全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
植物在生长发育中时常受到不良环境胁迫的
影响，如盐渍、干旱、低温等，其中盐害在世界许
多地区存在，严重影响农林业生产。盐胁迫对植物
造成的损伤主要包括渗透胁迫和离子毒害，而这两
收稿日期 ：2014-03-12
基金项目 ：高等学校学科创新引智计划资助项目（B13007），长江学者和创新团队发展计划资助项目（IRT13047），北京市教委共建项目
（101009）、北京市公园管理中心课题（0710016），北京市自然科学基金项目（6112016）
作者简介 ：张徐俞，女，硕士研究生，研究方向 ：植物端粒、端粒酶 ；E-mail ：zhang545437383@163.com
通讯作者 ：卢存福，男，教授，研究方向 ：植物分子细胞生物学 ；E-mail ：lucunfu@bjfu.edu.cn
盐胁迫下沙冬青细胞端粒酶活性的变化与 DNA
稳定性的关系
 张徐俞1  王瑾瑜2  郑广顺3  张俊琦1  卢存福1
（1. 北京林业大学生物科学与技术学院 分析测试中心 林木育种国家工程实验室，北京 100083 ；2. 清华大学分析测试中心，北京 100084 ；
3. 中国科学院植物研究所，北京 100093）
摘 要 ： 沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）是亚洲中部荒漠地区的常绿阔叶灌木，是古老的第三纪孑遗植物，具有极强
的抗逆能力。旨在探究盐胁迫下沙冬青细胞端粒酶活性变化与染色体 DNA 稳定性的关系。结果表明，在 100 mmol/L NaCl 的低浓
度盐胁迫处理下，随着处理时间的增加，端粒酶活性没有增加，未出现明显的 DNA 降解现象 ；当在 500 mmol/L 高浓度盐胁迫时，
处理的初期端粒酶活性迅速的增加，但随着处理时间的延长，端粒酶活性下降，此时 DNA 未明显降解 ；当移除 NaCl 胁迫，端粒
酶活性增加 1.4 倍，DNA 保持稳定。因此推测，在盐胁迫下，沙冬青细胞端粒酶活性的维持对避免细胞遭受不可逆损伤，保持染
色体 DNA 稳定性具有一定的作用。
关键词 ： 沙冬青 盐胁迫 端粒酶 DNA 损伤
Effects of Salt Stress on Telomerase Activity in Relation to DNA
Stability of Ammopiptanthus mongolicus Cells
Zhang Xuyu1 Wang Jinyu2 Zheng Guangshun3 Zhang Junqi1 Lu Cunfu1
（1. College of Biological Sciences and Biotechnology，Analysis and Testing Center，National Engineering Laboratory for Tree Breeding，
Beijing Forestry University，Beijing 100083 ；2. Analysis and Testing Center，Tsinghua University，Beijing 100084 ；
3. Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100093）
Abstract: Ammopiptanthus mongolicus, the evergreen broadleaf shrub indigenous to the northwest desert of China, is a residual plant of
the ancient subtropical area in the Tertiary Period and has been identified as the national tertiary protection species. This research was conducted
to explore the relationship between DNA damage and telomerase activity of Ammopiptanthus mongolicus cells under salt stress. The results
showed that telomerase activity was increased during the first 3 d of low salt（100 mmol/L NaCl）treatment. However, when culture cells were
treated with 500 mmol/L NaCl, telomerase activity increased rapidly at the initial stage, while declined after 2 day salt stress. Telomerase activity
increased 1.4-fold in the recovery phase when 500 mmol/L NaCl was removed from the growth medium. DNA damage was not obvious during the
NaCl treatment time or in the phase when NaCl was removed from the growth medium. It is proposed that plants might have developed a highly
efficient DNA repair system to cope with transient salt stress, and telomerase may play an important role in it.
