全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４３(４): ３９３￣４００(２０１３)
收稿日期: ２０１２￣０６￣０６ꎻ 修回日期: ２０１３￣０３￣１４
基金项目: 国家高技术研究发展计划(“８６３”计划) (２０１１ＡＡ１０Ａ２０５)
通讯作者: 杨合同ꎬ研究员ꎬ主要研究方向为农业微生物ꎻ Ｔｅｌ:０５３１￣８２６０５３８６ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙａｎｇｈｔ＠ｋｅｙｌａｂ. ｎｅｔ
共同第一作者: 李纪顺ꎬ男ꎬ山东省沂水县人ꎬ高级工程师ꎬ学士ꎬ主要研究方向为农业微生物ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙｅｗｕ２＠ｋｅｙｌａｂ. ｎｅｔꎻ
陈 凯ꎬ女ꎬ山东省昌邑市人ꎬ助理研究员ꎬ学士ꎬ主要研究方向为农业微生物ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｃｈｅｎｋａｉ１９９６０９１７＠ｙａｈｏｏ. ｃｏｍ. ｃｎꎮ
通过染色体整合 β￣１ꎬ４￣葡聚糖酶基因 ｇｌｕ１４ 提高
绿色木霉对小麦纹枯病的防治效果
李纪顺＃ꎬ 陈 凯＃ꎬ 李红梅ꎬ 扈进冬ꎬ 魏艳丽ꎬ 杨合同∗
(山东省科学院中日友好生物技术研究中心ꎬ 山东省应用微生物重点实验室ꎬ 济南 ２５００１４)
摘要:绿色木霉 ＬＴＲ￣２ 是生物防治菌株ꎮ 利用来自巨大芽胞杆菌 Ａｐ２５ 的 β￣１ꎬ４￣葡聚糖酶基因 ｇｌｕ１４ 构建木霉表达载体
ｐＳｉｌｅｎｔ / ｇｌｕ１４ꎬ利用限制性内切酶介导法(ＲＥＭＩ)转化绿色木霉 ＬＴＲ￣２ꎮ ＰＣＲ 扩增及 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交证实目的基因已插入木
霉转化子的染色体 ＤＮＡ上ꎮ 转化子的 β￣１ꎬ４￣葡聚糖酶水解活性ꎬ对小麦纹枯病菌的平板抑制作用及温室防治效果较原始
菌株 ＬＴＲ￣２ 明显提高(Ｐ <０. ０１)ꎬ其中转化子 Ｌ￣１０ 的效果最好ꎬ平板抑制率比 ＬＴＲ￣２ 提高了 ２７. ０％ ꎬ温室防治效果比
ＬＴＲ￣２ 提高了 ２６. ７％ ꎮ 本试验表明ꎬ利用 ＲＥＭＩ技术ꎬ将 β￣１ꎬ４￣葡聚糖酶基因重组到木霉染色体 ＤＮＡ上ꎬ是获得高效木霉
工程菌株的有效手段ꎮ
关键词: 绿色木霉ꎻ ＲＥＭＩꎻ β￣１ꎬ４￣葡聚糖酶基因ꎻ 小麦纹枯病菌
Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｉｏ￣ｃｏｎｔｒｏｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ ａｇａｉｎｓｔ ｗｈｅａｔ ｓｈｅａｔｈ ｂｌｉｇｈｔ
(Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ) ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ β￣
１ꎬ４￣ｇｌｕｃａｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｇｌｕ１４ 　 ＬＩ Ｊｉ￣ｓｈｕｎꎬ ＣＨＥＮ Ｋａｉꎬ ＬＩ Ｈｏｎｇ￣ｍｅｉꎬ ＨＵ Ｊｉｎ￣ｄｏｎｇꎬ ＷＥＩ Ｙａｎ￣ｌｉꎬ
ＹＡＮＧ Ｈｅ￣ｔｏｎｇ　 (Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｊｉｎａｎ ２５００１４ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ ＬＴＲ￣２ ｉｓ ａ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｆｕｎｇｕｓ. Ｔｈｅ β￣１ꎬ４￣ｇｌｕｃａｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｂａ￣
ｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ Ａｐ２５ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｔｏ ｆｏｒｍ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＳｉｌｅｎｔ / ｇｌｕ１４ꎬ ａｎｄ ｕｓｅｄ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｏｒｍ
