全 文 ： 菌物学报
jwxt@im.ac.cn 15 January 2014, 33(1): 121‐128
Http://journals.im.ac.cn Mycosystema ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q © 2014 IMCAS, all rights reserved.
研究论文 Research paper DOI: 10.13346/j.mycosystema.120209
基金项目：国家自然科学基金（No. 31071837，No. 31272217）“食用真菌组合表达紫杉醇及其中间产物的基础研
究”和“食用真菌组合表达白藜芦醇的研究”
*Corresponding author. E‐mail: junfanglin2003@yahoo.com.cn
收稿日期: 2012‐10‐12, 接受日期: 2013‐03‐07
PEG 介导的猴头菌遗传转化体系的建立
刘莉 1 肖招燕 1 郭丽琼 1, 2 林俊芳 1, 2* 尤琳烽 1 廖静文 1
1 华南农业大学食品学院 广东 广州 510640
2 华南农业大学生物质能研究所 广东 广州 510640
摘 要：对猴头菌 Hericium erinaceus 原生质体制备的各种因素进行比较研究，结果表明，猴头菌原生质体制备的
最佳体系为：液体培养 5d 的猴头菌丝，以 0.6mol/L KCl 作为稳渗剂，加入含 1.0%纤维素酶+1.0%蜗牛酶+1.0%溶壁
酶的复合酶，在 30℃酶解猴头菌丝 3h 时，原生质体得率达到 3.0×106个/mL。潮霉素敏感性测试表明，猴头菌在
PDSA 固体培养基上的潮霉素最低筛选浓度为 60μg/mL。采用 PEG 介导的原生质体法，将质粒 pBgGI‐hph（含有灵
芝 gpd1‐Gl 启动子和潮霉素抗性基因 hph）转化猴头菌原生质体，经潮霉素初步筛选以及 PCR 鉴定，表明有 4 株猴
头菌拟转化子的基因组扩增出 hph 基因；转化子经过多次转接后进行 Southern 杂交验证，结果表明 4 个转化子的
基因组中均稳定整合了 hph 抗性基因。
关键词：猴头菌，原生质体制备，PEG 介导转化
Establishment of genetic transformation system of Hericium erinaceus
using PEG mediated method
LIU Li1 XIAO Zhao‐Yan1 GUO Li‐Qiong1, 2 LIN Jun‐Fang1, 2* YOU Lin‐Feng1 LIAO Jing‐Wen1
1College of Food Science, South China Agriculture University, Guangzhou, Guangdong 510640, China
2Institute of Biomass Energy, Guangzhou, Guangdong 510640, China
Abstract: The method for protoplast preparation of Hericium erinaceus was studied. The 5‐day‐old mycelia treated with
the mixture of 1.0% lywallzyme, 1.0% cellulase and 1.0% snailase in 0.6mol/L KCl at 30℃ for 3h could produce an
efficient yield of protoplasts to 3.0×106/mL. Drug resistance test of H. erinaceus against hygromycin B showed that the
lowest selection concentration were 60μg/mL. By PEG‐mediated protoplast transformation, the expression plasmid
pBgGI‐hph (containing promoter gpd1‐Gl derived from Ganoderma lucidum and selectable marker gene hph conferring
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resistance to hygromycin B) was successfully transformed into the protoplast of H. erinaceus. Identifications of the
putative transformants were performed by hygromycin B blotting and PCR analysis with hph gene. The results showed
that there are four positive transgenic H. erinaceus with hph gene. After several generations of subculture, southern
blotting analysis showed that the marker hph gene was integrated into the genomic DNA of transformants.
