全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第9期
海洋微藻种类丰富、生物量大、繁殖快。作为
食物链的初级生产者，在海洋生态系统的物质循环
及能量流动中起重要作用。海洋微藻可合成大量高
价值的天然化学成分，如蛋白质、微量元素、碳水
化合物、维生素等营养物质，及不饱和脂肪酸 EPA
（二十碳五烯酸）、DHA（二十二碳六烯酸）等药物
活性物质［1，2］，在医药、食品、生物能源和环境修
复方面的应用备受研究者的青睐。同时，其富含油脂，
是制备生物柴油的理想材料，有望解决后石油时代
的能源危机［3］。其中，以 EPA 和 DHA 为代表的 ω-3
PUFAs（多不饱和脂肪酸）在促进脑细胞发育、激
发脑神经纤维延伸、增加脑容量、提升大脑敏锐度，
改善视力等方面都有功效。因此从微藻油脂中提取
收稿日期 ：2014-03-07
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30960215）， 广西自然科学基金项目（桂科青 0728019）
作者简介 ：刘红全，男，博士，副教授，研究方向 ：生物技术 ；E-mail ：lhongquan@163.com
三角褐指藻的诱变育种及产 EPA 的条件研究
刘红全  林小园  李洁琼  潘艺华
（广西民族大学海洋与生物技术学院 化学与生物转化过程新技术广西高校重点实验室，南宁 530006）
摘 要 ： 旨在获得不饱和脂肪酯 EPA 产量更高的藻种，利用 0.6% EMS 对三角褐指藻进行诱变。通过单细胞分离技术得到 1
株突变株 EP1，其 EPA 产量比出发藻株提高了 19.81%。结果显示，突变藻株产 EPA 的最适条件为 ：NaNO3 75 mg/L，pH7.5，昼夜
温度 17-15℃，接种量为 12%。最适条件下培养 7 d，其 EPA 产量可达 26.77 mg/g。传代试验表明，突变藻株具有较好的遗传稳定性。
关键词 ： 三角褐指藻 EMS 诱变 EPA
The Research on Mutagenesis Breeding of Phaeodactylum tricornutum
and the Condition of EPA Producing
Liu Hongquan Lin Xiaoyuan Li Jieqiong Pan Yihua
（Guangxi National Oceanic and Biotechnology College，New Technology of Chemical and Biological Transformation Process of Guangxi Key
Laboratory of University，Nanning 530006）
Abstract: In order to obtain algal strains of high EPA production, Phaeodactylum tricornutum was mutated by 0.6% EMS. The mutant
strain EP1 was isolated by single cell clone from 200 mutant clones. The EPA yield of EP1 was increased by 19.81% compared with the parent
strain. The most suitable foster condition includes NaNO3 75 mg/L, pH7.5, day-night temperature 17-15℃, 12% inoculation quantity and
training 7 days. The EPA yield of EP1 could reach 26.77 mg/g under the suitable foster condition. The results of subculture test showed that the
mutant strain possesses good hereditary stability.
