全 文 ：· 828 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2016, 51 (5): 828−833



麦角菌 Cp-1 菌株遗传转化体系的建立
王维波, 陈晶晶, 朱 平*
(中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室 &
国家卫生计生委天然药物生物合成重点实验室, 北京 100050)
摘要: 麦角菌 Cp-1 菌株是本实验室筛选获得的工业生产菌株, 能产生多种麦角生物碱。为了实现该菌株定向
生物合成某种特定的药用麦角碱, 遗传转化体系的建立不可或缺, 但由于麦角菌本身存在遗传异质性, 现有的遗
传转化体系不能满足 Cp-1 菌株的需要。本文研究了菌丝体浓度、溶壁酶浓度和酶解时间对原生质体形成的影响,
并考察了该菌株对不同抗生素的敏感性, 以期建立其遗传转化体系。结果表明, 使用 1% 溶壁酶 (5 mL) 25 ℃酶
解菌丝体 (1 g) 2 h 后, 即可产生大量的原生质体。在 PEG 的介导下, 以 1.5 mg·mL1 的潮霉素 B 为筛选标记, 转
化质粒 pAN7-1 于原生质体, 可获得大量转化子, PCR 诊断证明外源基因已成功地整合到 Cp-1 菌株的基因组上。
本研究为进一步改良 Cp-1 生产菌株奠定了重要的基础。
关键词: 麦角菌; 麦角生物碱; 原生质体制备; 遗传转化
中图分类号: R931 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2016) 05-0828-06
Establishment of transformation system of
Claviceps purpurea Cp-1 strain
WANG Wei-bo, CHEN Jing-jing, ZHU Ping*
(State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines and Key Laboratory of Biosynthesis of Natural
Products, National Health and Family Planning Commission of PRC, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical
Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China)

Abstract: Claviceps pururea Cp-1 strain established in our lab is capable of producing variety of bioactive
ergot alkaloids, and is broadly used by the pharmaceutical companies. To engineer the strain genetically for
the production of specific ergot alkaloid, an effective transformation system must be set up first. However,
the reported transformation system is not suitable for this strain due to different genetic backgrounds and the
heterogeneity of Claviceps. Thus, in this paper, the hyphae of Cp-1 strain were used to prepare protoplasts by
lywallzyme. The formation of protoplasts was investigated under different concentrations and incubation time
of enzyme. The strain was tested for sensitivity to several antibiotics at different concentrations. Finally, the
genetic transformation system of Cp-1 strain was established. The results suggest that protoplasts were formed
efficiently by using 1% lywallzyme at 25 ℃ for 2 h. Transformants were obtained by PEG mediated protoplast
transformation of Cp-1 strain with plasmid pAN7-1, using 1.5 mg·mL−1 hygromycin B as the selective marker.
The exogenous gene in the plasmid pAN7-1 was integrated into the genome of Cp-1 strain transformant as
demonstrated by PCR result. This study laid an important foundation for genetic manipulation of Cp-1 strain.
Key words: Claviceps; ergot alkaloid; protoplast preparation; genetic transformation

收稿日期: 2016-03-11; 修回日期: 2016-04-06.
基金项目: 药物研究所基本科研业务费 (2015CX07).
*通讯作者 Tel / Fax: 86-10-63165197, E-mail: zhuping@imm.ac.cn
DOI: 10.16438/j.0513-4870.2016-0206
王维波等: 麦角菌 Cp-1 菌株遗传转化体系的建立 · 829 ·


