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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
辣椒（Capsicum L.）是一种重要的蔬菜和经济
作物，在我国常年种植面积稳定在 130 万 hm2 以
上，产值和效益雄踞蔬菜作物之首。随着辣椒种植
规模的扩大，辣椒病害危害也日益严重，其中辣椒
枯萎病在我国陕西、甘肃、吉林、四川、湖南、北
京、广西等地发病严重，发病率一般为 15%-30%，
严重时达 70%-80%，局部甚至全田枯萎死亡［1］。引
起辣椒枯萎病的主要致病菌是尖孢镰刀菌辣椒专化
型菌株（Fusedum oxysporum f. sp. capsicum），它是一
种世界性分布的丝状真菌，属于半知菌类、从梗孢
目、瘤孢科、镰刀菌属，其主要形态特征是在马铃
薯蔗糖培养基上菌落呈发射状生长，菌落颜色为淡
紫色、粉红色及白色等，可产生大型分生孢子和小
收稿日期 ：2012-10-24
基金项目 ：农业公益性行业科研专项（200903049）
作者简介 ：弭宝彬，男，硕士研究生，研究方向 ：蔬菜学 ；E-mail ：mibaobin@126.com
通讯作者 ：茆振川，男，副研究员，研究方向 ：植物寄生性线虫病害 ；E-mail ：maozhenchuan@yahoo.com.cn
尖孢镰刀菌辣椒专化型原生质体制备条件优化
弭宝彬1  张吉祥2  杨宇红2  茆振川2
（1. 中南大学研究生院隆平分院，长沙 410125 ；2. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘 要 ： 以尖孢镰刀菌辣椒专化型（Fusedum oxysporum f. sp. capsicum）为供试菌株，研究了其原生质体制备的最佳条件，
明确了菌龄、酶的种类、酶解时间、酶解温度及转速等因素对原生质体制备的影响。结果表明，当利用孢子培养的 14 h 的菌丝体
以 15 mg/mL 崩溃酶、0.7 mol/L 的 NaCl 作为渗透压稳定剂，140 r/min，32℃酶解 4 h 时，可最大限度的收集原生质体，其在再生固
体培养基 SR 上再生率为 32.3%。
关键词 ： 尖孢镰刀菌辣椒专化型 原生质体制备 再生
Optimizing Method of Preparation of Protoplast in
Fusedum oxysporum f. sp. capsicum
Mi Baobin1 Zhang Jixiang2 Yang Yuhong2 Mao Zhenchuan2
（1. Longping Branch of Graduate School，Central South University，Changsha 410125 ；2. Institute of Vegetable and Flowers，Chinese
Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract:  Several conditions in preparing the protoplast of Fusedum oxysporum f. sp. capsicum were optimized. Effects of the incubation
time, enzyme system, the enzymolysis time, temperature and rotate speed were discussed. It was found that when keeping other parameters as ：
spore cultured for 14 hours, 15 mg/mL of Drislase, 0.7 mol/L NaCl and 140 r/min, 32℃ for 4 h, the minimum consummation of protoplasts can be
obtained and the regeneration rate of the protoplast was 32.3% on regeneration medium SR.
Key words:  Fusedum oxysporum f. sp. capsicum Preparation of protoplast Regeneration
型分生孢子，大型分生孢子呈镰刀形，常有 3 个分
隔，小型分生孢子单胞，椭圆形至卵圆形。原生质
体是进行真菌分子生物学研究中的良好材料。真菌
原生质体在生物技术研究中具有独特优势，其缺乏
