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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第12期
我国是玉米生产大国和消费大国，产业链长，
年度间的丰产与歉收对国家粮食安全和人民生活都
有重要影响。然而，近年来玉米弯孢叶斑病［Curvu-
laria lunata（Wakker）Boed.］危害严重，1996-2001
年，连续几年该病害大发生，仅辽宁省 1996 年发生
面积就达 16.8 万 hm2，严重地区减产 50% 以上，有
1.6 万 hm2 玉米绝产［1，2］。虽然近几年该病害发生有
所减轻，但个别地区仍造成严重损失［3，4］。据报道，
收稿日期 ：2014-06-05
基金项目 ：山东省科技发展项目（2009GG10009022），山东省自然科学基金项目（ZR2011CL005），山东省“泰山学者”建设工程专项经费
资助项目（BS2009NY040）
作者简介 ：夏淑春，女，副教授，研究方向 ：植物有害生物综合治理 ；E-mail ：xiashuchun@163.com
通讯作者 ：鄢洪海，男，博士，教授，研究方向 ：植物病理生理与分子生物学 ；E-mail ：hhyan@qau.edu.cn
玉米弯孢叶斑病菌 REMI 白化突变体的筛选与
致病性测定
夏淑春1  王学武2  张茹琴1  鄢洪海1
（1. 青岛农业大学农学与植物保护学院，青岛 266109 ；2. 青岛市植物保护站，青岛 266100）
摘 要 ： 旨在探讨玉米弯孢叶斑病菌致病机制及遗传变异特性，利用限制性内切酶介导的基因整合技术（REMI）对
Curvularia lunata 进行了遗传转化，共获得 109 个稳定的突变株。PCR 检测结果表明，质粒 pUC-JS 已成功导入突变株中，转化子
既有单拷贝也有多拷贝，白化菌株单拷贝插入频率为 40%。此外，白化玉米弯孢叶斑病菌 REMI 突变株菌落颜色与野生菌株差异
明显，并且在致病性上也明显弱于野生菌株 ；质粒拯救、测序与 blast 分析推测插入可能导致 FAD3 基因功能丧失。
关键词 ： 玉米弯孢菌叶斑病菌 REMI 白化菌株 致病性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.018
Bending Spore of Corn Leaf Spot Fungus REMI Albino Mutant
Screening and Determination of Pathogenic Transformation
Xia Shuchun1 Wang Xuewu2 Zhang Ruqin1 Yan Honghai1
（1. College of Agronomy and Plant Protection，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109 ；
2. Qingdao Plant Protection Station，Qingdao 266100）
Abstract: To investigate bending spore corn leaf spot fungus pathogenic mechanism and genetic variation characteristics, this study using
restriction enzymes mediated gene integration technology（REMI）of Curvularia lunata genetic transformation, received 109 stable mutant
strains. PCR detection results showed that the plasmid pUC-JS has successfully imported mutant strains, into the son has both single copy and
copy, albino strain single copy insert frequency was 40%. In addition, an albino corn bending spore bacteria leaf spot REMI contrast with wild
strain of the mutant strains colony color, and also significantly weaker than wild on pathogenic strains. Plasmid save, sequencing and analysis of
blast speculated that inserts may result in the loss FAD3 gene function.