Key words: Phaeodactylum tricornutum EMS mutagenesis EPA
PUFAs 成为医疗和保健品开发的热点。但目前，生
产采用的藻种多从自然界分离获得，性状单一，易
退化，所提取的脂肪酸种类及含量随藻的培养条件
不同变化很大，无法满足人们日益增长的需求［4］。
因此运用微藻育种技术，改良微藻品质，培养出生
长快速、PUFAs 产量高的新品种迫在眉睫。
微藻的诱变育种方法一般采用紫外线、γ-射线、
EMS（甲基磺酸乙酯）、细胞融合及转基因等，以引
起细胞核染色体断裂，碱基缺失、置换、重组等生
物学效应，从而使后代性状发生变异，获得可应用
于微藻养殖和加工的新品系［5］。其中 EMS（甲基磺
酸乙酯）化学诱变技术已被国内外公认为一种有效、
成熟的技术，在作物育种中得到广泛应用［6，7］。三
2014年第9期 115刘红全等：三角褐指藻的诱变育种及产 EPA的条件研究
角褐指藻是一种真核海洋单细胞硅藻，不仅营养价
值含量高、富含不饱和脂肪酸，且繁殖能力强，易
于室内或户外规模化培养。其主要脂肪酸成分为
16∶0、16∶1Δ9、16∶3Δ6，9，12 和 EPA，其中 EPA
能占到总脂肪酸含量的 30% 以上［8］，有望作为工业
化生产 EPA 的来源［9］。本研究利用 EMS 对三角褐
指藻进行诱变育种，以期筛选出生长速度快、EPA
含量高的株系。
1 材料与方法
1.1 材料
试 验 所 用 的 三 角 褐 指 藻（Phaeodactylum
tricornutum）购自武汉中科院水生生物研究所。
1.2 方法
1.2.1 培 养 条 件 250 mL 的 三 角 瓶 内 装 100 mL
的 培 养 液， 于 121℃ 高 压 灭 菌 20 min。 培 养 温 度
（24±1）℃，光照强度（4×40 W 日光灯照射），光
暗周期为 12 h/12 h。 培养液采用 F/2 配方配制，人
工海水的配方参考陈百灵［10］的稍作改进。每天振
摇 2-3 次，藻悬液长到指数生长后期时，用于试验。
1.2.2 甲基磺酸乙酯（EMS）的诱变
1.2.2.1 EMS 诱变的预试验 取处于对数生长期的
藻液 10 mL，离心收集藻细胞。所得藻细胞分别放
入浓度为 0.2%、0.4%、0.6%、0.8% 和 1.0% 的 EMS
溶液（用 0.06 mol/L，pH7 的磷酸缓冲液配制）中
悬浮至 10 mL，处理 30 min。加入 1 mL 硫代硫酸钠
（5%）终止诱变反应。离心去除诱变液，ddH2O 冲
洗 1 次，新鲜营养液洗涤两次，避光 12 h。培养 1 d
后测定细胞的致死率同时将藻液进行扩大培养，测
定比生长速率。根据致死率和比生长速率确定合适
的诱变剂浓度。
1.2.2.2 EMS 诱变及突变株的筛选 以预试验中确
定的诱变剂量对出发株诱变。诱变后将全部藻液转
移到 50 mL 三角瓶中，遮光 12 h，3 d 后将藻液涂布
在固体培养基上，12 d 后分别挑取体积较大、黄褐
色的藻落 200 株于 50 mL 的培养液中。
利用尼罗红染色法进行初筛。尼罗红是一种脂
溶性荧光染色剂，能与脂类物质结合，在一定的激
发波长下能发射脂特异性荧光，通过染色选择合适
的而激发波长和自发波长可测定细胞内的油脂含量，
细胞经染色后的荧光强度与细胞内油脂含量显著相
关，可对细胞中油脂进行定量分析［11］。利用荧光显
微镜通过观察比较细胞内小油珠的大小、数量，荧
光强度可以判断微藻油脂含量高低。尼罗红染色法
可以作为富油微藻初筛的指标，简便快速。对分离
得到的微藻进行尼罗红染色，观察荧光强度。取 1
mL 细胞密度为 106 的藻液，加入尼罗红染料（0.5
mg/mL）20 μL 于 40℃孵育 10 min，将染好色的藻细
胞滴入载玻片中，于荧光显微镜下进行观察细胞中
脂滴的大小和数量［12］。
筛选出的藻株接种到 150 mL 培养液中培养，每
隔 1 d 计算细胞密度，10 d 后离心，烘干，测定脂
肪酸含量。根据终细胞密度及脂肪酸含量筛选出一
株优良藻株，进行后续工作。
1.2.3 突变藻株产 EPA 条件的优化
1.2.3.1 NaNO3 浓 度 对 诱 变 株 生 长 及 产 EPA 的 影
响 NaNO3 浓度设置 5 个梯度 ：0、37.5、75、102.5
和 150 mg/L，其余培养条件不变。隔天测细胞密度，
待藻细胞长到稳定期后，提取 EPA。