ＬＴＲ￣２ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ (ＲＥＭＩ) . Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ＰＣＲ
ａｎｄ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ. Ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ＬＴＲ￣２ꎬ ａｌｌ ｇｌｕ１４ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｈｉｇｈｅｒ
ｇｌｕｃａｎｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ. Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍ￣
ｂｉｎａｎｔ Ｌ￣１０ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｅｆｆｉｃａｃｙꎬ ａｎｄ ｈａｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｂｙ ２７. ０％ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｒ. ｃｅｒｅａｌｉｓ ａｎｄ ２６. ７％ ｉｎ ｐｌａｎｔａ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｓｈｅａｔｈ ｂｌｉｇｈｔ ｄｉｓｅａｓｅ(Ｐ <
０􀆰 ０１) . Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｉｏ￣ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ
ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｉｎｓｅｒｔｉｎｇ β￣１ꎬ４￣ｇｌｕｃａｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｉｎｔｏ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ＲＥＭＩ ｍｅｔｈｏｄ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅꎻ ＲＥＭＩꎻ β￣１ꎬ４￣ｇｌｕｃａｎａｓｅ ｇｅｎｅꎻ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ
中图分类号: Ｑ７８　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０４￣０３９３￣０８
　 　 木霉(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)属于半知菌亚门、丝孢纲、
丝孢目、粘孢菌类ꎬ菌丝有隔ꎬ能产生分生孢子ꎬ细
胞为单核结构ꎬ有性态为肉座菌(Ｈｙｐｏｒｃｒｅａ) [１]ꎬ但
尚无可实现诱发有性结构的报道ꎮ 木霉是自然界
广泛分布的生防真菌ꎬ至少对 １８ 个属 ２０ 余种病原
真菌和多种病原细菌有拮抗作用ꎬ目前国际上有
　
植物病理学报 ４３ 卷
６０ 多个国家使用 １００ 多种含有木霉菌成分的生物
制剂产品[２ ~ ４]ꎮ
随着分子生物学实验技术的发展ꎬ利用生物
技术对木霉进行基因改造及功能基因的研发已
逐渐趋于成熟ꎬ由于多种转化方法对染色体的插
入是随机的ꎬ受影响的表型也是多种多样的ꎮ
如ꎬ菌丝生长速率、水解酶活性、菌落形态、对温
度的耐受性、对某些病菌的抑制能力等ꎬ这些因
素对解析生物防治菌拮抗机理、筛选生物防治新
菌株、探索生物防治菌株新功能、提供病害防治
新途径等将可提供有利的依据ꎬ对解决现有木霉
菌剂的应用瓶颈ꎬ促进其在生物防治中的应用具
有重要意义[５ꎬ ６] ꎮ
木霉能够产生多种降解植物病原真菌细胞壁
的酶类物质ꎬ其中的葡聚糖酶是目前研究的热点ꎬ
也是公认的影响生防真菌重寄生能力的重要因子
之一[７ ~ ９]ꎮ 葡聚糖酶能够水解植物病原真菌细胞
壁最外层覆盖的葡聚糖层ꎬ导致细胞壁骨架受损ꎬ
细胞因此而受到杀伤ꎬ体外抑菌试验表明ꎬ葡聚糖
酶对多种真菌菌丝生长有抑制作用ꎬ葡聚糖酶广泛
存在于动植物、藻类、细菌和真菌体内ꎬ在植物病害
生物防治领域具有良好的应用前景ꎮ 但自然来源
的木霉菌株产生的葡聚糖酶活性偏低ꎮ 为了提高
木霉的生防效果ꎬ本试验利用细菌来源的 β￣１ꎬ４￣葡
聚糖酶基因 ｇｌｕ１４ 构建真菌表达载体ꎬ并利用限制
性内切酶介导法(ＲＥＭＩ)转化绿色木霉(Ｔ. ｖｉｒｉｄｅ)
ＬＴＲ￣２ꎬ获得可高效表达葡聚糖酶的木霉工程菌
株ꎬ为防治植物真菌病害提供新的策略ꎮ