Key words: Hericium erinaceus, preparation of protoplast, PEG‐mediated protoplast transformation
猴头菌 Hericium erinaceus (Bull.) Pers.，又
名猴头蘑、熊头菇、刺猾菌。猴头菌是一种食
药用真菌，含有萜类化合物、酚类化合物、吡
喃化合物等活性成分，具有抗肿瘤、提高免疫
力、抗溃疡、抗炎症、降血糖、延缓衰老、抗
氧化等功效（张鹏等 2011）。目前人们研究较
多的是其生理功效成分，关于它的分子生物学
研究较少。迄今国内外只有几篇关于猴头菌原
生质体制备的研究报道，如马向东等（1995）
对猴头菌原生质体制备的条件进行探索；李艳
红等（2006）系统地探讨了猴头菌原生质体分
离的条件，然而目前还没有关于猴头菌遗传转
化的研究。本文首次建立了猴头菌的转化系
统，对于今后开展猴头菌的分子生物学研究提
供了理论基础与技术支持。
1 材料与方法
1.1 供试材料
猴头菌购自北京吉蕈园科技有限公司，保
存于 PDSA 固体斜面上。表达载体 pBgGI‐hph
含有灵芝 gpd1‐Gl 启动子（613bp）和潮霉素抗
性基因 hph（1 020bp），由华南农业大学食品
学院生物炼制实验室提供。
1.2 试剂
潮霉素（Hygromycin B，HmB）购自广州
科因生物科技有限公司；蜗牛酶购自北京普博
欣公司；溶壁酶购自广东省微生物研究所；碱
性磷酸酶、geranylgeraniol 标准品购自 Sigma
公司；exTaq 酶、dNTP 购自广州东盛生物科技
有限公司；RNA prep pure 植物总 RNA 提取试
剂盒、胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自天
根生化科技有限公司；Ribonuclease A（RNase
A）、RT‐PCR 试剂盒 PrimeScript™ RT‐PCR Kit 购
自 TaKaRa 公司；引物合成由上海捷瑞生物工
程有限公司完成；测序由华大基因科技有限公
司完成；常规试剂均为国产分析纯。
1.3 猴头菌原生质体的制备与再生
1.3.1 培养基：固体培养基（PDSA）：新鲜马铃
薯 200g，葡萄糖 20g，磷酸二氢钾 3g，七水合
硫酸镁 1.5g，20g琼脂，蒸馏水定容至 1 000mL；
液体培养基（PDSB）：PDSA 培养基中不加琼脂；
MYG 再生培养基：麦芽糖 10g，葡萄糖 4g，酵
母粉 4g，用 0.6mol/mL 甘露醇定容至 1 000mL；
MYG 半固体再生培养基：MYG 液体培养基中加
0.8%的琼脂；MYG 固体培养基：MYG 液体培养
基中加 1.5%的琼脂。
1.3.2 猴头菌原生质体的制备与再生：取固体
培养基 PDSA 上前端生长旺盛的菌丝转接到
50mL 的 PDSB 液体培养基中，25℃静置培养
5d，用 0.6mol/L 的 KCl 洗 3 次（4 000r/min 离
心 10min）。按每 300mg 湿菌丝加 1mL 酶液（以
0.6mol/L 的 KCl 配制），30℃水浴酶解 3h。用
灭过菌的 6 层擦镜纸过滤，滤液于 3 000r/min
离心 10min，弃上清收集沉淀，用 0.6mol/L 的
KCl洗涤两次，并适量稀释后用血球计数板计数。
1.3.3 猴头菌原生质体的再生：直接将原生质
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体悬液涂布在含 1.5%琼脂的 MYG 再生培养基
固体平皿中，25℃培养 3–5d。
1.4 不同因素对猴头菌原生质体制备的影响
1.4.1 不同裂解酶对原生质体制备的影响：在
其他条件相同的情况下，用 KCl 配制不同浓度
的 Cellulase、Snailase、Lysing enzyme 单酶及组
合酶酶解猴头菌菌丝体，以确定最佳的酶解液
及其浓度。
1.4.2 酶解时间对原生质体制备的影响：在其他
条件相同的情况下，分别采用 1h、2h、3h、4h、
5h 酶解时间，制备原生质体，以分析酶解时间
对原生质体得率的影响。此实验平行进行 3 次。
1.4.3 菌龄对原生质体制备的影响：在其他条件
相同的情况下，分别采用 3d、5d、7d、9d 菌龄