1.2.3.2 pH 对诱变藻株生长及产 EPA 的影响 pH
设 置 5 个 梯 度 ：6.5、7.0、7.5、8.0 和 8.5， 其 余 培
养条件不变。每个梯度设置 3 个平行样，隔天测细
胞密度，待藻细胞长到稳定期后，提取 EPA。
1.2.3.3 温度对诱变藻株生长及产 EPA 的影响 温
度设置 6 个梯度 ：17、20、23、25、27 和 30℃，pH
为 7.5，其余培养条件不变。每个梯度设置 3 个平行
样，隔天测细胞密度，待藻细胞长到稳定期后，提
取 EPA。
1.2.3.4 接种量、培养天数及昼夜温差对诱变藻株
产 EPA 的交互影响 根据单因素试验中微藻生长及
产 EPA 的条件差异，选择合适的培养条件，通过正
交试验筛选出培养条件的优化组合，正交试验如表
1 所示。
表 1 试验因子及其水平
水平
因子
昼夜温差（℃） 接种量（%） 培养天数（d）
1 17-15 8 7
2 20-18 10 10
3 23-21 12 13
pH 为 7.5，其余培养条件不变
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期116
1.2.4 遗传稳定性分析 将筛选得到的诱变株连续
转接 6 代，测定第 1 代和第 6 代的 EPA 含量，检测
是否能稳定遗传。
1.2.5 不饱和脂肪酸的提取及气相色谱测定
1.2.5.1 采用甲醇-氯仿提取法 参考姚领等［13］采
用氯仿-甲醇混溶液（2∶1，V/V）超声提取粗脂肪酸，
将粗提液加入等体积的 1 mol/L 的 KOH-CH3OH 混溶
液于 75℃水浴中皂化，最后用正己烷萃取上机气相
色谱测定，在整个操作过程中需充 N2 保护不饱和脂
肪酸不被氧化 。
1.2.5.2 脂肪酸的色谱测定法［14］ 采用日本岛津的
气相色谱仪，60 m×0.32 mm×0.25 μm 石英毛细管
柱，汽化室和检，测器的温度均为 250℃，色谱柱
的升温程序 ：初始 70℃，以 30℃/min 的速率升温
至 150℃， 然 后 以 5℃/min 升 温 到 250℃， 保 持 到
所测样品的峰值都出现。载气为高纯 N2，流速为
30 mL/min，H2 流速为 40 mL/min，空气流速为 450
mL/min，分流比为 1∶60，进样量 1 μL。通过与标
准脂肪酸保留时间的对比鉴别各脂肪酸组分，面积
归一化法计算出各脂肪酸的相对含量。
2 结果
2.1 EMS诱变剂量的选择
EMS 诱变处理中，三角褐指藻比较敏感，随浓
度增加微藻的颜色逐渐变浅，在 0.6% 的浓度以上出
现褐色浑浊沉淀，当浓度为 1.0% 时，藻液几乎无色
且产生大量白色糁状固体。不同浓度 EMS 对三角褐
指藻的致死作用（图 1）显示，当 EMS 浓度为 1% 时，
三角褐指藻的致死率高达 97.4% 且未恢复生长。综
合考虑致死率及恢复生长的时间选择 0.6% 的 EMS
作为诱变剂量。
2.2 诱变后优良藻株的选育
2.2.1 尼罗红染色进行初筛 图 2 显示，筛选得到
的诱变藻株脂肪粒数明显比出发藻株增多了，几乎
每个藻细胞都含有两个以上脂肪粒，油脂粒的体积
和荧光强度也比对照组提高了，由此初步确定筛选
得到的诱变株粗脂含量高于对照组，将筛选得到的
诱变株进一步扩大培养，测比生长速率及气相色谱
测定 EPA 含量。
0
20
40
60
80
100
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2䈡ਈࡲ⎃ᓖ%㠤↫⦷%
图 1 EMS 诱变处理后三角褐指藻的致死率
EP1 ሩ➗
图 2 诱变藻株油脂的荧光定性分析（10×20）
2.2.2 通过比生长速率及 EPA 含量进行筛选 经过
预试验的最佳诱变剂量诱变后，利用单细胞分离技
术筛选得到 1 株生长较快，脂肪酸含量较高的藻株，
以诱变剂名称及微藻名称的首字母命名为 EP1。其
EPA 含量及比生长速率见图 3 和图 4。
10
EP
A
ਜ਼䟿mg/g 15253020
5
0 ሩ➗ 㰫Ṛ EP1
0.00 ሩ➗ PE1㰫Ṛ0.050.10∄⭏䮯䙏⦷ 0.150.200.250.30图 3 诱变后选育藻株的 EPA 含量
图 4 诱变后选育藻株的比生长速率
2014年第9期 117刘红全等：三角褐指藻的诱变育种及产 EPA的条件研究
图 3 显示，选育出的诱变株 EPA 含量为 23.59
