control 组）。孵育一段时间后进行分离，
从琼脂糖珠上分离蛋白（eluate），并保留上清液
（Supernatant）， 分 别 做 3 组 2 维 凝 胶 电 泳 ：Control
TUBE eluate VS Experiment TUBE eluate ；Experiment
TUBE supernatant VS Experiment agrose control superna-
tant ；Control TUBE supernatant VS Control agarose
control supernatant。如果鉴定 E3 的底物，第 1 组选
取 CtrleluateExpTUBE，第 3
组选取 Ctrlctrl>CtrlTUBE 的蛋白进行质谱鉴定。鉴定后
前两组得到的是发生泛素化的蛋白，第 3 组得到的
是组成型泛素化的底物。通过去冗余分析，可以得
到待研究泛素连接酶的底物。如果利用该方法进行
DUB 底物鉴定，只需要在对凝胶电泳后的结果进行
蛋白选取时遵循相反的原则即可。
质谱方法进行泛素连接酶底物的鉴定，分离和
获得潜在底物蛋白的方法多种多样，最后都需要通
过质谱技术对底物蛋白进行鉴定。所以利用质谱技
术鉴定底物蛋白，鉴定的覆盖率和准确性受到质谱
技术本身的影响和制约。
2.5 基于NEDD8修饰鉴定泛素连接酶底物
在之前讨论泛素化修饰与其他翻译后修饰的交
互中，介绍过 NEDD8 修饰是一种类泛素化修饰，可
将类泛素分子 NEDD8 修饰到底物的赖氨酸残基上。
利用这一性质，Zhuang 等［49］开发了一种鉴定泛素
连接酶底物的方法。直接鉴定泛素连接酶的底物有
一些困难，如泛素化底物通常较多，所以如果要直
接鉴定某一种泛素连接酶的底物，可能受到其他泛
素化修饰的干扰。而 NEDD8 修饰相比泛素化修饰，
是一种细胞内比较稀少的修饰，为了鉴定 IAP 泛素
连接酶的底物，Zhuang 等巧妙的将 NEDD8 的结合
酶 Ubc12 与 IAP 泛素连接酶进行了融合。融合后的
蛋白可以将 NEDD8 修饰到原本应该修饰泛素的底物
赖氨酸。通过鉴定被 NEDD8 修饰的蛋白，就可以
鉴定到泛素连接酶的底物。利用该方法，有 50 多个
IAP 泛素连接酶的底物被鉴定。
该方法设计非常巧妙，并且利用 NEDD8 修饰
代替泛素化修饰，避免了泛素化修饰底物鉴定中的
一些困难。但是泛素蛋白和 NEDD8 蛋白的空间结构
存在着一些差异，可能导致该方法存在一定的假阳
性和假阴性问题。
3 泛素连接酶底物选择关系的生物信息学
研究
随着泛素连接酶与底物选择关系研究的不断深
入，以及高通量鉴定泛素连接酶底物方法的不断产
生和发展，大量的泛素连接酶和底物选择关系的研
究数据不断产出。随之也产生了几个对泛素连接酶
和底物关系进行收录的数据库。另一方面，随着数
据的不断积累，利用生物信息学方法进行泛素连接
酶底物的研究和预测变得可能。
3.1 收录泛素连接酶和底物选择关系的数据库
E3net（http ：//pnet.kaist.ac.kr/e3net/）是一个以
E3 为中心，收录泛素连接酶及其底物的数据库［50］，
E3net 收 录 了 来 自 人、 小 鼠、 酵 母 等 多 个 物 种 的
2 201 个 E3 和 4 896 个底物数据。以人为例，收录
了 415 个 E3 和 1 590 个底物数据，其中 190 个 E3
包含有对应的底物信息。E3net 的数据由对 PubMed
数据库的文献摘要的文本挖掘、对 UniProt 数据库注
释信息的文本挖掘、对公共泛素化数据库的整合和
少量对高通量实验数据的整合构成。E3net 通过以
E3 或底物为中心浏览数据条目，提供了 E3 或底物
的 UniProt 访问号、描述该蛋白为 E3 或底物的文献
语句或 UniProt 注释、通路信息、参与的生物学过程、
功能、家族、定位、相关疾病等信息。如果该蛋白
有对应的底物或 E3 信息，则会提供描述它们之间特