的猴头菌菌丝体来制备原生质体，以分析菌龄
对原生质体释放的影响。此试验平行进行 3 次。
1.5 猴头菌菌丝体以及原生质体对潮霉素的敏
感性测试
1.5.1 猴头菌菌丝体对潮霉素的敏感性测试：
配制含有 0、50、60、70、80μg/mL 潮霉素的
PDSA 平板，接种猴头菌种，置于 25℃恒温培
养，7d 后观察结果，测量菌落直径，选择完全
抑制供试菌生长的最低潮霉素浓度。
1.5.2 猴头菌原生质体对潮霉素的敏感性测试：
将 制 备 好 的 原 生 质 体 用 稳 渗 剂 稀 释 到
105–106个/mL 左右。取上述原生质体 0.1mL 直
接涂布于含不同终浓度潮霉素（0、50、60μg/mL）
的MYG再生培养基平板上。平板置 25℃恒温培
养，20d 后观察结果，测量菌落直径，选择完
全抑制供试菌原生质体再生的最低潮霉素浓度。
1.6 猴头菌的遗传转化
参照李刚等（2004）和徐飞（2007）转化
灵芝的方法，并加以改良：将制备好的新鲜原
生质体（107个/mL）悬浮于 160μL MTC 缓冲液
（ 0.6mmol/L 甘露醇， 10mmol/L Tris‐HCl，
50mmol/L CaCl2，pH 8.0），加入 5μg 载体质粒
pBgGI‐hph，10μL 20mmol/L 金精三羧酸，5μL
50mmol/L 亚精胺，100μg肝素钠盐，15μL PEG
buffer （ 30% PEG4000 ， 50mmol/L CaCl2 ，
10mmol/L Tris‐HCl，pH 7.5）相混合，冰浴 30min；
加入 0.5mL的 PEG buffer，在室温下放置 20min。
而后加入 750μL的MTC buffer；4℃，4 000r/min，
10min。收集原生质体，重悬于 500μL 的MTC；
4℃，4 000r/min，10min。收集原生质体，重悬
于 lmL 的MYG液体再生培养基。25℃，100r/min
培养 1–3d后涂布于含 60μg/mL Hyb的MYG再
生平板。25℃培养，挑取单菌落在含 60μg/mL
Hyb的 PDSA培养基上进行筛选。
1.7 猴头菌转化子的筛选
猴头菌原生质体转化后在筛选培养基上
长出的菌落为初筛到的拟转化子，为了减少假
阳性菌落，分别从初筛平板上挑取单菌落转接
于含 70μg/mL 潮霉素的 PDSA 平板上继续筛选
转化子，能在该平板上继续生长的转化子视为
拟定转化子，进一步做鉴定。
1.8 猴头菌转化子的鉴定
1.8.1 PCR 鉴定：挑取在含 60μg/mL 潮霉素的
PDSA 平板上生长的拟转化子单菌落和对照菌
株（未转化的猴头菌原种）进行摇瓶培养并收
集菌丝，猴头菌基因组 DNA 提取方法参照刘世
强等（2004）报道的方法进行。PCR 引物根据
hph 基因的核苷酸序列设计，即上游引物
hph1：5′‐AAAAGTTCGACAGCGTCTCC‐3′；下游引
物 hph2：5′‐GAAATTGCCGTCAACCAAG‐3′。由上
海捷瑞生物工程有限公司合成，扩增的片段大
小约为 800bp。反应条件：94℃预变性 5min，
94℃变性 45s，56℃退火 45s，72℃延伸 70s，
33 个循环，72℃延伸 10min。
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1.8.2 Southern blotting 检测：分别取猴头菌转
化子和对照的基因组 DNA 20µg 用 EcoRⅠ酶
切，37℃温浴过夜，12ng 质粒 DNA 用 EcoRⅠ
酶切作为阳性对照。酶切后的 DNA 在 0.8%的
琼脂糖凝胶上进行电泳分离。DNA 印迹转膜、
洗涤、预杂交和杂交、洗膜、显影以及探针标
记等参照 Dig 试剂盒说明书进行。
2 结果与分析
2.1 不同因素对猴头菌原生质体制备的影响
2.1.1 不同裂解酶对原生质体制备的影响：本
文分别以 1.5%蜗牛酶、1.5%纤维素酶、1.0%纤
维素酶、1.0%溶壁酶、1.0%纤维素酶+0.5%蜗
牛酶、1.0%溶壁酶+1.0%纤维素酶、1.0%溶壁
酶+1.0%纤维素酶+ 1.0%蜗牛酶，酶解猴头菌菌
丝体。不同的裂解酶及其浓度对原生质体的形
成和释放影响很大（表 1）。混合酶对猴头菌菌
丝体细胞壁的酶解效果比单一酶好，这与猴头