Key words: Curvularia lunata REMI Albino mutant Pathogenic
玉米弯孢叶斑病菌自然条件下经常有菌株白化现象，
并且白化菌株致病性出现变异［5］。
在植物病原真菌中，Lu（1994）首先用 REMI
插入突变成功标记了玉米小斑病菌（Cochliobolus
heterostrophus）Tox1 毒素基因位点，随后，该实验
室利用质粒拯救的方法克隆了突变基因，即线性聚
乙酮醇（linear polyketide）合成酶的基因——PKS1，
该 酶 是 T-毒 素 合 成 所 必 需 的。Tanaka 等（1999）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期112
从 日 本 香 梨 黑 斑 病 菌 Alternaria alternata 的 984 个
REMI 转化体中鉴定出了 3 个不能致病，并丧失产生
AK-毒素的突变体，分离出了参与 AK-毒素生物合
成途径的两个基因 AKT1 和 AKT2［6］。目前 REMI 技
术已经广泛应用于真菌尤其是植物病原真菌的研究，
并因其高效性已成为植物病原真菌研究中的一种重
要手段。本研究利用限制性内切酶介导整合（REMI）
技术对该病菌进行遗传转化，旨在探讨玉米弯孢叶
斑病菌致病机制。
1 材料与方法
1.1 材料
玉米弯孢叶斑病菌菌株 LZ-1（采自山东莱州）
由本实验室提供，玉米自交系黄早四由青岛农业大
学遗传研究室惠赠。质粒 pUC-JS 由筑波大学植物病
理研究室惠赠（包含一个潮霉素磷酸转移酶抗性基
因 hph），有 Hind Ⅲ、BamH I、Xab I、Kpn I 等多种
限制性酶等单酶切位点。
1.2 方法
1.2.1 REMI 突变体的制备
1.2.1.1 玉米弯孢叶斑病菌原生质体的制备 玉米
弯孢叶斑病菌原生质体制备参考张建萍等［7］方法，
并作适当修改。1 g 菌体加入 25 mL pH7.0 缓冲液，
再加入 5% 的 DTT，放置摇床上慢速振荡 30 min，
然后用 DF 液离心洗涤两次，吸除上清，加入 5 mL
高渗缓冲液制成悬浮液（1 mL 悬浮液加入 4 mL STC
液 ：0.7 mol/L 山 梨 醇、Tris-HCl（pH7.5）10 mL、
CaCl2 1.11 g、ddH2O 补平至 1 000 mL），然后加入 4 g/L
细胞壁降解酶于 80℃，80 r/min 振荡 4 h，形成原生
质体，用 500 目尼龙筛过滤，滤液 2 000 r/min 离心
去除酶液，用 STC 液洗涤两次，最后加入 5 mL STC
液制成原生质体悬浮液。
1.2.1.2 质粒提取及线性化 质粒 pUC-JS 转化 E.
coli 菌 株 DH5α， 质 粒 提 取 和 Hind Ⅲ、BamH I 和
Kpn I 酶切参考 Akamatsu 等［8］方法，略做改进。
1.2.1.3 菌株基因组 DNA 提取 采用 CTAB 法提取
玉米弯孢叶斑病菌基因组 DNA，具体参照 George
等［9］的方法进行。
1.2.1.4 REMI 转化 REMI 转化方法参考李波等［10］
和张建萍等［11］方法，略加改动。在 50 mL 离心管
中加入线性质粒 40 μg、浓度为 10 U/μL 限制性内切
酶 Hind Ⅲ 10 μL、STC 液 200 μL，配制成酶-质粒混
合液，然后向离心管中加入 100-200 μL 原生质体悬
浮液，并使其与酶-质粒混合液混匀，置冰上 15-20
min，缓慢向管中加入 2 mL 60% PEG，冰浴 20-25
min，然后将离心管取出在 28℃下放置 10-20 min，
加入 5 mL 预冷的 STC 液，4℃下 4 000 r/min 离心 15
min，弃上清液，加入 3 mL 再生培养液，30℃下放
置 6 h。将培养液倒入培养皿中，然后加入约 15 mL