细胞壁，可直接对其进行遗传操作或诱导其融合，
形成杂种细胞，且仍然保持细胞的全能性，经过培
养可进行繁殖。因此，可通过研究病原菌原生质体
的制备和再生这一关键技术来探讨植物病原菌的致
病机制，从而寻求控制植物病害的有效措施。本研
究首次针对尖孢镰刀菌辣椒专化型的原生质体的制
备、最佳条件以及原生质体再生等方面进行研究，
旨在为进一步研究其致病性机理及遗传改良奠定
基础。
2013年第4期 97弭宝彬等 ：尖孢镰刀菌辣椒专化型原生质体制备条件优化
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 尖孢镰刀菌辣椒专化型，由中国农科
院蔬菜花卉研究所病害组于辣椒上分离纯化获得。
1.1.2 主 要 试 剂 菌 体 细 胞 壁 裂 解 液 由 崩 溃 酶
Drislase（Sigma 公 司 ）、 蜗 牛 酶 Snailase（Sigma 公
司）、裂解酶 lying（Sigma 公司）、纤维素酶 cellulase
（Sigma 公司）、聚乙二醇（PEG）、二甲基亚砜（DMSO）、
STC ［ 山 梨 醇（Sorbitol）1.2 mol/L ；Tris-HCl pH7.5，
10 mmol/L ；CaCl2 50 mmol/L］等组成，酶解液于 4℃
预冷的 0.7 mol/L 的 NaCl 溶液在冰上溶解，4 000 r/min
离心 15 min，去掉未溶解的杂质，配制好的酶液存
放于 -20℃。
1.2 方法
1.2.1 菌种培养 配制孢子悬液 ：将菌种活化，并
在 PDA 培养平板上 28℃培养 3 d，在长有孢子的
PDA 培养皿中注入 3-5 mL 的无菌水，充分振荡，
然后取出少量在血球计数板上镜检，根据结果将其
孢子悬浮液浓度调整到 106 个 /mL。
于 CM 培养基中接种尖孢镰刀菌孢子并将其置
于 28℃，150 r/min 避光培养，一般每 150 mL CM 液
体培养基（主要为减少孢子产生）接种 5 mL 孢子悬
液，并分别选取上述 8、10、12、14 和 16 h 培养的
菌液，过滤菌丝，用 0.7 mol/L 的 NaCl 洗净残存的
孢子，称取 1 g 的菌丝体，用于分析不同菌龄对原
生质体的产量分析。
1.2.2 原生质体制备 将在 CM 培养基上于 28℃，
150 r/min 避光培养最佳的时间的尖孢镰刀菌悬浮液
用灭菌的三层纱布过滤菌丝，菌丝用 0.7 mol/L 的
NaCl 冲洗直至形成紧密的菌丝团，用灭菌的滤纸尽
量吸干，然后按照 0.5 g 菌丝加 1 mL 裂解酶液进行
酶解反应，每 30 min 镜检原生质体的释放形式、形
态及产量。
酶浓度为 10-15 mg/mL［2，3］，在制备中分别用
蜗牛酶、纤维素酶、崩溃酶、裂解酶单酶解及等体
积比例混合的崩溃酶和裂解酶分别进行裂解处理。
对于效果最佳酶处理设置 26℃、28℃、30℃、32℃
和 34℃等 5 个不同温度处理，及不同转速为 80、
120、140、160 和 200 r/min，检测酶解温度、转速
对原生质体产量的影响。
1.2.3 原生质体纯化 将裂解的混合菌液经三层灭
菌的擦镜纸过滤，收集滤液中的原生质体，用 0.7
mol/L NaCl 溶液反复冲洗滤纸上的裂解菌丝团，收
集的滤液于 4℃，2 000 r/min 离心 10-15 min，弃上
清，沉淀用 5 mL STC 溶液重悬，重悬原生质体悬浮
液于 4℃，2 000 r/min 离心 10-15 min，得到的沉淀
即为原生质体。利用血球计数板计算原生质体浓度
及产量，其中原生质体产量的定义为每 1 g 菌丝裂
解后所获得的原生质体个数。
1.2.4 原生质体的保存 将用 STC 纯化后的原生
质体浓度调整为 2×108 个 /mL，加入 1/10 体积的
PEG 和 1/100 体积的 DMSO，轻轻混匀，分装为 100
μL/管，于 -80℃保存［4］。
1.2.5 原生质体的再生 取 0.1 mL 浓度为 1×108
个 /mL 的新鲜的原生质体溶液涂布到 SR 固体培养
基，每个处理 10 皿，重复 3 次［5］。同时，取 0.1 mL
上述浓度的原生质体溶液并加入 1 mL 无菌水，室温
静置 30 min 后涂布到 SR 固体培养基或 PDA 平板作
为对照。28℃条件下避光培养 3-5 d，至平板表面长
出小菌落为止，观察菌落生长速度及数量，计算原
生质体的再生率。
原 生 质 体 再 生 率（%）=［（ 再 生 固 体 培 养 基
上长出的小菌落 - 对照小菌落数量）/ 原生质体数
量］×100%
2 结果
2.1 原生质体的制备
在显微镜下镜检（图 1）发现，原生质体的释