菌菌丝体细胞壁成分及不同酶之间作用的互
补有关，得到原生质体效率最高的组合为 1%
溶壁酶+1%纤维素酶+1%蜗牛酶。因此，本论
文选用 1%溶壁酶+1%纤维素酶+1%蜗牛酶的混
合酶液作为实验用酶液。
2.1.2 酶解时间对原生质体制备的影响：酶解
时间也是影响原生质体释放的重要因素。当新
形成的原生质体被释放到酶液中时，稳渗剂和
裂解酶会对其同时产生保护和伤害作用，所以
原生质体在酶液中的时间不宜过长，否则会影
响原生质体产量和再生率。在相同的酶系下，
不同酶解时间内所产生的原生质体量见图 1A，
原生质体数随时间的增加而增大，在 3h 时达
到最大值；酶解时间超过 3h，原生质体数下降，
继续延长酶解时间，原生质体数目逐渐降低。
因此，不能将原生质体与酶液长时间接触，酶
解完毕后应及时处理。
表 1 不同酶对猴头菌原生质体制备得率的影响
Table 1 Effect of different enzymes on the protoplast
yield of Hericium erinaceus
酶
Enzymes
原 生 质 体
制备得率
Yield of
Protoplasts
(106个/mL)
1.5%蜗牛酶 1.5% snailase 1.8
1.5%纤维素酶 1.5% cellulase 2.5
1.0%纤维素酶 1.0% cellulase 1.0
1.0%溶壁酶 1.0% lywallzyme 2.8
1.0%纤维素酶+0.5%蜗牛酶
1.0% cellulase+0.5% snailase
2.0
1.0%溶壁酶+1.0%纤维素酶
1.0% lywallzyme+1.0% cellulase
1.9
1.0%溶壁酶+1.0%纤维素酶+1.0%蜗牛酶
1.0% lywallzyme+1.0% cellulase+1.0%
snailase
3.0
2.1.3 菌龄对原生质体制备的影响：菌龄对原
生质体释放的影响很明显，幼龄菌丝由于本身
细胞处在生长期，细胞壁相对较薄，容易被酶
解，但是可能由于细胞膜不完善，使原生质体
不稳定，易破裂；而老龄菌丝因细胞老化也难
以酶解。在一定时间内，随着菌龄的增加，得
到的原生质体数也增加，在 5d 时达到最大值
3.0×106 个/mL，以后又有所下降（图 1B），所
以采用适宜菌龄的菌丝体可以获得更高数量
的原生质体。
2.2 猴头菌菌丝以及原生质体对潮霉素的敏感
性测试
猴头菌在含 60μg/mL 潮霉素的 PDSA 平板
上菌丝生长受到抑制；在含 60μg/mL 潮霉素的
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再生培养基上，原生质体生长受到抑制（表 2）。
故确定潮霉素对猴头菌菌丝及其原生质体的
抑制浓度均为 60μg/mL，因此本研究采用
60μg/mL潮霉素浓度作为猴头菌转化实验的筛
选浓度。
2.3 猴头菌拟转化子的筛选
pBgGI‐hph 转化猴头菌原生质体后涂布
于含 60μg/mL 潮霉素的 MYG 再生平板上，于
25℃培养箱中培养 14d 后长出再生菌落（图
2A）。把再生菌落挑到含 60μg/mL HmB 的
PDSA 平板上，以猴头菌原种作为对照（图 2B
箭头所示）。以潮霉素作为抗性筛选标记，未
转化的原生质体由于没有潮霉素抗性基因，
在 60μg/mL 的潮霉素抑制下不能再生，而转
化子由于携带了潮霉素抗性基因，获得潮霉
素抗性，在 60μg/mL 的潮霉素抑制下依然能
生长。拟转化子在含 60μg/mL 潮霉素的培养
基上生长良好（图 2B）。
2.4 转化子的 PCR 鉴定
将在筛选培养基上长出的拟转化子转接
至 PDSA 培养基上进行扩大培养，分别提取基
因组 DNA。以拟转化子基因组 DNA 为模板，
图 1 酶解时间以及菌龄对原生质体制备的影响 A：酶解时间对原生质体制备的影响；B：菌龄对原生质体制备的影响
Fig. 1 Effect of enzymolysis duration and hyphal age on protoplast yield. A: Effect of enzymolysis duration on protoplast
yield; B: Effect of hyphal age on protoplast yield.