预先熔化好的，并且冷却至 50℃左右的固体再生培
养基，边摇晃边加入潮霉素至浓度为 300 μg/mL，在
培养基表面铺满一层为止，每个平板约需 10 mL，
在 28-30℃下，培养 4-5 d，将能够抗潮霉素的菌
落转移到预先倒好的含有潮霉素 250 μg/mL 的固体
PDA 培养基上进行 2 次筛选，获得玉米弯孢叶斑病
菌突变株。
1.2.2 玉米弯孢叶斑病菌 REMI 突变株鉴定
1.2.2.1 突变株的稳定性测定 将 2 次筛选后获得
的转化体转接至不含潮霉素的 PDA 上，28℃下培养，
待长出菌落后，继续转接到不含潮霉素的 PDA 上，
重复 7 次，再转接到含有潮霉素的 PDA 上观察培养。
1.2.2.2 突变株的 PCR 检测 根据抗潮霉素基因序
列设计合成引物（大连宝生物公司）：hph1 上 ：5-A-
TGAAAAAGCCTGAACTC-3 ；hph2 下 ：5-CTATTCC-
TTTGCCCTCGG-3。
PCR 扩 增 程 序 ：95℃ 变 性 5 min ；94℃ 变 性
1 min，54℃退火 0.5 min，72℃延伸 1 min，35 个循环；
72℃延伸 10 min。程序结束后扩增产物用 0.8% 琼脂
糖电泳检测。
1.2.2.3 转化子的 Southern blot 检测 随机挑选 5 个
转化子，以野生型菌株 LN-1 作为对照，大量法提取
转化子和野生型菌株的基因组 DNA，用潮霉素磷酸
转移酶基因作为探针，Hind Ⅲ酶切转化子和野生型
菌株 DNA，用 Hind Ⅲ酶切的 λDNA 作为 Marker 进
行 Southern blot 验证［12］。
1.2.3 转化子生物学测定 选取白化突变株和野生
菌株于 PDA 培养基（均为培养皿直径 9 cm，10 mL
基质）上培养 7 d，测定菌落直径、比较相对产孢量
（刮取培养皿中菌体，加入 20 mL 蒸馏水计算孢子浓
度），并进行培养性状观察和生长发育性状检测 ；另
2014年第12期 113夏淑春等：玉米弯孢叶斑病菌 REMI 白化突变体的筛选与致病性测定
外，选取转化子接种生长至 13 叶期的玉米自交系黄
早四植株，孢子悬液浓度为 106 个 /mL（含有 0.02%
Tween20 和 2% 蔗糖溶液），以相同浓度和相同处理
的野生菌株（LN-1）为对照。喷雾接种后保湿培养
24 h，然后转入正常管理，接种后 7 d 进行发病情况
调查，评价转化子的致病性。
1.2.4 质粒拯救 参照李铁民等［13］方法。提取突
变 体 LN-1-A 的 DNA， 利 用 Sac Ⅰ 消 化 5-10 μg 的
DNA，37℃过夜，第二天观察消化的弥撒程度，加
入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提纯
化 DNA，于 8 000 r/min、4℃下离心 10 min，取上清
液于另一干净的离心管中，加入 1/10 体积的 3 mol/L
NaAc（pH5.2） 和 70% 的 乙 醇 漂 洗。 溶 解 DNA 于
50-100 μL TE 中，加 100 μL 的连接体系（T4 DNA
连接酶），16℃温室过夜。65℃处理 10 min，灭活。
在连接好的 DNA 体系中加入 1/10 体积的 NaAc 和 2
倍体积的无水乙醇冰浴沉淀 4 h，14 000 r/min 离心
20 min，去上清，用 70% 的乙醇漂洗，抽干后溶解
于 5 μL 水中。将样品稀释 5-10 倍后，取 1-2 μL 于
20-25 μL 已经制备好的感受态细胞（DH5α）中，利
用 Gene Pulser 进行电激转化，参数为电压 1.7 kv，
时间为 5.3 ms。将电激后的细胞混入 800 μL 的 SOC
中，37℃下振荡培养 1 h（80-100 r/min），取出后在
含 Amp（100 μg/mL）的 LB 平板上涂匀后，37℃下
