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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第10期
美拉德反应［1］是一种普遍存在于自然界中的非
酶促反应，还原性糖（如葡萄糖）的羰基可和蛋白
氨基酸上的 α-或ε-氨基基团反应，缩合成不稳定的
席夫碱，经重排后形成稳定的 Amadori 化合物，为
与酶促糖基化反应区别，将这一系列非酶促反应称
为糖化反应［2，3］。在糖尿病人体内，由于血糖升高
加剧了血液中蛋白质的糖化反应。血液中的糖化血
红蛋白反映了一段时期内生物体内血糖水平，近年
来被用作糖尿病诊断和治疗的重要指标［4，5］。目前，
糖化血红蛋白可采用高效液相色谱法、微柱法、免
疫法等来测定，但上述方法大多价格昂贵，或检测
时间长、测量精度差 ；最近流行的酶法检测，利用
氧化还原反应，操作简便易行，精度高，时间短，
广泛应用于生化分析和临床检查。
利用上述氧化还原反应的糖化血红蛋白测定过
收稿日期 ： 2013-04-19
作者简介 ：徐影，女，硕士研究生，研究方向 ：分子生物学 ；E-mail ：dyzxuying@126.com
通讯作者 ：于源华，女，教授，博士生导师，研究方向 ：生物化学、分子生物学 ；E-mail ：yuyuanhua8888@126.com
果糖缬氨酸氧化酶在 sf9 细胞中的表达
徐影  赵雪  于源华
（长春理工大学生命科学技术学院，长春 130022）
摘 要 ： 利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞 sf9 中表达果糖缬氨酸氧化酶基因（FVO）。人工合成 FVO 基因，与载体
pFastBac1 连接，转化至大肠杆菌 DH10Bac 感受态细胞，进行同源重组。经筛选得到重组杆状病毒载体 Bacmid-pFastBac1-FVO，
PCR 鉴定得到单一条带 ；用该重组载体转染 sf9 细胞，收获毒种并进行表达 ；对表达产物进行 SDS-PAGE、Western blot 检测。成功
构建了 FVO 的杆状病毒表达载体，并在 sf9 细胞中得到了表达，Western blot 检测出现 1 条约 40 kD 的带。
关键词 ： 果糖缬氨酸氧化酶 杆状病毒表达系统 同源重组 sf9 细胞 真核表达
Expression of Fructose Valine Oxidase in Sf9 Cells
Xu Ying Zhao Xue Yu Yuanhua
（College of Life Sciences，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）
Abstract:  It was to express the Fructose Valine Oxidase Gene with baculovirus expression system. FVO gene was artificially synthesized,
and ligated to the vector pFastBac1 to obtain the recombinant vector, which was then transformed into E.coli DH10Bac competent cells to
transposase with bacmid. After screening, the recombinant baculovirus Bacmid-pFastBac1-FVO was got, which appeared a single band after PCR
identification. sf9 cells was transfected with the recombinant vector, and harvested the virus and expressed the protein. Results showed that the
baculovirus expression vector was successfully constructed and expressed in the sf9 cells which appeared a 40 kD band with Western blot.