表 2 猴头菌菌丝及其原生质体对潮霉素的敏感性测定
Table 2 The test of sensitivity of the hypha and protoplast of Hericium erinaceus to the HmB
潮霉素浓度 The concentrations of hygromycin B (μg/mL）
0 50 60
菌丝体生长情况
The phenotype of hypha
正常生长
Regular growing
生长极慢
Very slow growing
完全抑制
Complete inhibition
原生质体生长情况
The phenotype of protoplast
再生菌落较多
Lots of regenerative colonies
再生菌落极少
Few regenerative colonies
无再生菌落
No regenerative colonies
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图 2 抗性平板上猴头菌拟转化子的生长情况 A：拟转化子在 MYG 培养基上的再生情况；B：拟转化子在固体选择
培养基上的筛选情况；C：转化实验的对照.
Fig. 2 The phenotype of transformants on plate with HmB. A: The phenotype of transformants on the MYG plate; B:
Screening of transformants on the solid selective medium; C: Control of the transformation.
以合成的引物 hph1 和 hph2 进行 PCR 扩增，设
阳性（带有 hph 基因的质粒）和阴性对照（未
转化的猴头菌）。PCR 结果显示共有 5 个拟转化
子可扩增出一条大小约为 800bp 的条带（图
略），分别是 2 号、3 号、9 号、10 号、11 号，
与阳性对照的 PCR 电泳条带大小相符，而阴性
对照无电泳条带，说明拟转化子 PCR 扩增的条
带为实验所得而非环境等偶然因素引起，因此
初步判定 hph基因已经成功重组进入转化子的
基因组中。
2.5 Southern 杂交鉴定转化子
提取继代培养多代的 2 号、3 号、9 号、
10 号 4 株猴头菌转化子和猴头菌原种的基因
组 DNA，进行地高辛标记的 hph 基因探针
Southern 杂交分析（图 3）。Southern 杂交结果
显示，4 个转化子都出现了杂交信号，说明潮
霉素抗性基因成功整合到猴头菌的基因组中；
阴性对照未出现杂交信号，说明猴头菌原种基
因组 DNA 中没有与探针同源的片段，可以有效
避免在转化子中潮霉素抗性基因拷贝数计算
的误差；4 个转化子的杂交信号强弱不同，条
带也不同，说明外源基因是随机插入到猴头菌
基因组上的，插入位点不同，拷贝数也不同。
图 3 猴头菌转化子的 Southern 杂交鉴定图 M3：DNA
markerⅢ；2，3，9，10：猴头菌拟转化子；hph：质
粒 pBgGI‐hph；H：猴头菌原种.
Fig. 3 Southern blotting analysis of transformants of
Hericium erinaceus. M3: DNA markerⅢ; 2, 3, 9, 10: The
four putative transformants of Hericium erinaceus; hph:
PlasmidpBgGI‐hph containing hph gene; H:
Non‐transformed Hericium erinaceus.