2015,31(1) 17李杨等：泛素连接酶-底物选择关系的研究进展
异性选择关系的文献和数据库信息。为了更全面的
了解 E3 对底物的调控信息，E3net 还利用数据库中
的数据构建了一个 E3 和底物的调控网络。用户可以
可视化的对该网络进行浏览。
E3net 数据库是目前收录 E3 和底物选择关系最
全面的数据库，其数据具有多个来源，数据质量较
高。E3net 中收录了许多复合体的 E3，数据库对这
些复合体的亚基进行了系统收录并且特别标示了复
合体中负责底物识别的亚基。利用其构建的网络可
以方便的对 E3 和底物的相互选择关系进行浏览，帮
助进行 E3 底物调控网络的研究。但是数据库的数
据自 2012 年之后没有更新，也没有提供数据提交功
能，不利于用户帮助补充数据，并且不提供数据的
下载。
hUbiquitome（http ：//202.38.126.151/hmdd/hubi）
数据库是一个旨在收录高可信实验验证的人类泛素
化酶和底物数据的数据库［51］。数据库由于对数据的
要求标准比较严格，所有数据经过人工校验，所以
数据量相对较小。包含 1 个 E1、12 个 E2、138 个
E3、279 个底物和 17 个 DUB 数据。hUbiquitome 所
有数据基于 PubMed 数据库中的文献获得。hUbiqui-
tome 支持通过 blast 方式，利用序列信息搜索相关
的泛素化酶与底物数据。hUbiquitome 提供了全部数
据的下载，这相比前面介绍的 E3net 数据库，极大
地方便了研究者利用 hUbiquitome 数据库数据进行
更深入的泛素化机制讨论。hUbiquitome 数据库提供
了用户提交数据的功能。让用户可以参与进行数据
库的完善和补充。但是用户无法在线提交数据，需
要通过填写表格后邮件发送给作者的方式提交数
据，这在一定程度上会影响用户提交数据的积极性。
hUbiquitome 数据库数据自 2011 年 10 月后无更新。
SCUD（http ：//scud.kaist.ac.kr/）数据库是一个
收录酵母的泛素化相关酶与底物的数据库［52］。数据
库包含 42 个不同的 E3 和 940 个底物，并对 E3 进
行了分类，但是该数据库物种比较局限。除了上面
介绍的这些数据库外，泛素化相关的数据库还有收
录实验产出的底物和位点信息的 Ubiprot 数据库［53］、
收录植物泛素化酶系统的 plantsUPS［54］、收录植物
泛素化相关通路的数据库 plantsUBQ 等。
3.2 利用生物信息学方法进行泛素连接酶底物的
研究和预测
TRAF6 是一个 RING 类 E3，p62 可以作为泛素
连接酶 TRAF6 的适配体蛋白，帮助识别并结合底
物。Jadhav 等［55］通过对 TRAF6/p62 已知的两个底
物 NRIF 和 TrKA 进行分析，总结出了一个包含 10
个 氨 基 酸 的 motif ：［-hydrophobic-k-hydrophobic-x-x-
hydrophobic-polar1-hydrophobic-polar2-hydrophobic-］进
行底物的预测。该研究收集了 155 个 p62 的相互作
用蛋白和 54 个不发生相互作用的蛋白，利用 brute-
force 比对算法，对这些蛋白上 K 附近的氨基酸进行
motif 匹配。根据匹配结果，发现了一些可能以 p62
作为桥接蛋白的 TRAF6 底物。Jadhav 等［55］的研究
是较早利用生物信息学进行 E3 底物研究的工作，具
有一定的开创性。
Liu 等［56］ 建 立 了 一 种 利 用 KEN-box 和 D-box
motif 预测 APC/C 复合体 E3 底物的方法。通过考察
文献，共有 68 个 APC/C 底物中的 74 个 D-box motif
数 据 和 42 个 APC/C 底 物 中 的 44 个 KEN-box motif