Key words: Ammopiptanthus mongolicus Salt stress Telomerase DNA damage
种原初反应的结果，即产生活性氧（reactive oxygen
species，ROS）［1］，活性氧具有很强的氧化能力，低
浓度 ROS 则能诱导某些抗氧化酶基因的表达，提高
酶活性，从而消除活性氧 ；高浓度 ROS 可直接作用
2014年第10期 135张徐俞等：盐胁迫下沙冬青细胞端粒酶活性的变化与DNA稳定性的关系
于 DNA，使细胞核内 DNA 降解［2］。DNA 损伤直接
导致与细胞维持生理功能的某些基因失去表达活性，
进而导致细胞衰老［3］。Allsopp 等［4］ 的研究表明，
活性氧可以使 DNA 单链断裂积累并导致端粒缩短。
端粒酶是具有逆转录活性的核糖核蛋白，具有
维持端粒长度，保护和修复 DNA 损伤，维持细胞活
力的功能［5］。在对人和动物的研究表明，由细胞凋
亡所引起的 DNA 损伤可在端粒酶的作用下修复。在
细胞受到外界刺激而造成细胞内 DNA 断裂等损伤
时，端粒酶逆转录酶基因（TERT）则大量表达，修
复 DNA 损伤，但其修复能力具有一定的限度［6，7］。
烟草细胞中也存在同样的修复现象，烟草细胞在受
到重金属镉胁迫时发生凋亡，染色体浓缩且 DNA 发
生片段化，但是如果能够及时地移除这种胁迫，这
种凋亡是可以修复的，并且这种修复同端粒酶活性
的上升或维持有一定的关联性［8］。
沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）是我国西
北荒漠地区的常绿灌木，是亚热带地区第三纪残遗
物种，具有较强的抵抗干旱、寒冷、高温、盐碱等
的特性，并已被确定为国家三级保护树种［9，10］。沙
冬青自然分布的地区含盐量高达 0.38%，其种子在
浓度低于 1.2% NaCl 溶液中可以正常发芽，幼苗在
0.9% 盐浓度下生存良好，因此沙冬青具有很强的耐
盐碱的特性，是植物抗逆研究的理想材料［11］。有关
沙冬青抗逆分子机理的研究，目前主要集中在抗逆
基因的克隆和功能验证［12-14］，但逆境胁迫下染色体
DNA 稳定性与抗逆能力关系的研究，还未见报道。
本研究通过对沙冬青细胞进行盐胁迫处理，检测在
不同浓度盐胁迫下染色体 DNA 的稳定性及端粒酶活
性的变化，旨在探讨端粒酶对维持逆境胁迫下染色
体 DNA 稳定性可能所起的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
沙冬青悬浮细胞 ：在 40 mL 沙冬青液体培养基
中（B5+1.0 mg/mL 6-BA+1.0 mg/mL NAA），按照 1∶5
的比例加入沙冬青细胞进行悬浮培养。培养 13 d，
每 2 d 取样一次，称重，确定生长特性。
1.2 方法
1.2.1 盐胁迫处理 将沙冬青悬浮细胞在含 NaCl 0、
100、300 和 500 mmol/L 的培养基中培养 3 d，然后
再转入不含盐的培养基中培养 3 d。每天取一次样。
1.2.2 TTC 法测定细胞活力 参照刘华等［15］TTC
（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）法测定红豆杉细胞活力
的方法，取 100 mg 不同浓度盐处理的沙冬青愈伤加
入离心管中，将愈伤用镊子夹碎，在离心管中加入
3 mL 的 TTC 溶液，用锡箔纸包好避光，放 22℃培
养箱中培育 12 h。用枪头吸去 TTC 溶液，加入蒸馏
水洗 2-3 次。离心机 500×g 离心 3 min，收集细胞，
然后加入 3 mL 95% 的酒精，悬浮细胞。置入 60℃
水浴锅水浴 10 min，冷却至室温后定容至 3 mL，摇匀。
分光光度计测定其在 485 nm 处的吸光值。
1.2.3 端粒酶蛋白提取和检测 端粒酶的组成成分
中含有 RNA，极容易被降解，因此，应该和提取
RNA 一样，尽量在低温条件下快速操作、必须使用
RNase-free 的耗材、桌面最好用固相 RNase 清除剂
清洁。
参照 Fitzgerald 等［16］的方法，称取 0.3 g 盐处理
后的沙冬青悬浮细胞，将材料放入预冷的研钵中迅
速研磨，加入预冷的 CHAPS buffer 800 μL，放在冰
浴中裂解 30 min，4℃ 16 000×g 离心 20 min，离心
后在超净台中取上清，加入 10% W/V PEG8000［17］，
