全 文 ：文章编号:1002-8110(2002)06-0090-03
收稿日期:2002-07-16
作者简介:廖鲜艳(1975-), 女 , 湖南人 , 硕士研究生 ,主要从
事酿酒工程方面的研究。
啤酒废酵母蛋白质水解的研究
廖鲜艳 ,李　崎 ,李永仙 ,顾国贤
(江南大学生物工程学院 ,江苏 无锡　214036)
摘　要:优选得到酵母破壁的所用酶———CEREMIX , 并对影响其破壁提取酵母水解物的几个主要因素进行研
究 ,通过正交分析优化后得到反应条件为:反应温度 45℃,反应时间 32h , pH 自然(6.5～ 7.0), 加酶量 20u/ g干
酵母。在此实验条件下 , 总氮收率可以达到 44.56mg/g 干酵母。
关键词:啤酒废酵母;氨基酸;CEREMIX
中图分类号:TS262.5;TS261.9　　　　文献标识码:A
　　酵母水解物 , 是将酵母细胞内蛋白质降解成氨基酸 , 核
酸降解成核苷酸制得的人体可以直接吸收利用的可溶性的
营养及风味物质的浓缩物。 酵母水解物作为营养基料和天
然调味料在国际市场上已很畅销 ,美国 、英国 、法国 、荷兰 、日
本等国均有大量产品出口。 作为天然调味品已经食品与药
物管理局批准 ,开始应用于食品中[ 1] 。
提高酵母水解物中氨基酸含量的核心技术是细胞壁的
破碎和蛋白质和降解 ,从而使细胞组分快速释放[ 2] 。在活酵
母细胞中所有大分子均被半透膜包围在细胞内 , 细胞壁提供
必要的机械支撑维持细胞的大小和形状。在酶解过程中 , 细
胞壁破裂 , 细胞内生物大分子水解 , 水解后的产物扩散到周
围的介质中 , 产物中自由氨基酸的含量与总蛋白质含量有
关 ,根据这可粗略地估计酵母的水解程度。适当控制酶解时
的加酶量 、pH、温度 、时间可更好地完成这个过程。
1　材料与方法
1.1　材料
啤酒废酵母　　江苏溧阳天目湖啤酒有限公司提供
YL-NL　Amano Pharmaceutical Co.Led.NAGOYA , JAPAN
CEREMIX　丹麦 Novo Nordisk 公司产品
啤酒复合酶　四川攀枝花希圃生物集团公司产品
复合破壁酶　江南大学生物工程学院研制
1.2　主要仪器与设备
可调恒温振荡水浴锅　　SHZ-22 ,太仓医疗器械厂
高速离心机 CF7D2 , 日本日立公司
紫外可见分光光度计 UV-2100型 ,尤尼柯(上海)
近红外水分自动测定仪 MA40 , Sartorins公司
FOSS TECATER凯氏定氮仪　　2300 型 ,瑞典 FOSS 公司
高压均质机 15MR-8TBA
便携式 pH 计 PHB-2 , 上海三信仪表厂
1.3　分析方法
1.3.1　水分测定:近红外水分自动测定仪
1.3.2　β-葡聚糖酶活力:蓝色葡聚糖法[ 3]
1.3.3　总氮测定:FOSS TECATER凯氏定氮仪[ 4]
1.3.4　氨基氮测定:茚三酮法[ 4]
1.3.5　蛋白酶活力:福林-酚法[ 5]
1.3.6　RNA 测定:定磷法[ 6]
1.3.7　酵母破壁酶的选择
取一定量 10%(g/g)酵母悬浮液(注:若非特别说明 , 酵
母悬浮液浓度均为 10%), 分别加 20u/g 干酵母(注:破壁酶
的酶活单位 u , 均以 β -葡聚糖酶酶活计)的破壁酶
(CEREMIX、YL-NL、啤酒复合酶 、自产复合酶), 于 47℃反应
44h后 , 调 pH9.0 , 升温至 95℃, 保温 100min , 冷却 , 3000r/min
离心 ,取上清液测氨基氮(AAN)、总氮(TN)和 RNA。
2　结果与讨论
2.1　啤酒废酵母成份分析
表 1　 啤酒废酵母成份分析
检测指标 含量(g/ 100g干酵母)
蛋白质 52.0
RNA 6.2
2.2　酵母破壁酶的选择
水解破壁后的产物扩散到周围介质中 , 产物中氨基酸
量 、核苷酸量与酵母细胞壁的水解程度直接相关。由于酵母
细胞壁的骨架是 β -葡聚糖 , 所以选择几种具有分解 β-葡
聚糖能力的酶来进行研究 , 通过测定上清液总氮 、氨基氮 、
RNA含量来判别破壁效果。本文选用 YL-NL(600u/mL , 以 β
-葡聚糖酶酶活计 , 下同)、CEREMIX(2500u/mL)、啤酒复合
酶(300u/ g)和复合破壁酶(100u/ mL)来进行实验。 从表 2 来
看 ,经 YL-NL处理后 ,上清液中氮含量及 RNA得率最高 , 因
而是有利于破壁 ,但此产品销路窄且价格较贵;而国内生产
的啤酒复合酶酶活相当不稳定 ,无法应用于生产;相比之下 ,
CEREMIX来源易 , 价格适中 ,因此选用 CEREMIX 作为酵母破