mg/g，比对照组提高 19.81%，这与尼罗红染色结果
相一致。图 4 显示，EMS 诱变后的微藻恢复生长后，
比生长速率也大于对照组，为 0.2700。
2.4 对选育出的藻株进行培养条件的优化
2.4.1 氮源浓度对诱变藻株产 EPA 的影响 氮源是
海洋微藻生存的必需营养盐，影响细胞的生长速度
及胞内活性物质的合成积累。本试验考察了氮源浓
度对诱变藻株（EP1）产 EPA 的影响，结果（图 5）
显示，在 NaNO3 浓度为 75 mg/L 时，EPA 的积累量
达到最大，此后随 NaNO3 浓度增加，EPA 含量降低。
通过方差分析得到 P 值为 0.076，说明氮源浓度对诱
变株的影响不显著。
2.4.3 温度对诱变藻株产 EPA 的影响 海洋微藻的
较适生长温度一般在 20-30℃左右。试验结果（图 7）
显示，低温有利于三角褐指藻的生长及产 EPA，在
30℃条件下三角褐指藻停止生长。低温有利于 EPA
的积累，筛选获得的诱变藻在 20℃条件下 EPA 产
量最高，为 23.92 mg/g。通过方差分析发现温度对
EPA 的产量影响差异性不显著（PEP1=0.59）。
0
5
10
15
20
25
30
0 30 60 90 120 150 180
NaNO3⎃ᓖmg/LEPAਜ਼䟿mg/g
图 5 NaNO3 对 EP1 产 EPA 的影响
2.4.2 pH 值对诱变藻株产 EPA 的影响 pH 值对海
洋微藻的生长及生化组分的有着重要的影响作用。
海洋微藻生长的最适 pH 与海水的 pH 相同，海洋硅
藻的最适生长 pH 为 7.2-8.1［15］。图 6 显示，诱变株
的最适 pH 值为 7.5，在此条件下 EPA 产量为 24.19
mg/g，通过方差分析得到 P 值小于 0.05，说明 pH
对微藻 EPA 的产量有显著影响。
0
5
10
15
20
25
30
6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0
pH٬EPAਜ਼䟿mg/g
图 6 pH 值对 EP1 产 EPA 的影响
0
5
10
15
20
25
30
15 18 21 24 27 30 33⑙ᓖćEPAਜ਼䟿mg/g
图 7 温度对 EP1 产 EPA 的影响
2.4.4 接种量、培养天数及昼夜温差对诱变藻株产
EPA 的交互影响 根据温度的单因素试验可知，微
藻的较适生长温度要高于产 EPA 的温度。低温有利
于提高不饱和脂肪酸含量，因此在正交试验中采用
昼夜温差的培养方式，以达到提高目标产物的效果。
不同培养条件对微藻中 EPA 含量的影响见表 2。根
据表 2 中 R 值得到，影响 EP1 产 EPA 的因素主次
顺序 ：培养天数＞昼夜温度＞接种量，其产 EPA 的
最优水平为 ：17-15℃、接种量 12%，培养 7 d。结
果表明，较低温及短时间培养更有利于三角褐指藻
积累 EPA。
2.5 遗传稳定性分析
鉴于诱变藻株的性状常常不稳定，尤其是在连
续继代培养时，为了检测所得藻株的性状是否稳定，
连续转接 6 代，测定第 1 代和第 6 代的 EPA 含量。
结果（图 8）显示，诱变株 EP1 第 1 代和第 6 代的
EPA 产量变化不明显，通过方差分析 EPA 的变化不
显著，说明选育的变异藻种具有良好的遗传稳定性。
3 讨论
变异是选择优良品系的基础，但自发突变频率
较低，人工诱发突变在育种中具有重要作用。与物
理诱变相比，化学诱变剂产生的染色体畸变比例较
少，更多是产生点突变 ；价格便宜，操作简单，引
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期118
起突变的范围广。诱变剂对植物组织或细胞、基因
的诱变有一定专一性，因此广泛适用于微藻的诱变
育种，并且取得一定成效。赵爱娟［15］采用 EMS 对
海水小球藻和等鞭金藻进行诱变，群体生长水平虽
受到一定抑制，却提高了藻细胞中 EPA 和 DHA 的
含 量。 其 中 球 藻 EPA 和 DHA 的 含 量 分 别 提 高 了
44.69% 和 72.61%，等鞭金藻中 EPA 和 DHA 的含量
分别是对照组的 1.8 倍和 14 倍。本试验通过 0.6%
的 EMS 对三角褐指藻进行诱变，通过单细胞分离技
术筛选得到一株诱变株 EPA 含量为 23.59 mg/g，比