１　 材料与方法
１. １　 菌株与质粒
大肠杆菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ) Ｔｏｐ１０ꎬ绿色木霉
(Ｔ. ｖｉｒｉｄｅ)ＬＴＲ￣２ꎬ巨大芽胞杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅ￣
ｒｉｕｍ)Ａｐ２５ꎬ均由本室保存ꎬ载体 ｐＳｉｌｅｎｔ￣１ 由山东
大学汪天虹教授惠赠ꎮ
１. ２　 试剂与培养基
各种限制性内切酶、Ｔ４ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ、Ｔａｑ ＤＮＡ
聚合酶购自 ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｔｅｃｈ 公司ꎻ试验用抗生素、
ＤＮＡ片段回收试剂盒购自上海生物工程技术服务
有限公司ꎻＬｙｓｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅｓ、蜗牛酶、纤维素酶购自
Ｓｉｇｍａ公司ꎮ
渗透压稳定剂:０. ６ ｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌꎬ０. ２ ｍｏｌ / Ｌ
ＰＢＳꎬ ｐＨ ５. ８ꎮ
ＳＴＣ:０. ６ ｍｏｌ / Ｌ 山梨醇ꎬ１０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓꎬ１０
ｍｍｏｌ / Ｌ ＣａＣｌ２ꎬ ｐＨ ７. ５ꎮ
ＰＴＣ: ６０％ ＰＥＧ ４０００ꎬ １０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓꎬ １０
ｍｍｏｌ / Ｌ ＣａＣｌ２ꎬ ｐＨ ７. ５ꎮ
再生培养基: ＰＤＡ ＋ ０. ３ ｍｏｌ / Ｌ ＫＣｌ ＋ ０. ３
ｍｏｌ / Ｌ肌醇ꎮ
１. ３　 木霉表达载体的构建
基因片段的 ＰＣＲ扩增ꎬ酶切、连接和重组质粒
的转化ꎬ重组克隆的筛选均按«精编分子生物学实
验指南»操作[１０]ꎮ β￣１ꎬ４￣葡聚糖酶基因 ｇｌｕ１４ 大小
约 １. ５ ｋｂꎬ已登录 ＧｅｎＢａｎｋꎬ序列号为 ＨＭ１３０６７０ꎮ
利用 ＣＴＡＢ / ＮａＣｌ法提取得到巨大芽胞杆菌 Ａｐ２５
的基因组 ＤＮＡꎬ以该基因组 ＤＮＡ 为模板ꎬ根据
ｇｌｕ１４ 序 列 设 计 引 物 ｇｌｕ１４ / Ｆ: ５′￣ＧＣＧ￣
ＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＡＣＧＧＴＣＡＡＴＣＴＣＴＡＴ￣３′ 和
ｇｌｕ１４ / Ｒ: ５′￣ＧＣＧＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＡＴＴＴＧＧＴＴＣＴ￣
ＧＴＴＣＣ￣３′进行 ＰＣＲ 扩增 (下划线分别代表
Ｈｉｎｄ Ⅲ和 Ｂｇｌ Ⅱ酶切位点)ꎬＰＣＲ 产物经纯化后ꎬ
用 Ｈｉｎｄ Ⅲ / Ｂｇｌ Ⅱ双酶切ꎬ过胶纯化ꎮ 载体 ｐＳｉｌｅｎｔ￣
１ 同样用 Ｈｉｎｄ Ⅲ / Ｂｇｌ Ⅱ双酶切ꎬ过胶纯化ꎮ ２ 种
酶切产物用快速连接液 Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ⅰ于 １６℃连接 ２
ｈꎬ采用热激法转化 Ｔｏｐ１０ 感受态细胞ꎬ涂布 ＬＢＡ
平板(含 Ａｍｐ１００ μｇ / ｍＬ)ꎬ３７℃过夜培养ꎬ挑取抗
性平板上生长的单菌落ꎬ以 ｇｌｕ１４ / Ｆ 和 ｇｌｕ１４ / Ｒ 为
引物进行菌落 ＰＣＲꎬ对疑似转化子提取质粒ꎬ利用
Ｈｉｎｄ Ⅲ / Ｂｇｌ Ⅱ进一步酶切验证ꎮ
１. ４　 绿色木霉 ＬＴＲ￣２ 耐药性试验
配制不同浓度的潮霉素 Ｂ(Ｈｙｇ ０ ~１００ μｇ /
ｍＬ)的 ＰＤＡ 平板ꎬ接种 ＬＴＲ￣２ 分生孢子ꎬ２８℃培
养 ７ ｄꎬ观察菌株生长情况ꎮ
１. ５　 ＲＥＭＩ法转化绿色木霉 ＬＴＲ￣２
１. ５. １　 质粒酶切　 根据重组表达载体上的酶切位
点ꎬ选用 ＳａｃⅠ进行酶切ꎬ酶切产物过胶纯化ꎮ
１. ５. ２　 菌丝制备　 从 ＰＤＡ 平板上挑取绿色木霉
ＬＴＲ￣２ 的幼嫩气生菌丝接种 ＰＤＢ 液体培养基ꎬ
２８℃振荡培养 １３ ｈꎬ用 ３ 层无菌擦镜纸过滤ꎬ无菌
水冲洗 ３ 次ꎬ渗透压稳定剂冲洗 ３ 次ꎮ
１. ５. ３　 裂解液制备　 Ｌｙｓｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅｓ /蜗牛酶 /纤
４９３
　
　 ４ 期 　 　 李纪顺ꎬ等:通过染色体整合 β￣１ꎬ４￣葡聚糖酶基因 ｇｌｕ１４ 提高绿色木霉对小麦纹枯病的防治效果
维素酶ꎬ各 ５ ｍｇ / ｍＬꎬ溶入渗透压稳定剂中ꎬ０. ２２