麦角菌 (Claviceps) 能够产生多种天然的、具有
药用活性的麦角生物碱 (ergot alkaloid), 具有广泛的
临床用途[1]。很多天然或者半合成的麦角生物碱在现
代医学中普遍使用, 如麦角新碱用于催产和治疗产
后出血; 麦角胺及其衍生物用于治疗偏头痛、产后止
血; 麦角毒碱类用于治疗高泌乳素血症、与老龄化有
关的神经退行性疾病等[2]。近年来, 麦角生物碱的药
理学活性已经得到了深入的研究, 表明麦角碱通过
与中枢神经系统中的多种受体相互作用而发挥其药
理活性[3, 4]。
麦角菌 Cp-1 菌株系通过长期菌种选育得到, 它
可发酵生产麦角新碱和多种麦角肽碱, 目前已投入
相关企业进行生产。然而, 在工业发酵生产中, 该菌
株常常能同时产生多种麦角碱, 这为之后提取某种
特定的药用麦角碱增加了纯化难度。因此若能基于基
因工程等分子育种手段对该生产菌株进行遗传改造,
使之定向生物合成某一类麦角生物碱, 则具有重要
的工业生产意义。由于麦角菌同种异株之间存在较大
的遗传异质性, 造成已建立的遗传转化体系在推广
应用上的局限性, 并且前期实验发现已报道的遗传
转化体系并不适合 Cp-1 菌株。因此, 针对该菌株建
立遗传转化体系, 对于今后对其开展分子生物学研
究具有重要意义。原生质体的数量和质量是建立遗传
转化体系的重要基础, 本实验室曾建立了麦角菌原
生质体制备与再生方法[5]。在此基础上, 本文进一步
优化了酶解条件, 详细探讨了在不同菌丝体浓度和
溶壁酶浓度及酶解时间下原生质体的形成情况, 目
的在于快速获得质量较佳的原生质体; 随后, 利用
PEG-CaCl2 介导的方法实现了 Cp-1 菌株原生质体的
转化, 为今后利用该遗传转化体系对现有的 Cp-1 菌
株进行分子遗传操作奠定了重要基础。