Key words:  Fructose Valine oxidase Baculovirus expressive system Homologous recombination Sf9 cell Eukaryotic expression
程中，需要一类特殊的酶——果糖缬氨酸氧化酶，
该酶可作用于糖化血红蛋白或糖化氨基酸，产生过
氧化氢，添加过氧化物酶和还原剂，使过氧化氢和
还原剂之间发生氧化还原反应，可通过测定还原剂
的显色来测定过氧化氢的量，从而可知样品中糖化
血红蛋白含量。
果糖缬氨酸氧化酶基因来源于菌株 Corynebact-
erium sp. 2-4-1，它由 1 119 个核苷酸组成，编码了
含有 372 个氨基酸、分子量为 39.044 kD 的蛋白质［2］。
国内大多采用原核表达，其表达效果不够理
想［6］。本试验将果糖缬氨酸氧化酶基因连接到昆虫
表达载体上，构建出同源重组杆状病毒表达载体，
然后在昆虫细胞 sf9 中表达，并进行蛋白表达的鉴
定，为果糖缬氨酸氧化酶在真核表达的研究奠定
基础。
2013年第10期 161徐影等 ：果糖缬氨酸氧化酶在 sf9 细胞中的表达
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒和菌株 转座载体质粒 pFastBac1、E.coli
DH10Bac 由长春生物制品研究所细胞因子室刘景会
主任惠赠 ；目的基因 FVO（JM109-pMD19-T Simple-
FVO）由 TaKaRa 大连宝生物工程公司合成 ；E.coli
DH5α 由本实验室保存。
1.1.2 昆虫细胞株 昆虫细胞草地夜蛾（Spodoptera
frugierda）卵巢组织细胞 Sf9［7］，由长春生物制品研
究所细胞因子室刘景会主任惠赠。
1.1.3 试剂 限制性内切酶 BamH Ⅰ、Sal Ⅰ购自
TOYOBO 东洋纺（上海）生物科技有限公司 ；Gra-
ce’s Insect Medium 培 养 基、Sf-900 Ⅱ SFM 无 血 清
培养基、转染试剂 Cell Fectin、Bac PAK qPCR Titra-
tion Kit、Bac PAK Baculovirus Rapid Titer Kit、Chro-
mogenic Western Blot Immunodetection Kit 购 自 Invitr-
ogen 公司；T4 DNA 连接酶、Taq DNA polymerase、质
粒小量提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒、PCR 产
物 回 收 试 剂 盒、DNA Markers（DL2000、DL10000、
DL15000、λ-Hind Ⅲ digest）、M13 通 用 引 物 购 自
TaKaRa 大连宝生物工程有限公司。
1.1.4 仪 器 NBS Innova 4300 恒 温 摇 床 ；Little
Genius TC-25/H PCR 仪 ；Sagecreation 北 京 赛 智 创
业科技有限公司凝胶成像系统 ；上海一恒科学仪
器有限公司电热恒温培养箱 ；ZHWY-103D 恒温培
养振荡器 ；WD-9405B 型水平摇床 ；SDC-6 节能型
智能恒温槽 ；TG16-W 微量高速离心机 ；DNA 电泳
仪 ：Bio-Rad Power Pac 300 ；蛋 白 电 泳 仪 ：DYY-12
型电源 ；雷磁 PHS-3C 立式压力蒸汽灭菌器 ；PALL
CASCADE 通用纯水机 ；QL-861 涡旋振荡器 ；苏净
安泰 SW-CJ-2F 洁净工作台 ；XB-40 雪花制冰机 ；芬
兰 Finnplpette 移液枪。
1.2 方法
1.2.1 目的基因获得 在 NCBI 的 GenBank 中查得
来源于菌株 Corynebacterium sp.2-4-1 中编码果糖缬氨
酸氧化酶的基因序列（登录号为 AB073548.1），加
入 酶 切 位 点 BamH Ⅰ、Sal Ⅰ 后 序 列 长 度 为 1 131
bp，由 TaKaRa 大连宝生物工程公司合成该序列至
pMD19-T Simple 载体中。
1.2.2 重组的质粒构建及鉴定 将 pFastBac1 质粒和
pMD19-T Simple-FVO 分别用 BamH Ⅰ和 Sal Ⅰ进行
双酶切，琼脂糖凝胶电泳切胶回收载体和目的片段，
通过 T4 DNA 连接酶在 16℃下，过夜进行连接 ；连
接产物转化至 E.coli DH5α 感受态细胞，提取质粒双
酶切鉴定，获得正确插入的载体 pFasBac1-FVO ；将
该载体转化 E.coli DH10Bac 感受态细胞，经过庆大
霉素、卡那霉素、四环素及蓝白斑筛选得到重组阳
性克隆。挑取较大白斑进行菌落 PCR 鉴定，进一步
划线分离单菌落，再次菌落 PCR 鉴定直至无杂带。
提取重组杆粒，PCR 鉴定。