放在冰上沉淀 30 min，每隔 3-5 min 颠倒混匀一次，
16 000×g 离心 10 min，去上清，再在沉淀中加入
CHAPS 裂解液 200 μL，在冰上静置裂解 30 min，然
后继续 4℃ 16 000×g 离心 10 min，-80℃保存。12%
聚丙烯酰胺胶电泳，荧光染料染色，用自动电泳凝
胶成像分析仪进行扫描，Quality one 软件分析条带。
1.2.4 DNA 损伤的检测 提取沙冬青细胞 DNA，用
琼脂糖凝胶电泳及 EB 染色测定 DNA 稳定性，紫外
透射仪下观察 DNA 条带，用自动电泳凝胶成像分析
仪进行扫描。
2 结果
2.1 沙冬青悬浮细胞培养及生长特性
为了确定沙冬青悬浮细胞的继代时间，将沙
冬 青 愈 伤 组 织 放 入 40 mL 液 体 培 养 基 中（B5+1.0
mg/mL 6-BA+1.0 mg/mL NAA），继代两次后，再将其
按照 1∶5 比例继代到新培养基中，隔天测定细胞鲜
重，得到 S 型生长曲线。继代 3 d 后，沙冬青悬浮
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期136
度的增加下降速度也越快，一旦移除胁迫条件后，
低浓度的盐胁迫下，细胞活力会回升。
2.3 盐胁迫下DNA的稳定性
沙冬青悬浮细胞在盐胁迫后，通过琼脂糖凝胶
电泳观察 DNA 降解程度。结果（图 3）显示，在 0
mmol/L NaCl 处理下，刚继代的悬浮细胞能检测到不
太明显的 DNA，基本检测不到 DNA 拖尾条带。在
300 mmol/L 和 500 mmol/L NaCl 处 理 下， 出 现 轻 微
DNA 拖尾条带，移除 NaCl 胁迫后，DNA 拖尾反而
变得较明显，但主带仍很清晰，在点样孔中有明显
残留，可能是由于蛋白或其它杂质没有去除干净，
且其条带主带较其它带明显，可能 DNA 浓度较大，
导致杂质较多，出现拖尾现象。这些结果表明，在
盐胁迫及移除盐胁迫的恢复期，染色体 DNA 由于遭
受损伤加速降解。
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0
1 3 5⭏䮯ᰦ䰤d勌䟽g/mL 7 9 11 13
图 1 沙冬青悬浮细胞生长曲线
细胞进入对数生长期，7 d 后进入到静止期（图 1）。
2.2 盐胁迫下沙冬青悬浮细胞活力
将悬浮培养 10 d 的沙冬青悬浮细胞分别继代于
含 0、100、300 和 500 mmol/L NaCl 的液体培养基中，
25℃，130 r/min 悬浮培养 3 d，每天取样，3 d 后将
悬浮细胞转入不含盐的培养基中再悬浮培养 3 d，每
天取样，测定 6 d 中所取细胞的细胞活力。
由图 2 可知，沙冬青悬浮细胞的相对活力随着
生长时间的增长不断的增大。100 mmol/L NaCl 处理
的沙冬青悬浮细胞的相对活力，在盐胁迫的 3 d 中，
其活力不断的下降，一旦移除盐胁迫的条件，细胞
活力有所上升。300 mmol/L NaCl 处理的沙冬青悬浮
细胞的相对活力，在盐胁迫的 3 d 中，其活力迅速
地减小，移除盐胁迫后，细胞活力虽然有所回升，
但很快又出现下降趋势。500 mmol/L NaCl 处理的沙
冬青悬浮细胞与 300 mmol/L NaCl 处理的变化趋势基
本相当，但是其下降的趋势较 300 mmol/L NaCl 处理
要迅速。在移除胁迫后，也没有迅速的回升。由此
可知，在盐胁迫下，沙冬青悬浮细胞活力随着盐浓
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1 2 3 4 5 6⭏䮯ᰦ䰤d⴨ሩ㓶㜎⍫࣋ 0 mmol/L100 mmol/L300 mmol/L500 mmol/L
图 2 盐胁迫处理下沙冬青悬浮细胞活力变化
M 1 2 3 4 65 M 7 8 9 10 1211
M 13 14 15 16 1817 M 19 20 21 22 2423
M ：DNA Marker ；1-6 ：0 mmol/L NaCl 处 理 6 d 的 沙 冬 青 悬 浮 细 胞 ；7-9，
13-15，19-21 ：分别为用 100、300、500 mmol/L NaCl 处理 3 d 的沙冬青悬
浮细胞 ；10-12，16-18，22-24 ：分别为用 100、300、500 mmol/L NaCl 处
理 3 d 后移除胁迫的沙冬青悬浮细胞
图 3 琼脂凝胶电泳检测沙冬青悬浮细胞在不同浓度盐胁迫
下 DNA 稳定性