数据被收集作为金标准数据集。作者定义满足这两
个 motif 的序列，以及上下游的 m，n 个氨基酸组
成一个 ARM（m，n），采用了之前发展的 GPS 方
法［57，58］，通过训练窗口大小（即选取合适的 m 值
和 n 值）、位点权重和对打分矩阵进行点突变，建立
预测模型。利用这个模型，可考察包含 KEN-box 和
D-box 的蛋白是否是 APC/C 复合物的底物，以及匹
配这两个 motif 的区域是否是 APC/C 的识别区域。
但是利用这两种生物信息学方法进行泛素连接
酶底物的预测都是借助 E3 识别底物的 motif 进行的，
然而目前对泛素连接酶识别底物的 motif 研究还比较
少，所以前面介绍的两项工作都只针对单个泛素连
接酶的底物进行讨论。
4 泛素连接酶底物选择关系研究展望
泛素化修饰作为一种重要的翻译后修饰，参与
了大部分生物学过程。泛素化修饰具有多样的修饰
形式，可以发挥多种多样的功能。随着泛素化相关
研究的不断发展，泛素连接酶底物高通量鉴定技术
的不断推进，对泛素连接酶底物的研究将更加的深
入，实验方法将更加的高效和可靠，随之，将会有
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.118
大量的泛素连接酶与底物选择关系数据持续产出。
随着这些数据的积累，生物信息学方法有望在泛素
连接酶底物选择关系包括泛素连接酶底物生物信息
学预测、泛素连接酶底物数据库构建和大规模发现
泛素连接酶底物方面发挥重要作用。
4.1 泛素连接酶底物的生物信息学预测
生物信息学在蛋白质相互作用预测领域取得了
很好的效果，并且随着时间的推进不断的有高水平
文献产出［59-62］。随着蛋白质相互作用研究的不断深
入，蛋白质相互作用预测不断加入新的特征，效果
不断提高。而泛素连接酶与底物的选择关系本质上
是一种特殊的蛋白质相互作用。所以通过借鉴蛋白
质相互作用预测的方法，结合泛素化修饰具有的性
质和生物学特征，对泛素连接酶底物进行生物信息
学预测，是很有潜力的研究方向。生物信息学预测
泛素连接酶底物，相比实验方法，花费少，效率高。
甚至可以利用生物信息学对全基因组进行扫描，构
建基于生物信息学预测的泛素连接酶底物选择网络，
这将对深入认识泛素连接酶底物选择机制和辅助实
验人员筛选泛素连接酶底物研究对象提供很大的
帮助。
4.2 泛素连接酶底物选择关系数据库的构建
虽然目前已建立了 E3net、hUbiquitome 等收录
泛素连接酶底物选择关系的数据库，但收录的数据
或来自对文献进行的文本挖掘，或来自人工对文献
的阅读和整理，这些数据库往往存在数据量较小、
数据库维护较差、数据更新不及时的问题。而泛素
连接酶底物数据不断产出，大量数据未被很好地收
录。所以构建一个数据规模较大，更新及时的泛素
连接酶底物数据库非常必要。并且可以借鉴相互作
用数据库，为实验人员提供数据提交平台，让实验
人员在使用数据库数据的同时参与到数据库的数据
补充中来。另外可以借鉴 STRING 数据库的构建方
式［63］，将预测得到的数据加入数据库，以帮助实验
人员进行实验设计，并且可以通过实验人员验证预
测数据。
4.3 大规模发现泛素连接酶底物
大规模泛素连接酶底物的发现需要进行大量的
实验工作。可以利用生物信息学辅助实验验证，降
低实验规模。随着生物信息学预测泛素连接酶底物
技术的不断发展，如果能够取得接近高通量实验的
准确性和覆盖度，那么利用生物信息学预测，进行
底物的初步筛选，可以减少实验研究的工作量，降
低实验成本。或者可以利用生物信息学方法，采取
一定的策略，进行合理的实验设计，如借鉴酵母双
杂交实验中用到的 smart pooling［64］方法，借助生物
信息学设计合理的实验分组方案，在降低实验次数
的同时，保证一定的实验重复，提高实验的准确性。
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（责任编辑 狄艳红）