材料与方法
菌株 麦角菌 Cp-1 菌株为本实验室保存菌株。
质粒 真菌表达质粒 pAN7-1 保存于本实验室;
该质粒带有 hph 基因 (潮霉素 B 磷酸转移酶基因) 且
其上游和下游分别与 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因 (gdp)
强启动子和色氨酸酶 C (trpC) 终止子连接, 从而能
在真菌中表达而具有对潮霉素的抗性。
培养基 Cp-1 菌株培养于 T25D 斜面培养基[5];
NL720 液体培养基[5]; 原生质体细胞培养于再生培养
基[5]; LB 培养基 (0.5% 酵母提取物、1% 胰蛋白胨、
1% 氯化钠、固体培养基加 1.5% 琼脂)。
试剂与仪器 潮霉素 (hygromycin B) 购于
Sangon Biotech 公司; 腐草霉素 (phleomycin)、遗传霉
素 (geneticin) 购于 Sigma 公司; 溶壁酶 (lywallzyme)
购于广东省微生物研究所; DNA marker、Taq DNA 聚
合酶购于 Tansgene 公司; 其他试剂均为国产分析纯。
PCR 仪 (Eppendorf 公司); Mini 2D 型电泳仪 (Bio-
Rad 公司); 3K18 型低温高速离心机 (Sigma 公司);
Biospectrum AV system凝胶成像仪 (美国UVP公司);
HZQ-QX 全温振荡摇床 (哈东联科学仪器有限公
司)。
菌体培养 菌种在斜面上培养 7天后, 取少量菌
体捣碎并接于 NL720 液体培养基中, 24 ℃、240 r·min−1
条件下摇瓶培养 3 天, 并按 10% 接种量再次转接于
NL720 培养基, 继续培养 24 h。
不同酶解液浓度和酶解时间对原生质体制备的
影响 离心收集上述新鲜幼嫩的菌丝体 , 10 000
r·min−1, 10～15 min, 用无菌水洗涤菌体 2～3 次后,
使用 0.7 mol·L−1 KCl 溶液作为渗透压稳定剂来重悬
菌丝体, 同时取 25、50 和 100 mg 溶壁酶溶于 2 mL
的 0.7 mol·L−1 KCl 溶液中, 经 0.22 μm 滤膜进行过滤
得到不同浓度的酶解液。随后, 取 1 g 湿重的菌体溶
于 3 mL的 0.7 mol·L−1 KCl溶液, 并将上述 2 mL酶解
液分别加入 3份上述菌液中进行酶解, 此时酶解液终
浓度分别为 0.5%、1% 和 2%, 将其置于 25 ℃、100
r·min−1 的摇床上进行酶解, 利用显微镜观察在不同
酶解液浓度和酶解时间下原生质体的形成情况。
Cp-1 菌株对不同抗生素的敏感性测试 将 Cp-1
菌株的菌丝体接于T25D培养基上培养5～7天, 待长
满平板后, 用直径 0.5 cm 的打孔器取相同面积的菌
体转接于分别含有不同浓度的潮霉素 (hygromycin
B)、腐草霉素 (phleomycin)、博来霉素 (bleomycin)
和遗传霉素 (geneticin) 的培养基上, 待菌丝长满不
含有抗生素的平板后, 分别测定各平板菌丝体的直
径, 计算不同抗生素对 Cp-1 菌株的生长抑制率。
PEG 介导的原生质体的转化 利用无菌棉花过滤
上述酶解液以除去残余菌丝体, 于 2 200 r·min−1、4 ℃
条件下离心 10 min, 收集酶解后的原生质体, 用 0.85
mol·L−1 的 STC 缓冲液 (0.85 mol·L−1 山梨醇、10
mmol·L−1 Tris-HCl、50 mmol·L−1 CaCl2) 重悬原生质
体使其浓度达到每毫升 108 个。取 100 μL 原生质体,
加入 10 μg 待转化的质粒, 另取 100 μL 原生质体, 加
入与上述质粒溶液等体积的 ddH2O作为对照。用 STC
缓冲液补齐体积至 200 μL, 随后加入 50 μL PEG溶液
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(25% PEG 6000、10 mmol·L−1 Tris-HCl、50 mmol·L−1
CaCl2) 后, 冰浴 20 min, 再加入 2 mL PEG 溶液, 室
温静置 20 min, 最后加入 4 mL STC 缓冲液, 将上述
悬液混于 100 mL 再生培养基中, 于 5 个平板 24 ℃下
倒置避光培养 7～9 天, 待其长出单菌落。
转化子的筛选 挑取上述转化平板上的单菌落
于新鲜含药培养基上, 24 ℃下倒置避光培养 5～7 天
后, 挑取转化子的菌丝体提取基因组, 少量提取基因
组 DNA 的方法如下: 用干净牙签挑取少量的菌丝体
于 EP 管中, 加入 500 μL 裂解缓冲液 (400 mmol·L−1
Tris-HCl pH 8.0、60 mmol·L−1 EDTA pH 8.0、150
mmol·L−1 NaCl、1% SDS); PEG 溶液 (25% PEG
6000、10 mmol·L−1 Tris-HCl、50 mmol·L−1 CaCl2);
60 ℃孵育 20 min; 加入 150 μL 醋酸钾 (5 mol·L−1, pH
4.8) 溶液, 剧烈涡旋, 12 000 r·min−1 离心 5 min, 取上
清于新的 EP管中; 加入等体积的异丙醇来沉淀DNA,
12 000 r·min−1 离心 2 min; 弃上清, 加入 300 μL 的
70% 乙醇洗涤核酸沉淀, 12 000 r·min−1 离心 1 min, 弃
上清; 自然风干去除乙醇后, 用 20～25 μL的 ddH2O 重
悬, 并加入 2 μL RNase 除去 RNA。
按照 pAN7-1 质粒上 hph 基因 (潮霉素 B 磷酸转
移酶基因) 抗性表达盒序列设计上下游引物: hph-F:
5-CCAGGCTTTACACTTTATGC-3; hph-R: 5-GATG
TGCTGCAAGGCGATTA-3。分别以转化子和 Cp-1
野生型菌株的基因组 DNA 和 pAN7-1 质粒作为模板,
使用引物 hph-F 和 hph-R 进行阳性转化子的鉴定。
PCR 反应体系为: 2×TransTaq-T SuperMix 8 μL; 上、
下游引物 (10 μmol·L−1) 0.5 μL; 基因组DNA (10～30
ng·μL−1) 3 μL; ddH2O 4 μL。反应条件为 94 ℃预热 5
min, 94 ℃变性 30 s, 52 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 4 min 30
s, 30 个循环, 72 ℃后延伸 10 min。取 5 μL PCR 产物
0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测。