μｍ微孔滤膜过滤除菌ꎮ
１. ５. ４　 原生质体制备　 用前期优化方法制备原生
质体(另文发表)ꎬ取适量菌丝悬浮于裂解液中ꎬ
３０℃、５０ ｒ / ｍｉｎ振荡ꎬ定期镜检ꎬ观察到有大量原生
质体形成后ꎬ用 ３ 层擦镜纸过滤菌丝ꎬ渗透压稳定
剂冲洗 ２ 次ꎬ４℃、７ ０００ ｒ / ｍｉｎꎬ离心 １０ ｍｉｎꎮ 沉淀
用 ＳＴＣ洗涤ꎬ４℃、７ ０００ ｒ / ｍｉｎꎬ离心 １０ ｍｉｎꎮ 沉淀
用少量 ＳＴＣ悬浮ꎬ调整原生质体量 １０７ 个 / ｍＬꎮ
１. ５. ５ 　 原生质体再生　 分别用 ＳＴＣ 和无菌水稀
释原生质体ꎬ不同梯度各取 １ ｍＬꎬ混入 ４５℃的再
生培养基或 ＰＤＡ中ꎬ２８℃培养 ３ ｄꎬ计数菌落个数ꎬ
计算再生率ꎮ
再生率(％ ) ＝ (高渗稀释液长出的菌落数￣无
菌水稀释长出的菌落数) /原生质体数
１. ５. ６ 　 ＲＥＭＩ 转化 　 线性质粒 ３０ μｇ、内切酶 ４
μＬ、ＳＴＣ １５０ μＬꎬ混匀ꎬ冰浴ꎻ加原生质体(１０７ 个 /
ｍＬ)１５０ μＬꎬ混匀ꎬ冰浴 ２０ ｍｉｎꎻ缓慢滴加 ＰＴＣ(预
冷)１. ５ ｍＬꎬ混匀ꎬ冰浴 ５ ｍｉｎꎬ室温 ２０ ｍｉｎꎻ加 ＳＴＣ
(预冷)５ ｍＬꎬ混匀ꎬ４℃ꎬ７ ０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎꎻ
沉淀加入 ３ ｍＬ 液体再生培养基ꎬ２８℃ꎬ５０ ｒ / ｍｉｎꎬ
培养 １２ ｈꎻ平板中预加入一薄层再生培养基ꎬ转化
液适量与 ４５℃左右的固体再生培养基混匀ꎬ倒平
板ꎬ２８℃ꎬ培养 ２４ ｈꎻ覆盖 Ｈｙｇ ２００ μｇ / ｍＬ ＰＤＡ 培
养基ꎬ２８℃ꎬ培养 ２ ｄꎬ挑取抗性菌落保存ꎮ
１. ６　 木霉转化子的遗传稳定性及菌落形态观察
利用稀释平板法对抗性菌落进行单孢分离ꎬ挑
取单菌落转接入普通 ＰＤＡ平板上ꎬ连续转接 ６ 次ꎬ
再接入 Ｈｙｇ ２００ μｇ / ｍＬ ＰＤＡ 平板上培养ꎬ观察转
化子的生长速率、菌落形态和颜色、分生孢子产生
情况等ꎮ
１. ７　 木霉转化子的 ＰＣＲ 扩增及 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ￣
ｔｉｎｇ分析
利用 ＣＴＡＢ / ＮａＣｌ 法提取木霉转化子的基因
组 ＤＮＡꎬＰＣＲ扩增目的片段ꎬ电泳检测ꎮ
利用限制性内切酶 ＨｉｎｄⅢ酶切木霉转化子的基
因组 ＤＮＡꎬ进行琼脂糖凝胶电泳ꎬ以 β￣１ꎬ４￣葡聚糖酶
基因 ｇｌｕ１４的ＲＣＲ产物为探针进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇꎬ
检测 Ｔ￣ＤＮＡ 的插入拷贝数ꎬ试验步骤按 Ｂｉｏｔｉｎ
ＤｅｃａＬａｂｅｌ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ 及 Ｂｉｏｔｉｎ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ (Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司)说明书进行ꎮ
１. ８　 木霉转化子的水解酶活性检测
β￣１ꎬ４￣葡聚糖酶活性检测见文献[１１]ꎬ在羧甲
基纤维素钠(ＣＭＣＮａ)培养基上接种木霉转化子ꎬ
２８℃培养 ３ ｄꎬ平板用 １ ｍｇ / ｍＬ 刚果红染色ꎬ用
１ ｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌ冲洗 ２ 次ꎬ观察水解圈大小ꎮ
１. ９　 木霉转化子的抑菌活性
利用平板对峙培养试验检测木霉转化子对小
麦纹枯病菌(Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ)的抑制作用ꎬ用
直径 ５ ｍｍ打孔器分别打取木霉转化子、小麦纹枯
病菌菌落边缘的菌丝块ꎬ然后对接在 ＰＤＡ 平板两
端ꎬ２ 个菌块相距 ６０ ｍｍꎬ对照用无菌琼脂块代替ꎮ
２８℃培养ꎬ定期观察二者之间的拮抗情况ꎬ计算抑
制率(％ )ꎮ 抑制率(％ ) ＝１００ × ( ｒ２０ － ｒ２) / ｒ２０ꎬ其中
ｒ０ 为对照病菌生长半径ꎬｒ 为与木霉对峙培养的病
菌生长半径ꎮ
１. １０　 木霉转化子的温室防治效果试验
温室试验用植物病原真菌为小麦纹枯病菌ꎬ
对照药剂为井冈霉素( Ｊｉｎｇｇａｎｇｃｙｍｉｎ)ꎮ 每处理
设 ４ 个重复ꎬ随机区组排列ꎮ 温室试验具体做法
见文献[１２]ꎬ并参照方中达编著的植病研究方
法[１３] ꎬ按 ５ 级分级标准进行病害调查ꎮ 数据采用
ＳＰＳＳ１０. ０ 统计软件中的 Ｄｕｎｃａｎ 方法进行分析ꎬ
同列数据后不同大写字母表示差异显著 ( Ｐ <
０􀆰 ０１ꎮ
２　 结果与分析
２. １　 木霉表达载体的构建
挑取在 Ａｍｐ抗性平板上生长的大肠杆菌的单