1.2.3 重组质粒 PCR 产物序列分析 将上述重组质
粒的 PCR 鉴定产物（未纯化）送往 TaKaRa 大连宝
生物工程公司测序。
1.2.4 重组杆状病毒载体转染 sf9 细胞 sf9 细胞
培养条件［8，9］：使用无血清培养基 Sf-900 Ⅱ SFM，
27℃，无需 CO2，进行半贴壁培养，4-5 d 传代一次。
利用脂质体法［10］对 Sf9 细胞进行转染，27℃连续培
养 72 h 左右观察 sf9 细胞是否出现系列病毒感染现
象。在转染试剂介导下，重组杆粒转入 sf9 昆虫细胞，
组装成完整的病毒颗粒，收获 P1 代重组病毒。
1.2.5 果糖缬氨酸氧化酶的表达与鉴定 继续感染
sf9 细胞，扩增重组病毒 ：取 MOI=0.3，用所得病毒
液反复感染对数生长期的 sf9 细胞，27℃培养 96 h，
以提高病毒滴度；利用磁珠法［11，12］提取病毒基因组
进行 PCR 鉴定并利用快速滴定试剂盒测定滴度。收
获细胞 ：单独收获上清，14 000 r/min 离心 5 min，取
900 μL 上述上清，加入 100 μL 100% 三氯乙酸［13， 14］，
充分混匀，-20℃冰育 10 min，14 000 r/min 离心 15
min，去上清，加入 200 μL 丙酮洗涤两次（每次混
匀后 14 000 r/min 离心 5 min），加入 60 μL pH8.0 10
mmol/L TE 溶解，最后加入 20 μL 蛋白电泳载样液混
匀，沸水煮 5 min ；加入 1 mL 培养基用细胞刮刀将
细胞沉淀刮下吸出，取 500 μL 沉淀 3 000 r/min 离心
5 min，去上清，加入 100 μL 还原型蛋白电泳载样液，
混匀，沸水煮 5 min。将以上各蛋白样品进行 SDS-
PAGE、Western blot 检测。
2 结果
2.1 质粒提取、双酶切及回收
用 软 件 Vector NTI 11.5 对 合 成 序 列 FVO 与 原
始序列进行比对，结果完全一致。用试剂盒提取
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期162
pMD19-T Simple-FVO 及 pFastBac1 质粒。
质粒 pMD19-T Simple-FVO 经 BamH Ⅰ及 Sal Ⅰ
双酶切，得到 1 119 bp 目的片段 FVO ；pFastBac1 同
样经过上述双酶切，电泳结果见图 1，位置正确。
用胶回收试剂盒对双酶切产物进行回收，回收效率
较高。将上述酶切回收产物进行连接、转化大肠杆
菌 E.coli DH5α 感受态细胞，挑单菌落，用试剂盒提
取质粒，对该质粒进行双酶切鉴定，结果正确。
部分细胞裂解现象，细胞膜消失（图 3，图 4）；以
上证明重组杆粒成功转染 sf9，并获得重组杆状病毒。
2000
bp bp
1 2 3 4M1 M2
10000
7500
5000
1000
250
15000
1000
750
500
250
100
1 ：pFastBac1 质粒 ；2 ：经 BamH Ⅰ及 Sal Ⅰ双酶切的 pFastBac1 质粒 ；M1 ：
DNA marker DL2000 ；M2 ：DNA marker DL15000 ；3 ：经 BamH Ⅰ及 Sal Ⅰ双
酶切的 pMD19-T Simple-FVO 质粒 ；4 ：pMD19-T Simple-FVO 质粒
图 1 质粒 pMD19-T Simple-FVO 及 pFastBac1 双酶切
2.2 重组杆粒菌落PCR鉴定
将 pFastBac1-FVO 转 化 E.coli DH10Bac 中 同 源
重组，挑取较大白斑作为模板，用 M13 引物进行菌
落 PCR，并对产物进行电泳，预期大小应约 3 431
bp。菌落 PCR 结果正确。
2.3 重组杆粒提取及PCR鉴定
通过碱裂解法，手提重组杆粒。进行 0.6% 琼
脂糖凝胶电泳，恒压 24 V，5 h 45 min，电泳结果如
图 2 所示，条带位置正确。
以重组杆粒为模板，用 M13 引物进行 PCR，并
对 PCR 产 物 进 行 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳， 预 期 大 小 为
3 431 bp。PCR 电泳结果位置正确。将上述未纯化
PCR 产物进行测序，结果无突变。
2.4 收获重组杆状病毒及病毒因组PCR鉴定
用重组杆粒转染 sf9 细胞，27℃避光培养，随
时观察细胞状态 ：转染后 24 h，细胞体积逐渐增大，
变圆 ；转染后 48 h，细胞明显停止生长，细胞核明
显增大 ；转染后 72 h，细胞内出现较多颗粒状物质，
部分细胞开始从培养板上脱落 ；转染后 96 h，出现
23130
bp
1 2M
9416
6557
4391
M ：TaKaRaλ-Hind Ⅲ digest DNA Marker ；1，2 ：重组杆粒 Bacmid-
pFastBac1-FVO