培养过夜，从平板上挑出长出的克隆点，在含 Amp
的 LB 培养基中摇菌提取质粒，电泳检测后测序（上
海捷瑞公司）分析。
2 结果
2.1 原生质体制备及纯化条件的确定
试验表明采用改良 Fries 培养基最有利于原生
质体的制备，在 6、12、24 和 36 h 提取原生质体检
验中，以 24 h 原生体的产量最高，为 3.52×105 个，
36 h 时检测结果显示原生体的数量下降，为 0.52×105
个，说明菌龄对原生质体制备有影响。细胞壁降解
酶的种类及浓度可采用溶壁酶、崩溃酶、蜗牛酶和
纤维素酶 1∶1∶1∶1 混合液，酶解 6 h 达到原生体
数量高峰，10 h 开始下降，超过一定时间原生质体
开始萎缩，且数量逐渐减少，采用三层擦镜纸过滤后，
用 STC 液洗涤后获得需要的玉米弯孢叶斑病菌原生
质体。
2.2 原生质体的再生
在玉米弯孢叶斑病菌（LN-1）菌丝加入裂解酶
破坏细胞壁释放原生质体过程中，原生质体随着释
放时间长短体积变化较大，最初开始释放时体积相
对较小，随着其在渗透液中时间的延长，体积逐渐
变大，原生质体呈多角形，其平均直径约为 70 μm。
为了确定原生质体活性，将得到的原生质体在 0.7
mol/L 的山梨醇为稳定剂的再生培养基上进行培养，
结果显示玉米弯孢叶斑病菌 LZ-1 的原生质体再生情
况良好，经过重复试验得到其再生率达到 30%，可
满足 REMI 转化要求。
2.3 质粒的提取和检测
通过试剂盒提取质粒 DNA，并用其单一酶切位
点 Hind Ⅲ对其进行酶切，通过电泳检测其分子量。
酶切后得到的 DNA 分子量略大于 5 000 bp，与 pUC-
JS 给出的图谱 5 080 bp 相一致，图上仅出现一条带
可以判断质粒 DNA 酶切已经完全，仅以线性的形
态存在，并没有 RNA 或是染色体 DNA 的污染。质
粒纯度检测为 OD260/OD280 ＝ 1.8-2.0，质粒浓度为
47.54 μg/μL，浓度和纯度可满足 REMI 转化的要求。
2.4 REMI遗传转化和转化子的获得
在 150 μL 原生质体悬浮液中加入 5 μg 酶切质粒
和 45 U 限制性内切酶在聚乙二醇（PEG）存在的条
件下冰浴，即可将线性的质粒插入到原生体的染色
体 DNA 上。将转化子在含 200 μg/μL 潮霉素的 PDA
培养基上连续培养 5 代，都能持续生长，说明潮霉
素基因在转化子中稳定表达，初步确定转化成功。
经过多次 REMI 诱导转化，最终获得 109 个 REMI
转化子，其中包含 5 个白化突变株。白化突变体的
菌落与野生黑色菌株差异明显，菌丝细胞壁较为透
明，菌丝相对细小，产孢数量变少。
2.5 突变体的检测
2.5.1 突变体稳定性的检测 随机选取 10 个转化子
在不含有潮霉素的 PDA 培养基上连续培养 7 代后，
再经过第二次用含有 200 μg/μL 潮霉素的 PDA 培养
基筛选时，所有转化子都可以正常生长，因此可以
初步认为该 109 个转化子即为 LN-1 的 REMI 转化突
变株。5 个白化突变株经过继代培养后也证明是稳
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期114
定遗传的 REMI 转化子。图 1 显示，在 PDA 培养基
中培养 7 d，转化子 LN-1-A 和 LN-1-B 菌落颜色呈灰
白色至白色，与野生菌株黑色差异显著，并且生长
速度也有明显差异，一些菌丝的细胞壁较透明，只
有少数色素积累，初步确定为黑色素合成途径被阻
断突变体。
2.5.2 转化子 PCR 检测 以野生玉米弯孢叶斑病菌
LN-1 基因组 DNA 和 5 个白化转化子基因组 DNA 作
为模板，利用抗潮霉素基因序列设计引物进行 PCR
扩增。结果（图 2）显示，所有的转化子都扩增出
目的条带，以抗潮霉素基因的引物 1 和 2 进行 PCR