菌落ꎬ以 ｇｌｕ１４ / Ｆ 和 ｇｌｕ１４ / Ｒ 为引物进行菌落
ＰＣＲꎬ电泳检测结果见图 １ꎬ第 ２ 泳道的阳性对照和
第 ４、６、７ 泳道的疑似转化子 １＃、３＃、４＃均得到清晰
的 ｇｌｕ１４ 目的片段ꎬ第 １ 泳道的阴性对照无扩增片
段ꎬ第 ３ 泳道的载体 ｐＳｉｌｅｎｔ￣１ 及第 ５、８、９ 泳道的疑
似转化子 ２＃、５＃、６＃的扩增片段较弱ꎬＰＣＲ结果表明
１＃、３＃、４＃可能是阳性转化子ꎮ
　 　 提取部分疑似转化子的质粒ꎬ利用ＨｉｎｄⅢ /
Ｂｇｌ Ⅱ进行酶切验证ꎬ结果见图 ２ꎮ 转化子 １＃、３＃、
４＃的酶切结果正确ꎬ酶切产物大小分别约 １. ５ ｋｂ
和 ７. ０ ｋｂꎬ与理论值一致ꎬ而转化子 ５＃酶切后未得
５９３
　
植物病理学报 ４３ 卷
Ｆｉｇ. １ 　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ
ｇｌｕ１４ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐＳｉｌｅｎｔ / ｇｌｕ１４
ｍｕｔａｎｔｓ
Ｌａｎｅ １: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅ ３:
ｐＳｉｌｅｎｔ￣１ꎻ Ｌａｎｅ ４: Ｍｕｔａｎｔ １＃ꎻ Ｌａｎｅ ５: Ｍｕｔａｎｔ ２＃ꎻ Ｌａｎｅ ６:
Ｍｕｔａｎｔ ３＃ꎻ Ｌａｎｅ ７: Ｍｕｔａｎｔ ４＃ꎻ Ｌａｎｅ ８: Ｍｕｔａｎｔ ５＃ꎻ Ｌａｎｅ ９:
Ｍｕｔａｎｔ ６＃ꎻ Ｌａｎｅ Ｍ: Ｄ ２ ０００ Ｍａｒｋｅｒ.
Ｆｉｇ. ２ 　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ
ｐＳｉｌｅｎｔ / ｇｌｕ１４ ｍｕｔａｎｔｓ ｄｉｇｅｓｔｅｄ
ｂｙ Ｈｉｎｄ Ⅲ / Ｂｇｌ Ⅱ
Ｌａｎｅ １: ｐＳｉｌｅｎｔ￣１ꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｍｕｔａｎｔ １＃ꎻ Ｌａｎｅ ３: Ｍｕｔａｎｔ ３＃ꎻ
Ｌａｎｅ ４: Ｍｕｔａｎｔ ４＃ꎻ Ｌａｎｅ ５: Ｍｕｔａｎｔ ５＃ꎻ Ｌａｎｅ Ｍ: １ ｋｂ Ｍａｒｋｅｒ.
到目的片段ꎮ
　 　 综合菌落 ＰＣＲ 和 Ｈｉｎｄ Ⅲ / Ｂｇｌ Ⅱ酶切检测结
果ꎬ确定 １＃、３＃、４＃为阳性转化子ꎮ 表达载体 ｐＳｉ￣
ｌｅｎｔ / ｇｌｕ１４ 图谱见图 ３ꎬ基因 ｇｌｕ１４ 表达框以 ＰｔｒｐＣ
为启动子ꎬＴｔｒｐＣ为终止子ꎮ
２. ２　 绿色木霉 ＬＴＲ￣２ 耐药性试验
绿色木霉 ＬＴＲ￣２ 在不同浓度潮霉素平板上的
生长情况不同ꎬ无药培养基上培养 １ ｄ 即可见菌丝
生长ꎮ 在潮霉素浓度 ５０ μｇ / ｍＬ时培养 ３ ｄ可见菌
丝生长ꎬ７５ μｇ / ｍＬ时培养 ５ ｄ可见菌丝生长ꎬ超过
１００ μｇ / ｍＬ时培养 ７ ｄ菌丝不生长ꎬ故潮霉素筛选
浓度应不低于 １００ μｇ / ｍＬꎬ试验定为 ２００ μｇ / ｍＬꎮ
２. ３　 ＲＥＭＩ法转化绿色木霉 ＬＴＲ￣２
２. ３. １　 线性质粒制备　 ｐＳｉｌｅｎｔ / ｇｌｕ１４ 用 ＳａｃⅠ酶切
后ꎬ产生一条带ꎬ大小约 ８. ５ ｋｂꎬ酶切图谱见图 ４ꎮ
２. ３. ２　 原生质体制备　 由于不同菌株制备原生质
体的条件不同ꎬ通过前期工作已得到绿色木霉
ＬＴＲ￣２ 原生质体制备的最佳条件:接种物为 ＬＴＲ￣２
的幼嫩气生菌丝ꎬ菌丝振荡培养时间为 １３ ｈꎬ渗透
压稳定剂为 ０. ６ ｍｏｌ / Ｌ ＮａＣｌꎬ裂解温度为 ３０℃ꎬ裂
解时间为 ３ ｈꎮ 绿色木霉 ＬＴＲ￣２ 的幼嫩菌丝经裂
解酶处理后ꎬ酶解初期ꎬ顶端细胞壁裂解释放出原
生质体(图 ５￣Ａ)ꎻ酶解后期ꎬ菌丝裂解成菌丝段ꎬ在
菌丝段的一端或两端释放出原生质体ꎬ最后释放出
大量原生质体ꎬ产量大约为１０８个 / ｍＬ(图５ ￣Ｂ) ꎮ
Ｆｉｇ. ３　 Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍａｐ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｖｅｃｔｏｒ ｐＳｉｌｅｎｔ / ｇｌｕ１４
Ｆｉｇ. ４ 　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｐＳｉ￣
ｌｅｎｔ / ｇｌｕ１４ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｓａｃ Ⅰ
Ｌａｎｅ Ｍ: １ ｋｂ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １￣２: ｐＳｉｌｅｎｔ / ｇｌｕ１４.