图 2 重组杆粒 Bacmid-pFastBac1-FVO
图 3 正常 sf9 细胞（×40）
图 4 转染杆粒后 sf9 细胞（×40）
用收获的 P1 代病毒扩增 P2 代，提高病毒滴度，
用磁珠法提取其基因组作为模板，用 M13 引物进行
PCR 鉴定，以验证转染成功，病毒完整组装。结果
如图 5 所示，条带位置正确。
2.5 快速测定病毒滴度
采用快速滴定病毒滴度试剂盒，对 P2 代、P3
2013年第10期 163徐影等 ：果糖缬氨酸氧化酶在 sf9 细胞中的表达
子 Tn7 的靶位点（mini-attTn7）以及编码 β-半乳糖
苷 酶 α 肽 的 部 分 DNA 片 段［15］。Bacmid 既 能 像 质
粒一样在 E. coli 中复制，又能像病毒一样感染昆虫
细胞，供体质粒 pFastBac 含有庆大霉素抗性基因
（Gen+）及 Tn7 的左右两臂序列，两臂序列之间是多
角体蛋白的启动子，下游依次是多克隆位点、SV40
的 PolyA 位点［16］。
Bac-to-Bac 昆虫杆状病毒表达系统安全性好，
表达水平高，可进行翻译后加工及表达产物的异源
性小，是一种非常理想的真核表达系统。该系统独
特的性质，使其被广泛地应用于基因工程、药物开发、
疫苗生产、表达免疫活性分子和某些致瘤病毒蛋白
以及基因表达调控研究等多个领域中。
近年来，越来越多的研究表明，糖化蛋白的积
累与衰老及一些疾病的发生相关，如动脉粥样硬化、
糖尿病、关节炎及神经衰弱等。因此，对糖化蛋白
的含量检测具有重要意义。而果糖氨基酸氧化酶目
前主要应用于对血液中糖化蛋白含量的检测，被称
为糖尿病检测的金标准［1］。
本研究首先通过人工合成的方式，获得了果糖
缬氨酸氧化酶基因 ；将其与载体 pFastBac1 连接，转
化到大肠杆菌 DH10Bac 进行同源重组，经过一系列
筛选及鉴定，成功构建了含有糖缬氨酸氧化酶基因
的杆状病毒表达载体 ；用其转染昆虫细胞 sf9，进行
完整病毒的组装及重组蛋白的表达。对表达产物进
行 12% SDS-PAGE 检测，结果无法看到明显目的蛋
白条带，可能是由于真核表达系统的特殊性和局限
性，表达量有限，肉眼很难识别 ；而通过 Western
blot 检测，在 43 kD 处得到单一条带，可以确定重组
蛋白有表达。以上结果为进一步研究果糖缬氨酸氧
化酶的功能及作用机制及其在临床的广泛应用奠定
了基础。
针对限制果糖氨基酸氧化酶商业化的因素进行
研究，随着蛋白质工程的开展，人们会获得性质更
加优良的果糖氨基酸氧化酶，使其在临床检测中取
得更加广泛的应用。
4 结论
通过人工合成方式获得了果糖缬氨酸氧化酶基
因 ；并成功构建了含有糖缬氨酸氧化酶基因的杆状
10000
bp
M 1 2
7000
4000
2000
1000
300
250
M ：DNA marker DL10000 ；1 ：未加模板空白对照 ；2 ：重组杆粒 PCR 产物
图 5 P2 代病毒因组 PCR 鉴定
代病毒进行滴度测定，P2 代病毒滴度为 8×105 PFU/
mL，P3 代病毒滴度为 5.2×107 PFU/mL。
2.6 SDS-PAGE电泳分析及Western blot检测
为定量分析重组蛋白的表达，进行 SDS-PAGE
检测。用 P3 代病毒扩增 P4 代高滴度病毒，收获后
用其表达重组蛋白。从图中未能明显看出目的蛋白
条带。
为了进一步确定重组蛋白的表达，对样品进行
特异性的 Western blot 检测。将电泳的聚丙烯酰胺
凝胶转膜过夜，封闭，加入一抗（鼠抗 FVO 抗体）、
二抗（羊抗鼠 IgG-HRP）反应，显色。结果细胞沉
淀裂解液在 43 kD 位置出现了较清晰的单一条带，
而细胞上清液未出现条带。说明 FVO 基因能够在
sf9 细胞中表达，且表达产物主要存在于细胞内。
97.4
kDM1 32
66.2
43.0
31.0
1 ：正常 sf9 细胞裂解液 ；2 ：病毒感染的细胞培养上清 ；3 ：病毒感染的细
胞沉淀裂解液 ；M ：低分子量蛋白 Marker
图 6 FVO Western blot 分析
3 讨论
本 试 验 采 用 Bac-to-Bac 昆 虫 杆 状 病 毒 表 达 系
统对果糖缬氨酸氧化酶的生物学活性进行了研究。
Invitrogen 公 司 的 Bac-to-Bac 昆 虫 杆 状 病 毒 表 达 系
统为真核表达系统的一种，该系统的 Bacmid 包含
mini-F 复制子、卡那霉素抗性筛选标记、细菌转座
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期164
病毒表达载体 Bacmid-pFastBac1-FVO。用其转染昆
虫细胞 sf9，进行完整病毒的组装及重组蛋白的表达 ,
在 43 kD 处得到单一条带，确定重组蛋白成功表达。
参 考 文 献
［1］ 陈蓉 , 张琳 , 高静华 , 等 . 果糖氨基酸氧化酶的研究进展［J］.