结果
1 不同酶解液浓度和酶解时间对原生质体制备的影
响
使用浓度分别为0.5%、1% 和2% 的溶壁酶 (5 mL)
对相同湿重的 Cp-1 菌株的菌丝体 (约为 1 g) 进行酶
解, 并在显微镜下观察酶解 0.5、1 和 2 h 后原生质体
的形成情况。如图 1 所示, 使用不同浓度溶壁酶酶解
0.5 h 时, 即有少量原生质体释放, 但仍然存在大量菌
丝; 随着酶解时间的增加, 菌丝体逐渐被酶解完全,
原生质体的数量逐渐增加。1 g 菌丝体在使用 0.5% 溶
壁酶 (5 mL) 酶解 2 h 后, 仍有少部分菌丝体未被酶
解; 使用 1% 溶壁酶 (5 mL) 酶解菌丝体 2 h 后, 视野
下可观察到大量球形的原生质体从菌丝体中游离出
来, 仅存在少量菌丝碎片; 在 2% 高浓度酶解液的作
用下, 菌丝体酶解速率最快, 在酶解 1 h 后仅有少部
分菌丝体残余。考虑到已释放的原生质体与高浓度
的裂解酶长时间接触会导致其活力下降, 以及节省
溶壁酶成本, 后期实验中作者使用优化后的酶解条
件: 即选择 1% 的溶壁酶 (5 mL) 酶解菌丝体 (1 g)、
25 ℃、酶解 2 h 的条件快速制备大量原生质体。
2 Cp-1 菌株对不同抗生素的敏感性
以抗生素为筛选标记建立遗传转化系统时, 出
发菌株对抗生素的敏感性至关重要。就 Cp-1 菌株而
言, 它并非营养缺陷菌株, 故采用抗性筛选标记。本
文分别测试了 Cp-1 菌株菌丝体对不同抗生素 (包括
潮霉素 hygromycin B、腐草霉素 phleomycin、遗传霉
素 geneticin、博来霉素 bleomycin) 的敏感性, 取相同


Figure 1 The release of protoplast under the different concentrations of enzyme and enzymatic time. Bar = 10 μm
王维波等: 麦角菌 Cp-1 菌株遗传转化体系的建立 · 831 ·


体积的菌丝体培养于各个含有不同浓度的抗生素的
培养基, 避光培养 5～7 天后, 观察各种抗生素抑制菌
丝体生长的情况。如图 2 所示, 随着潮霉素浓度的增
加, Cp-1 菌株的生长抑制率随之增加, 当潮霉素浓度
为 1.5 mg·mL−1时, Cp-1 菌株的生长已被完全抑制, 因
此, 该浓度的潮霉素可作为转化体系中的筛选浓度。
然而, Cp-1 菌株对高浓度的腐草霉素 (500 μg·mL−1)、
遗传霉素 (16 mg·mL−1) 和博来霉素 (1.0 mg·mL−1)
仅表现一定程度上的敏感性, 并未能完全抑制其生
长, 因此并不适合作为筛选标记。
3 PEG-CaCl2 介导的原生质体的转化
利用 PEG-CaCl2介导的方法将质粒 pAN7-1 转入
100 μL Cp-1 菌株的原生质体 (浓度为每毫升 108 个),
而未转化质粒 DNA 组作为对照组; 将转化组和对照
组在含 1.5 mg·mL−1 潮霉素的平板上避光培养 7 天左
右后, 可观察到转化组平板 (图 3A) 白色单菌落, 而
对照组无单菌落长出 (图 3B)。
4 阳性转化子的筛选
为了检测质粒 pAN7-1是否转入Cp-1菌株中, 从


Figure 2 The sensitivity of Cp-1 strain to different antibiotics
上述转化平板上随机挑取 16 个抗性转化子, 重新接
种于含 1.5 mg·mL−1 潮霉素的新鲜培养基上, 避光培
养 5～7 天, 可观察到转化平板上的单菌落在含药培
养基仍正常生长 (图 4)。用牙签挑取少量的菌丝体,
提取各转化子的基因组 DNA。随后, 以各转化子的
基因组 DNA 作为模板, 使用引物 hph-F 和 hph-R 进
行 PCR 扩增, 扩增后 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳,
如图 5 所示, 诊断 PCR结果表明, 以大部分转化子的
基因组 DNA 为模板时 (除 6、10、13 和 17 号外), 扩
增得到的产物大小均与阳性对照中 (pAN7-1 质粒为
模板) 扩增得到的产物大小一致, 均为 4.3 kb 左右;
而阴性对照 (野生型基因组 DNA 作为模板时) 并未
扩增得到目的条带。以上结果表明, 质粒 pAN7-1 已
成功转化 Cp-1 菌株, hph 基因片段已整合在 Cp-1 菌
株的基因组 DNA 上且发挥了抗潮霉素的功能。