６９３
　
　 ４ 期 　 　 李纪顺ꎬ等:通过染色体整合 β￣１ꎬ４￣葡聚糖酶基因 ｇｌｕ１４ 提高绿色木霉对小麦纹枯病的防治效果
原生质体大多为圆形ꎬ大小不一ꎬ这与菌丝体间隔
大小不同有关ꎮ
２. ３. ３　 原生质体再生　 原生质体在再生培养基上
培养 ３ ｄꎬ再生率为 １４. ５％ ꎮ
２. ３. ４　 ＲＥＭＩ转化 　 共转化后ꎬ在含潮霉素 ＰＤＡ
培养基(Ｈｙｇ ２００ μｇ / ｍＬ)上培养 ２ ｄꎬ将上层平板
上生长的木霉菌落转接到潮霉素 ＰＤＡ(Ｈｙｇ ２００
μｇ / ｍＬ)平板上继续培养 ４ ~ ５ ｄꎬ并进行单孢分
离ꎬ获得纯化的木霉转化子ꎬ转化率为 ２４ 个 / μｇ
ＤＮＡꎮ
２. ４ 　 木霉转化子的遗传稳定性检测及菌落形态
的观察
单孢分离得到的木霉转化子在普通 ＰＤＡ平板
上连续转接 ６ 次后ꎬ重新接种 Ｈｙｇ ２００ μｇ / ｍＬ
ＰＤＡ平板ꎬ２８℃培养 ３ ｄꎬ结果见图 ６ꎮ 所有转化子
仍可继续生长(图中 Ｌ￣１、Ｌ￣４、Ｌ￣８、Ｌ￣１０、Ｌ￣２０、Ｌ￣
５６)ꎬ而原始菌株 ＬＴＲ￣２ 不生长(图中 ＬＴＲ￣２)ꎬ表
明木霉转化子对 Ｈｙｇ具有遗传稳定性ꎮ
图 ６ 中 ＬＴＲ￣２ / ＰＤＡ为 ＬＴＲ￣２ 在 ＰＤＡ 平板上
的菌落形态ꎬ与原始菌株相比ꎬ大多数转化子的菌
落形态发生了明显变化ꎮ 这些变化包括:菌丝生长
速度大小、菌丝层疏密程度、菌落颜色、分生孢子数
量等ꎬ其中以分生孢子产生数目和菌落颜色发生变
化的较多ꎮ 转化子 Ｌ￣１、Ｌ￣１０、Ｌ￣２０ 生长速度较原
始菌株明显提高ꎬ而转化子 Ｌ￣１０ 的产孢能力也明
显增强(图 ６)ꎮ
Ｆｉｇ. ５　 Ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ ＬＴＲ￣２
Ａ: Ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｏｒｍ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔａｇｅ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓꎻ Ｂ: Ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｏｒｍ ｏｆ ｌａｔｅｒ ｓｔａｇｅ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ.
Ｆｉｇ. ６　 Ｃｏｌｏｎｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ
ＬＴＲ￣２ / ＰＤＡ: Ｃｏｌｏｎｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ＬＴＲ￣２ ｉｎ ＰＤＡꎻ ＬＴＲ￣２: Ｃｏｌｏｎｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ＬＴＲ￣２ ｉｎ ＰＤＡ ｗｉｔｈ
Ｈｙｇ ２００ μｇ / ｍＬꎻＬ￣１ꎬ Ｌ￣４ꎬ Ｌ￣８ꎬ Ｌ￣１０ꎬ Ｌ￣２０ꎬ Ｌ￣５６: Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ＰＤＡ ｗｉｔｈ Ｈｙｇ ２００ μｇ / ｍＬ.