壁的外加酶。此外 , CEREMIX还是一种复合酶 ,其中不仅有
第29卷　第 6期
2 0 0 2 年 1 1月　　　　　　　　　　　　　　　　　　
酿　　酒
LIQUORMAKING
　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.29 ,No.6
Nov., 　2002
β-葡聚糖酶酶活 ,而且有蛋白酶酶活(10000u/mL), 在降解 β
-葡聚糖的同时 ,还能够降解蛋白质类物质 , 更有利于破壁。
表 2　 各酶破壁情况
YL-NL CEREMIX 啤酒复合酶
复合破
壁酶
AAN(mg/ g干酵母) 11.45 10.09 11.08 9.13
TN(mg/ g 干酵母) 68.98 60.32 67.25 54.42
RNA(g/ 100g 干酵母) 4.19 3.71 4.13 3.35
2.3　CEREMIX添加量对酵母水解物氨基氮和总氮的影响
酶添加量的多少不仅关系到酶的反应速度 , 而且对产品
成本 ,工业化可行性也有着至关重要的影响。
分别取一定量的酵母悬浮液 , 加入不同的酶量 , 50℃反
应48h后 , 升温灭酶 ,冷却离心 ,测上清液氨基氮 、总氮含量。
实验结果如图 1所示。从图 1 可看出 ,酶加量在 5 ～ 20u之间
时 ,随着加酶量的增加 , 清液中总氮 、氨基氮收率不断提高 ,
酶加量为 20u/g 干酵母时 , 酵母蛋白质取率达 58%, 但酶加
入量继续增加时总氮收率增加趋势变缓。
图 1　CEREMIX添加量对酵母水解物氨基氮和总氮的影响
2.4　CEREMIX反应时间对酵母水解物氨基氮和总氮的影响
制备酵母水解物的过程实质上是酵母体内物质从细胞
中释放到反应液中的过程。要使反应液中总氮收率最高 , 即
有最好的破壁效果 ,除了加酶量适当外 , 还需要一定的时间。
取一定量的酵母悬浮液 , 加入 CEREMIX 20u/g 干酵母 , 反应
温度50℃,以不同的时间进行反应 , 结果(图 2)表明:总体看
来随酶反应的进行 ,酵母水解物中氨基氮和总氮的收率呈增
加趋势。在开始的 32h 内 ,氨基氮和总氮的收率随时间的延
长增加较快 , 32h 以后升幅减缓。出现这一现象的原因可能
是在开始 32h , 外加酶通过充分时间的作用 ,细胞壁被有效破
碎 ,细胞内物质以较快的速度释放出来;同时细胞内大分子
蛋白质被分解为肽和氨基酸;随时间的延长 , 酶作用底物减
少 ,副产物增多致使酶活下降 , 总氮收率趋于稳定。
2.5　CEREMIX酶解温度对酵母水解物氨基氮和总氮的影响
温度是影响酶反应的主要因素之一。温度过高或过低
都会降低酶活。取一定量的酵母悬浮液 , 加入 20u/g 干酵母
的CEREMIX ,在不同温度下反应 32h , 结果(图 3)表明:温度
在40～ 50℃之间时 ,酵母水解物总氮收率趋向最大 , 50℃后
总氮收率明显下降;氨基氮在 40℃时有最大收率 , 40℃以后
随着温度的增加 ,收率逐渐降低。
图 2　CEREMIX反应时间对酵母水解物氨基氮和总氮的影响
图 3　CEREMIX反应温度对酵母水解物氨基氮和总氮的影响
2.6　CEREMIX酶解 pH 对酵母水解物氨基氮和总氮的影响
pH 对酶催化反应的影响包括两个方面:影响酶的稳定
性;影响酶与底物的结合以及酶催化底物转变成产物。取一
定量的酵母悬浮液 , 加入 CEREMIX 20u/g 干酵母 , 45℃反应
32h。从图 4 可以看出 , pH 在 5.0 ～ 6.5 之间时氨基氮 、总氮
收率增加趋势比较明显 , pH 大于 6.5 时 ,氨基氮收率 、总氮的
图 4　CEREMIX反应 pH 对酵母水解物氨基氮和总氮的影响
收率基本维持不变而趋于平衡。
2.7　酵母酶解较优工艺确定
通过以上单因素实验 , 确定了各单因素的最佳作用条
件 ,再综合考虑各个单因素对 CEREMIX酶解的影响 , 以得到
一个最优的酶解破壁条件 , 提高总氮含量 , 所以考虑用正交
·91·第 6期　　　　　　　　　　　廖鲜艳 ,等:啤酒废酵母蛋白质水解的研究　　　　　　　　　　　　　　　　
实验设计 , 通过较少的实验次数而得到比较满意的效果 , 而
且可以通过方差分析 , 找出主次因素 , 考察因素水平对蛋白
质提取率的影响及各因素不同水平时的变化规律。由以上
实验结果 ,选取酶解温度 、酶解时间 、酶解 pH、酶的添加量作
为四个因素 ,以总氮收率为分析指标 , 实验设计及结果如表 3
和 4所示。
表 3　 正交因子
水平 A温度(℃)
B
(h)