扩增时，与阳性对照 pUC-JS（CK）相同，所有转化
子的特异带都出现在 510 bp，而出发菌株 LN-1 没有
出现特异性条带。
在 LN-1 染色体上可有 2 个不同的基因插入位点。
2.6 突变体的生物学性状研究
2.6.1 突变体菌株生长速度的测定 对转化子 LN-
1-A、LN-1-B 和 LN-1-C 进行生长量测定，结果（图 3）
发现突变菌株的生长速度（菌落直径）与野生菌株
差异不显著，但是菌丝形态和菌落密度与野生菌株
有明显差异，转化子菌丝一般都较纤细、透明，菌
落中菌丝疏松，无黑色素和其它色素产生，而野生
菌株除有黑色素产生外，还可以产生一些棕黄色素。
A B C
A ：野生菌 LN-1 ；B ：转化子 LN-1-A ；C ：转化子 LN-1-B
图 1 野生菌株与部分转化子菌落形态
2000
bp
1500
1000
500
M LN-1 CK A B C D E
M ：DNA 标准分子量 ；A-E ：转化子
图 2 利用 hph 引物对质粒 pUC-JS 插入 LN-1 的 PCR 检测
2.5.3 转化子 Southern blot 检测 选取 5 个转化子，
以潮霉素基因作为探针，进行 Southern blot 检测，
杂交结果显示 5 个转化子都至少有一条杂交带，并
在 5.0 kb 处，再次证明质粒 pUC-JS（CK）已经插入
到 LN-1 染色体中。
Southern 杂交的 5 个转化子中，2 个为单拷贝插
入。在单拷贝转化子中，1 个菌株的杂交带比目的
条带小，1 个杂交带比目的条带大。在 3 个多拷贝
插入的转化子中，都有 2 个条带，说明质粒 pUC-JS
0
1
2
3
4
5
6
7
8
3 4 5 6 7
㧼㩭ⴤᖴcm
LN-1
LN-1-A
LN-1-B
LN-1-C
⭏ӗᰦ䰤d
图 3 转化子及野生菌株生长速度曲线
2.6.2 突变体菌株产孢量的测定 对供试玉米弯孢
叶斑病菌野生菌株 LN-1 及部分转化子产孢量测定结
果表明，野生菌株和转化子的产孢量存在明显差异。
图 4 显示，转化子 LN-1-A 和 LN-1-B 与野生菌株比，
产孢量明显减少，而 LN-1-C 转化子比野生菌株的产
孢量还有所增加，说明插入片段影响了玉米弯孢叶
斑病菌的发育。
0
1
2
3
4
5
6
7
׋䈅㧼ṚLA-1 LN-1-A LN-1-B LN-1-Cӗᆒ䟿⴨ሩ⎃
ᓖ105 /mL
图 4 转化子产孢量测定
2.6.3 突变体菌株致病性检测 为检测 REMI 转化
子（白色突变株）的致病性，选择 REMI 转化子 LN-
2014年第12期 115夏淑春等：玉米弯孢叶斑病菌 REMI 白化突变体的筛选与致病性测定
1-A、LN-1-B、LN-1-C 和野生菌株 LN-1 分别接种相
对感病的玉米自交系黄早四，致病性测定结果（图 5）
表明，转化子的致病性比野生菌株 LN-1 的致病性明
显减弱，菌株 LN-1-A、LN-1-B、LN-1-C 只在玉米叶
片上形成几个零星的褐色小斑点。
A B
C D
A ：接种 LN-1 ；B ：接种 LN-1-A ；C ：接种 LN-1-B ；
D ：接种 LN-1-C
图 5 白色菌株和野生菌株接种黄早四后叶片症状
2.7 突变基因克隆
2.7.1 质粒拯救 利用 Sca Ⅰ酶切突变体 LN-1-A、
LN-1-B 基因组 DNA，之后利用 T4 连接酶连接，进
行质粒拯救。由于 Sca Ⅰ在介导酶 Hind Ⅲ的对侧，
因此拯救出的质粒应该去除了含有抗潮霉素基因
（hph）。故在克隆体筛选过程中使用抗氨苄青霉素
（Amp）作为抗性选择标记，而所得克隆体质粒 3.3
kb（图 6），说明载体携带了部分的外源基因。
3.3 kb
A B
图 6 质粒拯救后质粒提取（A）和酶切（B）鉴定
GATTGCGAGCATGGGGAGAGGGACAGTGTATCTGAGCATTCGAGTACTGTGT