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3 讨论
原生质体的制备过程中，有效地去除细胞
壁，使原生质体游离出至关重要。一般说来，
真菌细胞壁含有 80%–90%的均聚糖和杂多糖，
其余为蛋白质，朊多聚糖混合物及少量类脂化
合物。非溶性多聚糖微纤维及壳质构成细胞壁
骨架，而配糖朊则填充于其空隙间，具有胶合
作用。担子菌纲细胞壁的主要成分是几丁质和
葡聚糖，S‐葡聚糖多位于细胞壁的外层，是一
种 β‐1,3 配糖键连接的直链多聚糖，易于被碱
性抽提液脱去（杨洁彬和李淑高 2000）。不同
种或者同一种不同分布区域菌体的细胞壁结
构存在差异，用酶法破壁制取原生质体，需要
不同的酶系统，而且，酶的质量、纯度对原生
质体的形成也有着非常大的影响。现已有多种
破除真菌细胞壁的酶类，一般用混合酶类比单
一酶效果好，原因在于不同酶之间存在作用的
互补（胡伟等 2004）。本研究的结果也表明了
采用多种酶混合可以获得较好的效果。另外，
猴头菌菌丝体的菌龄及酶解时间对原生质体
的得率和再生有直接的影响，菌龄过长，由于
细胞壁上沉积了色素等物质，阻碍了酶与细胞
壁的作用，细胞壁的解离效率降低，原生质体
的得率就低（董宏平等 2001）；酶解时间过长
又会使得酶与原生质体膜过分接触，使得原生
质体的再生能力下降，影响再生率。
以潮霉素作抗性筛选标记，需要探索菌丝
在不同潮霉素浓度下的耐受能力，确定潮霉素
使用的有效抑制浓度，或致死浓度。但是利用
潮霉素抗性作为选择标记筛选转化子时，通常
假转化子背景高（Irie et al. 2001；郭丽琼等
2005），为了克服筛选假阳性，本实验把
60μg/mL HmB 的 MYG 再生平板上长出的菌落
挑到含 60μg/mL HmB的 PDSA平板上进行复筛
2–3 次，获得预期效果。同时，我们将转化子
进行继代培养 5 代后，转接在含 60μg/mL HmB
的抗性平板上进行潮霉素基因的稳定性试验，
结果显示在含 60μg/mL HmB 的抗性平板上，
转化子均生长良好，这表明了转化子的潮霉素
抗性比较稳定；本实验中用于 Southern 杂交的
基因组 DNA 提取自多次继代培养的猴头菌转
化子，Southern 杂交结果都出现了杂交信号，
这进一步说明了潮霉素基因已稳定整合在猴
头菌的基因组中，在继代培养中能稳定遗传。
目 前 已 经 从 猴 头 菌 中 分 离 出
cyatha‐3,12‐diene，它是生物合成 Cyathane 骨
架类型的二萜类化合物的中间物（Kawagishi et
al. 2006；Kenmoku et al. 2002），许多二萜的含
氧衍生物具有多方面的生物活性，如紫杉醇、
穿心莲内酯、甜菊苷等都具有较强的生物活
性。本研究建立的猴头菌遗传转化系统可以为
下一步在猴头菌进行萜类物质的异源表达提
供理论基础和技术借鉴。
[REFERENCES]
Dong HP, Yuan S, Xu XS, Xin DK, 2001. Protoplast
preparation from Diasporangium sp. Mycosystema,
20(4): 561‐565 (in Chinese)
Guo LQ, Lin JF, Xiong S, Chen SC, 2005. Transformation
of Volvariella volvacea with a thermal hysteresis
protein gene by particle bombardment. Acta
Microbiologica Sinica, 45: 39‐43 (in Chinese)
Hu W, Kong FX, Sang WL, 2001. Isolation and
regenetation of protoplast from ecotomycorrhizal
fungus Cortinarius russus. Mycosystema, 20(4):
561‐565 (in Chinese)
Irie T, Honda Y, Hirano T, Sato T, Enei H, Watanabe T,
Kuwahara M, 2001. Stable transformation of
Pleurotus ostreatus to hygromycin B resistance
ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q Mycosystema January 15, 2014 Vol. 33 No. 1
http://journals.im.ac.cn/jwxtcn
128
using Lentinus edodes GPD expression signals.