C
pH
D
酶加量(u/g 干酵母)
1 40 24 6.0 15
2 45 32 6.5 20
3 50 40 7.0 25
　　表 4　 正交实验及结果
A B C D
TN(XI)
(mg/g 干酵母)Xi
=XI-38 Xi 2
1 1 1 1 1 34.21 -3.79 14.36
2 1 2 2 2 38.18 0.18 0.03
3 1 3 3 3 43.82 5.82 33.87
4 2 1 2 3 39.56 1.56 2.43
5 2 2 3 1 40.39 2.39 5.71
6 2 3 1 2 41.72 3.72 13.84
7 3 1 3 2 33.92 -4.08 16.65
8 3 2 1 3 37.17 -0.83 0.69
9 3 3 2 1 35.76 -2.24 5.02
对表 4的数据进行方差分析 , 结果如表 5 和 6所示。
表 5　 正交实验结果分析
ki/ k2i
TN(mg/ g干酵母)
A B C D
K1 2.21 -6.31 -0.9 -3.64
K2 7.67 1.74 -0.5 -0.18
K3 -7.15 7.3 4.13 6.55
K1
2 4.88 39.82 0.81 13.25
K2
2 58.83 3.03 0.25 0.03
K3
2 51.12 53.29 17.06 42.90
∑ki2 114.83 96.14 18.12 42.90
∑Xi =2.73　　　　∑X i 2=92.6
正交试验的方差分析结果表明:
几项因素对总氮得率影响相差不大 , 均属不显著因素。
但相比之下 ,温度对反应的影响最大。
由正交实验可以得到酵母酶解反应的较佳条件为:温度
45℃;时间 32h;pH 自然(6.5 ～ 7.0);加酶量 25u/g 干酵母。
考虑到降低产品成本 , 结合进一步实验验证 , 作者建议用
20u/g 干酵母的加酶量即可 ,在该实验条件下 , 总氮收率可以
达到 44.56mg/g 干酵母 , 略高于正交实验中的最高提取量
43.82mg/g干酵母。
表 6　 总氮含量方差分析表
方差来源 平方和 自由度 平均平方和 F 值
因素A 37.45 2 18.725 7.19
因素 B 31.22 2 15.61 5.99
因素 C 5.21 2 2.605 1.0
因素 D 17.90 2 8.95 3.44
总　和 91.78 8
注:F0.01=99.00 , F0.05=19.00
3　小结
3.1　选择了几种具有分解 β -葡聚糖能力的酶(YL-NL、
CEREMIX、啤酒复合酶和复合破壁酶)进行研究 ,经综合评价
确定 CEREMIX作为酵母破壁酶。
3.2　对影响 CEREMIX 酶解的各单因素条件进行了研究 , 并
结合正交分析 ,确定 CEREMIX酶解破壁的最佳条件为:反应
温度 45℃, 反应时间 32h , pH 自然(6.5 ～ 7.0), 加酶量 20u/g
干酵母。
[ 参考文献]
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[ 6] 蔡武城 ,等.生物物质常用化学方法分析[M] .1982 ,115-118.
白酒专家组在江苏太平洋(双洋)酒业公司指导工作
　　九月二十九日 , 我国白酒协会秘书长、著名白酒
专家高景炎率领刚参加完中国(宿迁)首届江苏名酒
节的“江苏酒业发展战略与政策研讨会”的江苏省白
酒协会领导李安陵 、刘建华等部份酿酒专家来到江
苏太平洋(双洋)酒业公司视察指导工作。专家组一
行受到了公司热烈欢迎。
公司领导徐绵春简单介绍了情况 , 专家组对江
苏太平洋(双洋)酒业公司提供的样品酒当场品尝 ,
随后作出点评:“双洋酒窖香浓郁、醇厚爽口、绵甜柔
和 ,香味协调 ,具有独特风格 , 实为苏酒中的珍品” 。
品评过后 ,高秘书长一行由该公司副总工程师、国家
级白酒评酒委员贺尔军同志陪同 ,深入酿酒车间 、包
装车间等地参观。最后高秘长对公司作了指导总
结:双洋要借名酒节为媒 , 广交天下朋友 , 加强工商
联合 ,扩大双洋知名度 , 进一步提升双洋品牌新形
象。但双洋必须更新观念 、狠抓营销、手段灵活 、强
化管理、开创文化底蕴深的品牌来开拓市场。高秘
书长还鼓励双洋人在新的机制下 ,积极进取、勇于创
新 ,坚信双洋在江苏太平洋这艘巨舰的引航下定会
更加辉煌。 (李孝庭 ,杨维军)
·92· 　　　　　　　　　　　　　　　　　　酿　　酒　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　第 29卷