对照组提高 19.81%。
微藻的生长及代谢物积累除了与藻种自身有关
外，还受培养条件的影响［16］。众多研究者对影响藻
细胞生长，生化组成的各种营养盐水平、环境因子
进行了深入探讨，研究发现通过改变培养条件可人
为控制藻细胞中 PUFAs 的合成量及生物总量，有利
于获得更高水平的目标产物。研究表明，氮源缺乏
可引起微藻细胞蛋白含量减少，而增加脂肪酸和碳
水化合物的含量［17，18］。由于氮源不足时，细胞的蛋
白合成和增殖分裂等活动均受到抑制，吸收的多余
碳源就转化为甘油三酸酯贮存在细胞中［19］。本试验
得到 NaNO3 浓度为 75 mg/L 时，EPA 的积累量达到
最大，此后随 NaNO3 浓度增加，EPA 含量降低。这
与 Widjaja［11］研究的低浓度氮源有利于脂肪酸的积
累相一致。三角褐指藻的生长 pH 和温度与海水相似，
pH 在 7.2-8.1，温度 20-30℃。本试验的诱变藻株较
适生长和产 EPA 的 pH 和温度分别为 7.5 和 20℃，
研究表明低温有利于不饱和脂肪酸的积累。这是因
为在低温条件下，藻类需通过生产更多的 PUFAs 来
维持细胞膜的流动性［21］，这与钱振明的研究［23］相
似，在 15-25℃之间有利于促进细胞主要理化成分
（蛋白、多糖、脂肪酸）的积累，而低于 15℃或高
于 30℃均不利于细胞生长，也不利于胞内理化成分
的合成。
4 结论
在单因素试验的基础上进行正交试验，通过
条件优化得到 EP1 的最佳培养条件为 ：NaNO3 75
mg/L，pH7.5，昼夜温度 17-15℃、接种量 12%、培
养 7 d。在此条件下培养的三角褐指藻 EPA 产量达
26.77 mg/g。通过遗传稳定性试验分析可知，诱变株
第 1 代和第 6 代的 EPA 产量变化不显著（P>0.05），
说明选育的变异藻种具有良好的遗传稳定性。
参 考 文 献
［1］ Kang SM, Kim AD, Heo SJ, et al. Induction of apoptosis by diphlor-
etho hydroxycarmalol isolated from brown alga, Ishige okamurae
［J］. Journal of Functional Foods, 2012, 4 ：433-439.
［2］ Takashi K, Takahiko I. Polysaccharides and antioxidant properties of
aqueous solutions obtained from macroalgal beachcasts in the Noto
Peninsula. Ishikawa, Japanese［J］. Food Chemistry, 2009, 112（3）：
575-581.
［3］ Posten C, Schaub G. Microalgae and terrestrial biomass as source for
fuels ：a process view［J］. Journal of Biotechnolog, 2009, 142 ：
64-69.
图 8 诱变藻株第 1 代与第 6 代的 EPA 含量比较
30
20
10
EP
A
ਜ਼䟿mg/g
5
0 ㅜ1ԓ ㅜ6ԓษޫԓᮠ1525
表 2 培养条件对 EP1 产 EPA 的影响正交试验结果及直观
分析
试验号
昼夜温度
（℃）
接种量
（%）
培养天数
（d）
EPA 产量
（mg/g）
1 17-15 8 7 20.07
2 17-15 10 10 14.67
3 17-15 12 13 24.32
4 20-18 8 10 10.75
5 20-18 10 13 9.03
6 20-18 12 7 16.70
7 23-21 8 13 13.79
8 23-21 10 7 19.05
9 23-21 12 10 3.86
EP1
k1 19.687 14.870 18.607
k2 12.160 14.250 9.760
k3 12.233 14.960 15.713
R 7.527 0.710 8.847
2014年第9期 119刘红全等：三角褐指藻的诱变育种及产 EPA的条件研究
［4］ 扬世杰 , 王希善 , 李继芬 , 等 . 螺旋藻培养初探［J］. 北京农业
大学学报 , 1998, 14（1）：71-74.