Applied Microbiology and Biotechnology, 56:
707‐709
Kawagishi H, Masui A, Tokuyama S, Nakanura T, 2006.
Erinacines J and K from the mycelia of Hericium
erinaceum. Tetrahedron, 62: 8463‐8466
Kenmoku H, Shimai T, Toyomasu T, Kato N, Sassa T, 2002.
Erinaeine Q a new erinaeine from Hericium
erinaceum and its biosynthetic route to erinaeine C
in the Basidiomycete. Bioscience, Biotechnology,
and Biochemistry, 66(3): 571‐575
Li G, Wang Q, Liu QY, Li BJ, 2004. Establishment of a
transformantion system of Ganoderma lucidum
using PEG method. Mycosystema, 23(2): 255‐261 (in
Chinese)
Li YH, Li L, Pang YN, 2006. Study on the separating
condition of protoplast in Hericium erinaceus.
Journal of Microbiology, 26(3): 28‐30 (in Chinese)
Liu SQ, Yang LQ, Guo LQ, Lin JF, 2004. Cloning and
sequence analysis of ras promoter region from
Volvariella volvacea. Acta Edulis Fungi, 11(1): 1‐6 (in
Chinese)
Ma XD, Zhou FZ, Wu HH, 1995. The research of mycelial
protoplasts from Hericium erinaceus. Henan Science,
13(1): 65‐68 (in Chinese)
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, 1992. Molecular
Cloning. 2nd edition. Jin DY, Li MF (Translate).
Science Press, Beijing. 49‐56 (in Chinese)
Xu F, 2007. Cloning and sequence analysis of a
glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase gene
from Ganoderma lucidum and establishment of a
genetic transformation system for Ganoderma
lucidum. Master Thesis, Nanjing Agricultural
University. 46 (in Chinese)
Yang JB, Li SG, 2000. Food microbiology. 2nd edition.
China Agriculture Press, Beijing. 97 (in Chinese)
Zhang P, Bau TL, Bao HY, 2011. Summarization of
researches on chemical composition and
pharmacological activity of Hericium species.
Journal of Fungal Research, 3(9): 54‐62 (in Chinese)
[附中文参考文献]
董宏平，袁生，徐旭士，辛定坤，2001. 轮梗霉原生
质体的制备. 菌物系统，20(4): 561‐565
郭丽琼，林俊芳，熊盛，陈守才，2005. 抗冷冻蛋白
基因遗传转化草菇的研究. 微生物学报，45: 39‐43
胡伟，孔繁翔，桑伟莲，2001. 菌根真菌——赭丝膜伞
原生质体分离与再生研究 . 菌物系统， 20(4):
561‐565
李刚，王强，刘秋云，李宝健，2004. 利用 PEG 法建
立药用真菌灵芝的转化系统 . 菌物学报，23(2):
255‐261
李艳红，李莉，潘延宁，2006. 猴头菌原生质体分离
条件研究. 微生物学杂志，26(3): 28‐30
刘世强，杨丽卿，郭丽琼，林俊芳，2004. 草菇 ras
启动子区域的克隆及其序列分析. 食用菌学报，
11(1): 1‐6
马向东，周伏忠，吴浩洁，1995. 猴头菌原生质体制
备条件的研究. 河南科学，13(1): 65‐68
萨姆布鲁克 J，弗里奇 EF，曼尼阿蒂斯 T，1992. 分
子克隆实验指南. 第 2 版. 金冬雁，黎孟枫（译）.
北京：科学出版社. 49‐56
徐飞，2007. 灵芝三磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及
转化体系的构建 . 南京农业大学硕士学位论文 .
46
杨洁彬，李淑高，2000. 食品微生物学. 第 2 版. 北京：
北京农业大学出版社. 97
张鹏，图力古尔，包海鹰，2011. 猴头菌属真菌化学
成分及药理活性研究概述. 菌物研究，3(9): 54‐62