７９３
　
植物病理学报 ４３ 卷
２. ５　 木霉转化子的 ＰＣＲ 检测及 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ￣
ｔｉｎｇ分析
利用 ＣＴＡＢ / ＮａＣｌ 法提取得到木霉转化子的
基因组 ＤＮＡꎬ以该 ＤＮＡ 为模板ꎬ用 ｇｌｕ１４ 引物进
行 ＰＣＲ扩增ꎬ结果表明:阳性质粒对照和木霉转化
子中均得到大小 １. ５ ｋｂ 的目的片段ꎬ而阴性
ｄｄＨ２Ｏ和 ＬＴＲ￣２ 中无扩增条带ꎬ与预期结果一致ꎬ
表明 ｇｌｕ１４ 基因已转入木霉转化子的染色体 ＤＮＡ
上(电泳图谱略)ꎮ
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ结果发现野生型 ＬＴＲ￣２(１＃)
无杂交带ꎬ而阳性质粒 ｐＳｉｌｅｎｔ / ｇｌｕ１４(２＃)出现一条
杂交带ꎬ木霉转化子(３＃ ~ ７＃)均出现一条杂交带ꎬ
说明 Ｔ￣ＤＮＡ 已插入木霉转化子的染色体 ＤＮＡ
中ꎬ且为单拷贝插入(图 ７)ꎮ
Ｆｉｇ. ７ 　 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｒｉ￣
ｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＤＮＡｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｂｅ
ｏｆ ｇｌｕ１４ ｇｅｎｅ
Ｌａｎｅ １: ＬＴＲ￣２ꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒ ｐＳｉｌｅｎｔ / ｇｌｕ１４ꎻ
Ｌａｎｅ ３: Ｌ￣１ꎻ Ｌａｎｅ ４: Ｌ￣４ꎻ Ｌａｎｅ ５: Ｌ￣８ꎻ Ｌａｎｅ ６: Ｌ￣１０ꎻ Ｌａｎｅ ７:
Ｌ￣２０.
２. ６　 木霉转化子的葡聚糖酶水解活性检测
在羧甲基纤维素钠(ＣＭＣＮａ)平板上 ２８℃培
养 ３ ｄꎬ绿色木霉 ＬＴＲ￣２ 可以生长ꎬ但没有明显的
水解圈ꎬ各转化子具有明显的水解活性ꎬ经刚果红
染色后产生黄色水解圈ꎬ不同转化子的水解圈大小
不同(图 ８)ꎮ
２. ７　 木霉转化子的抑菌活性检测
绿色木霉 ＬＴＲ￣２ 对 Ｒ. ｃｅｒｅａｌｉｓ 的平板抑制率
为 ５９. ７％ ꎬ各转化子对 Ｒ. ｃｅｒｅａｌｉｓ 的平板抑制率
比野生型均有显著提高(Ｐ < ０. ０１)ꎬ其中 Ｌ￣１０ 的
抑制效果最高ꎬ抑制率达 ８６. ７％ ꎬ较原始菌株提高
２７. ０％ (表 １)ꎮ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ￣
ｍａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｒｈｉ￣
ｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｓｔｒａｉｎ
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ａｇａｉｎｓｔ
Ｒ. ｃｅｒｅａｌｉｓ / ％
ＬＴＲ￣２ ５９. ７ Ａ
Ｌ￣１ ７４. ２ Ｂ
Ｌ￣４ ８２. ３ Ｃ
Ｌ￣８ ８４. ９ Ｃ
Ｌ￣１０ ８６. ７ Ｃ
Ｌ￣２０ ７０. ９ Ｂ
Ｄｕｎｃａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄａｔａ ｗａｓ ｍａｄｅ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓ￣
ｔｉｃａｌ ｐｒｏｇｒａｍ ＳＰＳＳ１０. ０ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓꎬ Ｄａｔａ ｆｏｌｌｏｗｅｄ
ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｐｉｔａｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｍｅａｎ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ０. ０１ ｌｅｖｅｌ.
２. ８　 木霉转化子的温室防治效果试验
木霉转化子在温室条件下对小麦纹枯病有较
好的防治效果ꎬ与 ＬＴＲ￣２ 及井冈霉素处理间存在
显著性差异(Ｐ <０. ０１)ꎬ不同转化子之间也存在显
著性差异(Ｐ < ０. ０１)ꎬ其中转化子 Ｌ￣１０ 的防治效
果最高ꎬ为 ８３. ６％ ꎬ较原始菌株提高了 ２６. ７％
(表 ２)ꎮ
３　 讨论
小麦纹枯病是分布范围甚广的病害之一ꎬ早
在 １９３４ 年即有报道ꎮ 目前ꎬ该病在我国小麦产
区呈蔓延之势ꎬ危害也逐步加重ꎬ轻则减产 ５％ ~
１０％ ꎬ重则减产 ２０％ ~ ４０％ ꎬ甚至造成枯孕穗、枯
白穗ꎬ颗粒无收ꎮ 小麦纹枯病的防治ꎬ越早越
好[１５] ꎬ葡聚糖酶基因在小麦纹枯病防治上具有重
要作用ꎮ
８９３
　
　 ４ 期 　 　 李纪顺ꎬ等:通过染色体整合 β￣１ꎬ４￣葡聚糖酶基因 ｇｌｕ１４ 提高绿色木霉对小麦纹枯病的防治效果
Ｆｉｇ. ８　 β￣１ꎬ４￣ｇｌｕｃａｎａｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ
Ｔａｂｌｅ ２ 　 Ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒ￣
ｍａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｒｈｉ￣
ｚｏｃｔｏｎｉａ ｃｅｒｅａｌｉｓ ｉｎ ｇｒｅｅｎ ｈｏｕｓｅ
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
Ｄｉｓｅａｓｅ
ｉｎｄｅｘ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
/ ％
ＣＫ ５８. ０ Ａ ￣
Ｊｉｎｇｇａｎｇｃｙｍｉｎ ２７. ０ Ｂ ５３. ４
ＬＴＲ￣２ ２５. ０ Ｂ ５６. ９
Ｌ￣１ １５. ３ ＣＤ ７３. ６
Ｌ￣４ １４. ２ Ｄ ７５. ６
Ｌ￣８ １０. ７ Ｅ ８１. ６
Ｌ￣１０ ９. ５ Ｅ ８３. ６
Ｌ￣２０ １７. ０ Ｃ ７０. ７
Ｄｕｎｃａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄａｔａ ｗａｓ ｍａｄｅ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓ￣
ｔｉｃａｌ ｐｒｏｇｒａｍ ＳＰＳＳ１０. ０ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓꎬ Ｄａｔａ ｆｏｌｌｏｗｅｄ
ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｐｉｔａｌ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｍｅａｎ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ ０. ０１ ｌｅｖｅｌ.