2.4 盐胁迫下沙冬青悬浮细胞端粒酶活性的变化
同测定细胞活力一样，选择了 4 个盐浓度（0、
100、300 和 500 mmol/L NaCl）来处理沙冬青悬浮细
2014年第10期 137张徐俞等：盐胁迫下沙冬青细胞端粒酶活性的变化与DNA稳定性的关系
胞，处理时间和处理方式都与细胞活力测定保持一
致。在没有盐胁迫的情况下，端粒酶活性随着细胞
的生长基本保持稳定。100 mmol/L NaCl 处理下，端
粒酶活性比没有盐胁迫的要高，而移除胁迫后端粒
酶活性缓慢增加。当 NaCl 的浓度增加到 300 和 500
mmol/L 时，在处理的初期端粒酶活性迅速增加，但
随着处理时间的延长，端粒酶活性下降，一旦移除
胁迫，端粒酶活性恢复到对照或超过对照水平（图 4，
图 5）。
制可以通过染色体端粒片段检测获得［20］。在对人的
研究中发现，端粒酶可以通过增加细胞分裂和减少
细胞凋亡来增加细胞的寿命，同时端粒酶可以调节
DNA 损伤应答，保证染色体末端 DNA 的稳定性［21］。
Fojtova 等［8］对烟草细胞进行镉胁迫研究表明，在 3
d 胁迫处理时间内，端粒酶活性一直增加，在移除
镉胁迫的 3 d 恢复期，端粒酶活性增加，细胞 DNA
损伤也获得修复，细胞恢复活力 ；但一旦超出 3 d
这一临界点，细胞 DNA 损伤就不能被修复，走向衰
亡。因此，这也证明了端粒酶在细胞 DNA 损伤修复
中起到了很重要的作用。
本研究中，无论是低盐（100 mmol/L NaCl）还
是高盐浓度（500 mmol/L NaCl）处理下，随着处理
时间的增加，均未出现明显的 DNA 降解现象 ；低
盐浓度处理下，端粒酶活性较对照组高，而在 500
mmol/L 高浓度盐胁迫时，处理的初期端粒酶活性迅
速的增加，但随着处理时间的延长，端粒酶活性下降，
但 DNA 未明显降解 ；当移除 500 mmol/L NaCl 胁迫，
端粒酶活性及 DNA 保持稳定。因此推测，在盐胁迫
下，沙冬青细胞维持高的端粒酶活性对避免细胞遭
受不可逆损伤，保持染色体 DNA 稳定性可能具有一
定的作用。
目前，植物端粒酶参与细胞凋亡修复的机制依
然不是很清楚，研究报道极其有限。但前人及本研
究暗示，深入研究端粒酶逆转录酶在植物非生物胁
迫抗性损伤修复中的作用，可能会为揭示植物抗逆
分子机理提供一条新的路径。
4 结论
在低盐和高盐胁迫下，沙冬青细胞 DNA 都没
1 2 3 4 65 7 8 9 10 1211
13 14 15 16 1817 19 20 21 22 2423
1-6 ：正常条件下生长的沙冬青悬浮细胞的端粒酶活性 ；7-9，13-15，19-
21 ：分别为用 100、300 和 500 mmol/L NaCl 处理 3 d 的沙冬青悬浮细胞的端
粒酶活性 ；10-12，16-18，22-24 ：分别为用 100、300 和 500 mmol/L NaCl
处理 3 d 后移除胁迫的沙冬青悬浮细胞的端粒酶活性
图 4 不同浓度盐胁迫下沙冬青悬浮细胞端粒酶活性的变化
1
1
0
2
3
4
5
6
7
8
9
10ㄟ㋂䞦⴨ሩ⍫ᙗ
2 3 4 5 6⭏䮯ᰦ䰤d 0 mmol/L100 mmol/L300 mmol/L500 mmol/L
图 5 沙冬青悬浮细胞在不同浓度盐胁迫下端粒酶相对活性
的变化
3 讨论
植物在整个生长发育周期中都会受到外界各种
生物或非生物胁迫，这些伤害会对植物造成或大或
小的损伤，包括生长抑制、光合作用下降、能耗增加，
衰老甚至死亡［18］，而对于细胞最直接的是其 DNA
损伤，导致细胞凋亡［19］。拟南芥中由端粒缩短引起
的细胞死亡是有某种类凋亡方式来完成的，这个机
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期138
有出现明显的降解现象 ；端粒酶活性在 100 mmol/L
NaCl 的低浓度盐胁迫处理下无明显变化，而在 500
mmol/L 高浓度盐胁迫时，在处理初期端粒酶活性迅
速增加，但随着处理时间的延长，端粒酶活性下降，
当移除胁迫，端粒酶活性迅速增加。沙冬青细胞端
粒酶活性的维持对避免细胞遭受不可逆损伤，维持
染色体 DNA 的稳定性具有一定的作用。
参 考 文 献
［1］Imlay JA, Chin SM, Linn S. Toxic DNA damage by hydrogen
peroxide through the Fenton reaction in vivo and in vitro［J］.