放情况有以下两种方式 ：一种是从菌丝端部或侧部
释放原生质体（图 1-A），另一种是先将菌丝消解成
念珠状（图 1-B），然后直接生成原生质体。观测发现，
尖孢镰刀菌的原生质体生成两种方式都存在。
2.1.1 酶种类对原生质体产量的影响 本试验初步
确定酶的浓度为 15 mg/mL，因此，本试验分别采用
蜗牛酶、纤维素酶、崩溃酶及裂解酶对尖孢镰刀菌
的酶解效率进行研究，结果（图 2）发现崩溃酶和
裂解酶的单酶酶解效率最高，其中崩溃酶的效率最
高，裂解酶的效果相对最差，纤维素酶酶解效率最差，
产量为 7.5×105 个 /g。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期98
生质体的效率较低，其中 12 h 和 14 h 菌丝体长度比
较适合（图 3-a），芽管长度适中，并且没有孢子生成，
且菌丝体产量较多，适合原生质体的制备，故选择
12 h 或 14 h 培养的菌丝进行原生质体制备。
2.1.3 酶解时间对原生质体产量的影响 在酶解 1 h
以后开始镜检原生质体的产生情况，然后每隔 0.5 h
镜检一次，2 h 后可以观察到菌丝细胞壁开始瓦解释
放出圆的顶端，3 h 后观察发现有较多的原生质体，
用血球计数板统计原生质体数目，发现 5 h 以后几
乎不再增加，为保证原生质体的再生，故酶解尖孢
镰刀菌的时间最好在 4-5 h。
2.1.4 酶解温度对原生质体产量的影响 崩溃酶酶
解时酶解温度直接影响到酶促反应的速度，真菌酶
解脱壁的温度一般在 24℃-35℃之间。设定酶解温
度为 26℃、28℃、30℃、32℃和 34℃，图 3-b 显示，
随着温度的上升，原生质体的生成速度是增加的，
但如果酶解温度过高，镜检发现里面原生质体生成
数量急剧下降，并且有破裂的原生质体，为了保证
原生质体的再生，最终确定最佳酶解温度为 32℃。
2.1.5 转速对原生质体产量的影响 震荡酶解液是
为了使酶与菌丝体充分接触，有利于加速酶解反
应进程，保持其他条件不变，分别设定转速为 80、
120、140、160 和 200 r/min，由图 3-c 可以看出，转
速对原生质体产量的影响与温度对原生质体生成速
率有类似的规律，随着转速的增加原生质体生成的
速度加快，但转速超过 160 r/min 可以明显看到原生
质体破裂的数量增加，因此确定原生质体制备最佳
转速为 140 r/min。
25µm
B
25µm
50µm
50µm
C D
A
A ：侧部释放 ；B ：裂解成念珠状释放 ；C ：培养 14 h 的菌丝 ；
D ：酶解 5 h 原生质体
图 1 原生质的释放过程
图 2 不同酶种类对原生质体制备的影响
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2.1.2 不同菌龄对原生质体制备的影响 分别选取
8、10、12、14 和 16 h 培养的菌液制备的原生质体
进行分析，发现培养 8 h 的芽管比较短，其产生原
8
9
10
11
12
13
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15
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17
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ba c
a ：菌龄的影响 ；b ：温度对原生质体的影响 ；c ：转速的影响
图 3 不同因素对原生质体制备的影响
2013年第4期 99弭宝彬等 ：尖孢镰刀菌辣椒专化型原生质体制备条件优化
2.2 原生质体的再生
原生质体的再生能力是衡量获得原生质体质量
的最关键指标，是原生质体是否有利用价值的重要
评价标准，而且发现原生质体随着存放时间的延长
其再生效率是下降的，由图 4 可知在存放初期下降
速率较快，达到一定时间后其再生率几乎保持不变，
约为 10% 左右，王秋华［5］在尖孢镰刀菌黄瓜专化
型原生质体保存试验中也发现在 -80℃存放 1 周后，
原生质体的再生率会下降到 10% 左右，同时还可以
看到，原生质体的存放时间不要超过 1 周，这样就
可以保证期再生率，为进一步的试验提供便利。
其酶解效率相对于孢子培养的芽管要低，而采用 CM
培养基培养孢子的方式，可以保证菌丝体生长阶段
一致，并且相对于 PDA 培养基，CM 培养基培养的
菌丝体的孢子产量要低的多，而且 CM 培养基相对
清澈，容易观察菌丝的培养状态。在原生质体的制
备过程中还需要用大量的 0.7 mol/L 的 NaCl 冲洗，
尽量洗掉菌丝体的培养液，使菌丝体尽量成为紧实
的团状体，此外，菌丝和酶的配比尽量不要多于 0.5