Figure 3 The colonies of transformants on medium containing
1.5 mg·mL−1 hygromycin B after transforming Cp-1 strain with
pAN7-1 (A); and the negative control of transformation of Cp-1
strain (B)


Figure 4 The growth of the transformants on fresh medium
containing 1.5 mg·mL−1 hygromycin B


Figure 5 Identification of positive transformants by diagnosis PCR. M: Maker; 1: The genome of wild type strain as the template
(negative control); 2: pAN7-1 as the template (positive control); 3−18: The genomes of different transformants as the template
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讨论
在建立真菌遗传转化体系时, 原生质体的制备
是至关重要的一步[6]。真菌原生质体的获得一般以刚
萌发的孢子或者幼嫩的菌丝为材料, 菌龄过老菌丝
的细胞壁成分较为复杂, 多会沉积不易被降解的物
质, 从而不利于原生质体的形成和释放[6, 7]。本课题
组的前期研究结果也表明, 菌丝体的生长状态对原
生质体形成影响很大, 幼嫩菌丝易于酶解释放原生
质体, 菌丝老化则较难酶解。因此, 选择液体培养
3～4 天, 转接后培养 1 天的幼嫩菌丝体来制备原生
质体[5]。同时, 由于真菌细胞壁成分比较复杂, 选择
合适的酶对于原生质体的制备尤其重要。已有的研
究报道通常选择使用 β-D-葡聚糖酶 (β-D-glucanase
enzyme)、Novozyme234、纤维素酶 (cellulase)、溶菌酶
(lysozyme) 或崩溃酶 (driselase) 等制备原生质体[6]。
本课题组曾利用溶壁酶 (广东微生物所研制) 酶解
菌龄较小的麦角菌菌丝, 取得了良好的结果[5], 这与
很多大型真菌 (如草菇、香菇等) 利用此酶制备原生
质体的结果较为一致[7−11]。本文在此基础上进一步确
定了酶解时的 Cp-1 菌株菌丝体的用量、酶的浓度以
及酶解时间, 获得了适于遗传转化、质量较佳的原生
质体。
有文献[12−15]报道在包括麦角菌在内的多种子囊
菌中建立了遗传转化体系, 然而由于子囊菌是一个
非常庞大的类群, 遗传背景千差万别, 麦角菌的同种
异株之间甚至表现出异质性, 因此对于麦角菌 Cp-1
菌株的遗传转化体系具体建立条件仍需要摸索。例如,
已有报道表明潮霉素对于麦角菌 P1 菌株的最低抑菌
浓度为 400 μg·mL−1 [15], 但对于麦角菌Cp-1菌株的最
低抑菌浓度高达 1.5 mg·mL−1, 两者相差近 4倍; 更有
甚者, 腐草霉素对于麦角菌 P1 菌株的最低抑菌浓度
仅为 80 μg·mL−1, 但对于 Cp-1 菌株而言, 500 μg·mL−1
腐草霉素却只能部分抑制 Cp-1 菌株的生长 (图 2)。
又例如, 遗传霉素抗性基因 (KanMX) 和博来霉素抗
性基因 (ble) 常被用作真菌的遗传转化体系的建立
[16, 17], 但这两种抗生素均不能有效地抑制Cp-1菌株的
生长。这些结果表明, 在建立某种真菌的遗传转化体
系并采用抗性基因作为筛选标记时, 应通过筛选找
到适合于该菌株的抗性标记及筛选浓度。本文将含有
潮霉素抗性标记的 pAN7-1 质粒转化 Cp-1 菌株的原
生质体, 在潮霉素质量浓度为 1.5 mg·mL−1 的转化平
板上观察到有大量转化子长出。更重要的是, 诊断
PCR 结果表明潮霉素表达元件已整合到转化子的基
因组中。
目前, Cp-1 菌株已应用于工业生产麦角生物碱,
但在生产过程中它产碱成分复杂, 这为某些特定的
药用麦角碱的获得带来了极大的困难。通过遗传改造
技术来改变麦角碱生物合成途径中的代谢流, 使其
定向生物合成某种特定的麦角碱具有较高的实际应
用价值, 而 Cp-1 菌株遗传转化体系的成功建立, 为
后续获得更优良的工业生产菌株奠定了重要基础。
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