Science, 1988, 240（4852）：640-642.
［2］Lorenz M, Saretzki G, Sitte N, et al. BJ fibroblasts display high
antioxidant capacity and slow telomere shortening independent of
hTERT transfection［J］. Free Radic Biol Med, 2001, 31（6）：
824-831.
［3］赵晨阳 , 郑荣梁 . DNA 氧化性损伤与端粒缩短［J］. 生物化学
与生物物理进展 , 2000, 27（4）：351-353.
［4］Allsopp RC, Vaziri H, Patterson C, et al. Telomere length predicts
replicative capacity of human fibroblasts［J］. Proc Natl Acad Sci
USA, 1992, 89（21）：10114-10118.
［5］Mukherjee S, Firpo EJ, Wang Y, et al. Separation of telomerase
functions by reverse genetics［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2011,
108（50）：E1363-E1371.
［6］Blackburn EH. Switching and signaling at the telomere［J］. Cell,
2001, 106（6）：661-673.
［7］Mukherjee S, Firpo EJ, Wang Y, et al. Separation of telomerase
functions by reverse genetics［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2011,
108（50）：E1363-E1371.
［8］Fojtova M, Fulneckova J, Fajkus J, et al. Recovery of tobacco cells
from cadmium stress is accompanied by DNA repair and increased
telomerase activity［J］. J Exp Bot, 2002, 53（378）：2151-2158.
［9］Shi J, Liu M, Shi J, et al. Reference gene selection for qPCR in
Ammopiptanthus mongolicus under abiotic stresses and expression
analysis of seven ROS-scavenging enzyme genes［J］. Plant Cell
Rep, 2012, 31（7）：1245-1254.
［10］ Zhou Y, Gao F, Liu R, et al. De novo sequencing and analysis of
root transcriptome using 454 pyrosequencing to discover putative
genes associated with drought tolerance in Ammopiptanthus
mongolicus［J］. BMC Genomics, 2012, 13 ：266.
［11］ 丁琼 , 王华 , 贾桂霞 , 等 . 沙冬青种子萌发及幼苗生长特性［J］.
植物生态学报 , 2006, 30（4）：633-639.
［12］史军娜 , 刘美芹 , 师静 , 等 . 沙冬青 GATA 型锌指蛋白基因序
列及表达分析［J］. 北京林业大学学报 , 2011, 33（3）：21-
25.
［13］ 智 冠 华 , 史 军 娜 , 赵 晓 鑫 , 等 . 转 沙 冬 青 锌 指 蛋 白 基 因
AmZFPG 烟草非生物胁迫抗性分析［J］. 园艺学报 , 2013, 40
（4）：713-723.
［14］Pang T, Ye CY, Xia X, et al. De novo sequencing and transcriptome
analysis of the desert shrub, Ammopiptanthus mongolicus, during
cold acclimation using Illumina/Solexa［J］. BMC Genomics,
2013, 14（1）：488.
［15］刘华 , 梅兴园 . TTC 法测定红豆杉细胞活力［J］. 植物生理学
通讯 , 2001, 37（6）：537-539.
［16］Fitzgerald MS, Riha K, Gao F, et al. Disruption of the telomerase
catalytic subunit gene from Arabidopsis inactivates telomerase and
leads to a slow loss of telomeric DNA［J］. Proc Natl Acad Sci
USA, 1999, 96（26）：14813-14818.
［17］王瑾瑜 , 张徐俞 , 王雅群 , 等 . 用改进的 TRAP 法测定树木端
粒酶活性［J］. 应用与环境生物学报 , 2012（4）：682-686.
［18］刘頔 , 宋涵 , 李凤兰 , 等 . 植物端粒与端粒酶研究进展［J］.
北京林业大学学报 , 2010, 32（5）：163-167.
［19］Nawkar GM, Maibam P, Park JH, et al. UV-induced cell death in
plants［J］. Int J Mol Sci, 2013, 14（1）：1608-1628.
［20］Zhang L, Tamura K, Shin-Ya K, et al. The telomerase inhibitor
telomestatin induces telomere shortening and cell death in
Arabidopsis［J］. Biochim Biophys Acta, 2006, 1763（1）：39-
44.
［21］Mukherjee S, Firpo EJ, Wang Y, et al. Separation of telomerase
functions by reverse genetics［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2011,
108（50）：E1363-E1371.
（责任编辑 马鑫）