　 　 对生防菌的遗传改良是获得优良菌株的有效
途径ꎬ尤其可以有目的地对菌株进行改造ꎬ使生防
菌获得兼治多种病害的功能ꎮ 近年来ꎬ已成功将
２０ 余种来自木霉菌本身和外源生物活性分子的编
码基因转入木霉菌中ꎬ明显提高了木霉菌的拮抗能
力[１６]ꎬ但利用葡聚糖酶基因转化木霉获得高效工
程菌株的报道较少ꎬＤｊｏｎｏｖｉｃ′等[１７]将 β￣１ꎬ３￣葡聚糖
酶基因和 β￣１ꎬ６￣葡聚糖酶基因转入绿木霉(Ｔ. ｖｉ￣
ｒｅｎｓ)中ꎬ转化子 ｄＯＥｓ 对终极腐霉(Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉ￣
ｍｕｍ)和立枯丝核菌(Ｒ. ｓｏｌａｎｉ)的抑制能力较原
始菌株有所增加ꎬ但其生长速度及产孢能力却明显
减低ꎬ不利于进一步推广应用ꎮ
本研究在前期工作基础上ꎬ将来自巨大芽胞杆
菌 Ａｐ２５ 的 β￣１ꎬ４￣葡聚糖酶编码基因 ｇｌｕ１４ 连入真
菌表达载体 ｐＳｉｌｅｎｔ￣１ꎬ基因位于 ＰｔｒｐＣ 启动子之
下ꎬ获得组成型表达载体 ｐＳｉｌｅｎｔ / ｇｌｕ１４ꎮ 利用 ＲＥ￣
ＭＩ转化绿色木霉 ＬＴＲ￣２ 后ꎬ各转化子的 β￣１ꎬ４￣葡
聚糖酶活性比原始菌株 ＬＴＲ￣２ 明显提高ꎬ表明在
启动子 ＰｔｒｐＣ启动下ꎬ来自细菌的外源基因 ｇｌｕ１４
可在木霉中有效表达ꎮ
通过试验表明ꎬ表达载体 ｐＳｉｌｅｎｔ / ｇｌｕ１４ 转化绿
色木霉 ＬＴＲ￣２ 后ꎬ各转化子的生物学性状既有相
同ꎬ又有不同ꎮ 相同之处在于各转化子对潮霉素都
具有遗传稳定性、其葡聚糖酶水解活性、对植物病
原真菌 Ｒ. ｃｅｒｅａｌｉｓ的平板抑制能力和温室防治效
果均较原始菌株 ＬＴＲ￣２ 有显著提高(Ｐ <０. ０１)ꎬ说
明 ｈｐｈ基因和 ｇｌｕ１４ 基因在转化子中稳定遗传并
表达ꎮ 但不同转化子的菌落形态、生长速率、产孢
能力等各不相同ꎮ 在葡聚糖酶水解活性、对植物病
原真菌 Ｒ. ｃｅｒｅａｌｉｓ的平板抑制能力和温室防治效
果方面ꎬ不同转化子间也存在显著性差异(Ｐ <
０. ０１)ꎬ表明 ＲＥＭＩ 转化的随机插入基因组 ＤＮＡ
后造成了转化子某些生物学性状的改变ꎬ这些改变
可能影响菌株的生物防治效果ꎮ
综合试验结果ꎬ利用 ＲＥＭＩ 技术ꎬ将 ｇｌｕ１４ 基
因重组到木霉染色体 ＤＮＡ 上ꎬ是获得高效木霉生
物防治菌株的有效手段ꎬ为深入开展绿色木霉生物
学基础理论与工业化生产应用研究奠定了基础ꎮ
９９３
　
植物病理学报 ４３ 卷
由于各转化子的生物防治效果受多种因素的影响ꎬ
故需对得到的不同转化子进行进一步的筛选ꎬ以得
到各方面效果优良的工程菌株ꎬ为推广应用奠定基
础ꎮ 本试验中的工程菌株 Ｌ￣１０ 生长速度加快、对
小麦纹枯病的防治效果较原始菌株显著提高ꎬ较以
往得到的转化子有更好的应用前景ꎮ
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责任编辑:于金枝
００４