g ∶ 1 mL，否则，原生质体的产量将难于保证。原
生质体纯化时尽量用 STC 多次纯化，这样会去除大
量的菌丝片段和酶解不完整的原生质体，保证原生
质体的质量，提高转化的接触机会，增大转化成功率。
为保证原生质体的活性，试验中的全部试剂都要在
4℃预冷，原生质体的有效保存有助于后续试验的便
利，减少试验操作和时间，而且有助于大规模试验
的进行，原生质体保存时先要在 -4℃存放 10 min 以
上，使加入的保护剂充分与原生质体接触并充分保
护原生质体。但本试验还是发现原生质体的存放时
间较短，限制了多批次，需求大量原生质体试验的
的进行，还需要进行进一步的摸索研究。
尖孢镰刀菌的细胞壁成分复杂，一般采用复合
酶进行酶解，单一酶的效果非常有限［8］。酶浓度未
达到一定值时原生质体不易释放出来，但同时酶中
往往含有对原生质体有害的物质，随着酶量的增加，
杂质（如过氧化物、酶、核糖核酸酶等）的浓度也
会随之增加，当达到一定浓度时，必然会影响原生
质体的活性［5，9］。此外，酶浓度过大，细胞脱壁太
彻底、易破裂，原生质体量反而下降，因此最佳酶
浓度也是原生质体制备的关键因素之一［10］。因此初
步确定本试验酶的浓度为 15 mg/mL，本试验分别采
用蜗牛酶、纤维素酶、崩溃酶及裂解酶对尖孢镰刀
菌的酶解效率进行研究，结果发现崩溃酶和裂解酶
的单酶酶解效率最高，其中崩溃酶的效率最高，裂
解酶的效果相对最差，纤维素酶酶解效率最差，产
量为 7.5×105 个 /g，这与林玲［11］在禾谷镰孢菌原生
质体的制备中的研究结果一致，说明两种菌种之间
应该有着相似的细胞壁结构，肖荣凤［12］在西瓜枯
萎病的原生质体制备过程中，发现在将崩溃酶和裂
解酶按等体积比例混合时其酶解效率最高，但在本
试验中其酶解效率反而不如单一的崩溃酶效率高（采
0
0
0.05
0.15
0.25
0.35
0.3
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2 4 6 8 10 12 14 16
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图 4 原生质体存放时间对原生质体再生率的影响
3 讨论
从本质来说，原生质体制备是混合酶或单一酶
促反应。影响酶促反应的条件因素如温度、时间、
酶浓度都会影响原生质体的产量。对于不同的菌种，
由于细胞壁成分不同，因此在制备原生质体时所需
酶的种类和浓度也存在差异。目前针对尖孢镰刀菌
辣椒转化型菌原生质体的研究未见报道。
形成原生质体时菌株的生理状态是决定原生质
体质量的主要因素之一。丝状真菌一般在菌丝线性
生长的早期阶段原生质体的产量高，但并非菌丝越
嫩越利于酶解。菌丝只是在其生长的某个阶段对混
合酶液最为敏感［6］，在此阶段酶解效果较好，过早
或过晚都不利于酶解，这有可能是因为菌丝生长的
不同阶段其细胞壁的结构组成不同，从而导致对混
合酶液的敏感性不同［7］。许多研究中原生质体制备
用培养的菌丝体接种，而笔者发现菌丝体培养过程
中一般会产生大量的孢子而对后续试验不便，而且
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期100
用崩溃酶是原生质体产量为 2.02×107 个 /g，而混合
酶产量仅为 1.035×107 个 /g），这可能与辣椒枯萎菌
及西瓜枯萎菌的细胞壁成分存在差异有关，也有可
能是两者工作的最佳条件还需要进一步摸索，但因
为单一的崩溃酶可以符合原生质体的制备要求，因
此选择单一的崩溃酶为酶解物进行原生质体制备，
进行原生质体产量统计。本研究中崩溃酶的效果最
好，这与禾谷镰刀菌和甘蓝枯萎菌等研究结果相同，
崩溃酶是一种混合酶，包含昆布多糖酶、木聚糖酶
和纤维素酶，消解细胞壁的能力强。而在担子菌亚
门真菌白灵菇的原生质体制备需要甘露醇作为渗透
压稳定剂，且蜗牛酶和纤维素酶混合效果更佳［13］。
尖孢镰刀菌为半知菌亚门真菌，其细胞壁的成分与
白灵菇存在较大的差异，因此在酶的种类选择上具
有一定差异。总体来看，本研究筛选的尖孢镰刀菌
原生质体制备条件能够获得较多的原生质体，这为
该菌的遗传研究奠定了基础。
4 结论
本研究通过研究尖孢镰刀菌辣椒专化型的原生
质体制备的所用酶种类、酶解时间、温度及转速等
因素的摸索优化，最终确定原生质体最优制备条件
为采用孢子培养 14 h，采用崩溃酶酶解，于 32℃、
140 r/min 酶解 4 h，原生质体制备量可以达到 2.7×108
个 /g 菌丝，其中再生率可达到 32.3%。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）