［5］ 王妮 , 王素英 , 师德强 . 螺旋藻诱变育种研究进展［J］. 食品
与研究开发 , 2009, 30（2）：139-141.
［6］ 降云峰 , 刘永忠 , 李万星 , 等 . 甲基磺酸乙酯诱变技术在大豆
育种上的应用［J］. 园艺与种苗 , 2012, 11（6）：12-15.
［7］ Bird R, Mck M, Neuffer G. Induced mutations in maize［M］// Janick
J. Plant Breeding Reviews. New York ：Van Nostrand Reinhold,
1987, 16（5）：139-180.
［8］ Yongmanitchal W, Ward OP. Growth and production of omega-3 fatty
acid by Phaeodactylum tricornulum under culture conditions［J］.
Apply Environ Microbiology, 1991, 57（2）：419-425.
［9］ 蒋汉明 , 张凤珍 , 翟静 , 等 . ω-3 多不饱和脂肪酸与人类健康［J］.
预防医学论坛 , 2005, 11（1）：65-69.
［10］ 陈百灵 . 磷硅对三角褐指藻生长和脂肪酸组成的影响［D］.
青岛 ：中国海洋大学 , 2011 ：55-56.
［11］ Elsey D, Jameson D, Raleigh B, et al. Fluoreseent measurement of
microalgal neutral lipids［J］. J Microbiological Methods, 2007,
39（68）：639-642.
［12］ Chen W, Zhang C, Song L. A high throughput Nile red method for
quantitative measurement of neutral lipids in Microalgae［J］.
Journal of Microbiological Methods, 2009, 37（77）：41-47.
［13］ 姚领 , 胡萍 , 胡蓓娟 , 等 . 两种溶剂提取法提取三角褐指藻
中不饱和脂肪酸的比较［J］. 食品工业科技 , 2001, 5（12）：
114-116.
［14］ 蔡阿根 , 郑爱榕 , 李文权 , 等 . 海洋微藻中脂肪酸的气相色谱
分析［J］. 海洋技术通报 , 1998, 17（4）：64-68.
［15］ Pahl SL, Lewis DM, Chen F, King KD. Heterotrophic growth
and nutritional aspects of the diatom Cyclotella cryptica
（Bacillariophyceae）：Effect of some environmental factors［J］.
Bioscience and Bioengineering, 2010, 109（3）：235-239.
［16］ 杨官品 , 张继民 , 魏东 , 等 . 温度逆境处理提高拟微球藻 EPA
含量的研究［J］. 青岛海洋大学学报 , 2002, 24（4）：132-
136.
［17］ 赵爱娟 . 海洋微藻的诱变育种及其脂肪酸的测定［D］. 南京：
南京理工大学 , 2005 ：46-47.
［18］ Mata TM, Martins AA, Caetano NS. Microalgae for biodiesel
production and other applications ：a review［J］. Renew Sust
Energy Rev, 2010, 14 ：217-232.
［19］ Go S, Lee SJ, Jeong GT. Factors affecting the growth and the oil
accumulation of marine microalgae, Tetraselmis suecica［J］.
Bioprocess Biosyst Eng, 2012, 35 ：145-150.
［20］ Widjaja A, Chien CC, Ju YH. Study of increasing lipid production
from fresh water microalgae Chlorella vulgaris［J］. Journal of the
Taiwan Institute of Chemical Engineers, 2009, 40（1）：13-20.
［21］ Meng X, Yang J, Xu X, et al. Biodiesel production from oleaginous
microorganisms［J］. Renewable Energy, 2009, 34（1）：1-5.
［22］ 钱振明 , 邢荣莲 , 汤宁 , 等 . 光照和盐度对８种底栖硅藻生长
及其生理生化成分的影响［J］. 烟台大学学报 ：自然科学与
工程版 , 2008, 21（1）：46-52.
（责任编辑 马鑫）