GGTAATTTCTTGTACACCCTTTCTGGTAGCGGAACCCAGGACTCGTCGTTTTC
AACATGGCCATGGTTCTGGTGGTGTGTCCGATGGCTTATTCTCCAACCATGGT
AAGGAACGAGGATGAAGGAGTGAAGAATGTGACCAACCACACTATTGAGCA
GAGGAATGTCTGAAAAACTCCCATGTCCACAGTCGTGGCCGAGAACGAAAAT
GGCCCAAAAAAGGGTTCCTTGGGCGGCCCAATAGAGAGGCCAGAGGAACCA
GGTGTCAAAATACACGGCGGCGACGGCAAGAGACGCGACGGCGATGATGTC
TCTGACGACGTAACTCATCGATCTCAAAGGACTCTTCACCCAGCAGTGCTTAG
GAATCGCCGCCC
图 7 外源序列
2.7.2 测序与 blast 分析 拯救的质粒是载体 pUC-
JS 连接了一段外源基因的质粒，在利用 Amp 作为引
物对拯救质粒进行基因测序后，经过与 pUC-JS 的序
列比对，测定得到外源序列如图 7 所示，共 427 bp。
对该序列进行 blast 分析显示，其与不饱和脂肪酸脱
氢酶（FAD3）具有高度同源性。
3 讨论
据报道，在真菌遗传转化中，利用限制性内切
酶和线性化质粒方法，可提高其转化效率［14，15］。本
研究采用 REMI 方法，并通过最佳限制性内切酶种
类和浓度的选择，获得了玉米弯孢叶斑病菌较适宜
转化条件 ：用 3 μg 的线性化质粒和 40 unit Hind Ⅲ
加入到 150 μL 原生质体里面，浓度为 1×107/mL。
采用该方法共获得 109 个转化子，其中有 5 个转化
子为白色菌株，致病性明显减弱，与传统的微生物
诱变技术相比，明显提高了转化效率和转化子单拷
贝频率。
本研究在所获得的 REMI 转化子中发现致病性
减弱与白化现象相关，即菌株白化可能导致病菌致
病性减弱，这与鄢洪海等［5］报道相一致。鄢洪海等
在辽宁省调查采集玉米弯孢叶斑病样本时，发现了
玉米弯孢叶斑病菌白化现象，并在致病性测定时发
现了白化菌株致病力较野生黑色菌株弱的特性。通
过 REMI 遗传转化玉米弯孢叶斑病菌获得白化菌株
转化子，并通过致病性测定进一步证明了玉米弯孢
叶斑病菌这一特性，为以后玉米弯孢叶斑病菌致病
机制研究奠定了基础。
通过质粒拯救的方法克隆到了一个与不饱和
脂肪酸脱氢酶（FAD3）具有高度同源性的一段基
因序列。许多研究表明，不饱和脂肪酸的含量在高
等植物抗性中有重要生理功能，它们不仅提供了大
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期116
量保守自由能，而且能影响应答各种环境信号的作
用［16-18］。ω-3 脂肪酸脱饱和酶是不饱和脂肪酸合成
途径中催化脂肪酸转化的关键酶，在模式植物拟南
芥中人们根据定位差异将该酶进行分类，FAD3 基因
编码内质网型 ω-3 脂肪酸脱饱和酶，FAD3 在常温下
表达［19］。另外，在曲霉菌中，删除一个编码脂肪酸
饱和酶基因后，就能阻碍脂肪酸的合成，同时拖延
了孢子和菌丝的合成［20］。然而，目前尚不明确不饱
和脂肪酸脱氢酶基因（FAD3）与菌株白化及弱致病
现象的直接遗传关系，需要今后利用基因敲除或基
因沉默等方法进一步研究。
4 结论
本 研 究 采 用 限 制 性 内 切 酶 介 导 整 合 方 法
（REMI）获得了玉米弯孢叶斑病菌遗传转化子，其
中既有单拷贝也有多拷贝转化子。在转化子中有一
部分是白色突变体，也有野生色突变体，说明插入
位点不只是一个，至少存在 2 个以上插入位点。而
玉米弯孢叶斑病菌白色突变体致病性普遍减弱，说
明菌株色素合成与其致病性关系密切。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）