医药前沿 , 2011, 01（17）：76-77.
［2］ Ryoichi S, Minoru H, Naoki K.Cloning and expression of fructosyl-
amino acid oxidase gene from Corynebacterium sp.2-4-1 in Escheri-
chia coli［J］. Biosci Bitechnol Biochem, 2002, 66（6）：1256-
1261.
［3］ Yoshida N, Sakai Y, Isogai A, et al. Primary structures of
fungal fructosyl amino acid oxidases and their application to the
measurement of glycated proteins［J］. Biochem, 1996, 242, （3）：
499-505.
［4］ Eckhardt BJ, Holzman RS, Kwan CK, et al. Glycated hemoglobin
A1c as screening for diabetes mellitus in HIV-Infected individuals.
AIDS Patient Care and STPS, 2012, 26（4）：197-201. doi ：
10.1089/apc. 2011.0379
［5］ Mostafa S, Davies M, Webb D, et al. The potential impact of using
glycated haemoglobin as the preferred diagnostic tool for detecting
Type 2 diabetes mellitus［J］. Diabetic Medicine, 2010, 27（7）：
762-769.
［6］ 孙柏欣 , 刘长远 , 陈彦 , 等 . 基因表达系统研究进展［J］. 现代
农业科技 , 2008, 25（2）：205-209.
［7］ 周亚竞 , 张志芳 , 张元兴 , 等 . 昆虫细胞培养研究进展［J］. 蚕
业科学 , 2000, 26 ：74-78.
［8］ 谢秋玲 , 郑云程 , 廖美德 . 昆虫细胞 sf9 在四种生物反应器中的
培养［J］. 暨南大学学报 , 2009, 30（1）：96-100.
［9］ 张寰 , 张永安 , 秦启联 , 等 . 昆虫细胞系的培养和建立技术［J］.
昆虫学报 , 2007, 50（8）：834-839.
［10］ 高岑 , 史书龙 , 张旭 , 等 . 脂质体介导法转染 mlMCD-3 细胞的
可行性及最佳转染条件［J］. 中国组织工程研究与临床康复 ,
2011, 15（15）：2739-2742.
［11］ 高秋月 , 景奉香 , 李海燕 , 等 . 基于磁珠的细菌基因组 DNA
快速提取方法［J］. 安徽农业科学 , 2010, 38（21）：11071-
11074.
［12］ 陆佳飞 , 周科隆 , 王缦 . 磁珠快速提取乙型肝炎病毒 DNA 方
法的建立及其应用研究［J］. 中华检验医学杂志 , 2012, 35（9）：
150-154.
［13］ 牛巍 , 侯彩云 , 祝晓芳 , 等 . 三氯乙酸沉淀法与硫酸铜沉淀
法在液态奶蛋白质检测中适用性研究［J］. 中国乳品工业 ,
2008, 36（9）：59-61.
［14］ 陈少迁 , 吴少雄 , 柳陈坚 , 等 . 三氯乙酸沉淀液态奶蛋白的最
佳实验条件研究［J］. 乳液科学与技术 , 2009, 22（6）：278-
281.
［15］ Edelman L, Maroaritte C, Cchaabihi H, et al. Obtaining a functional
recombinant anti-rhesus（D）antibody using the baculovirus-
insect cell expression system［J］. Immunology, 1997, 91（1）：
13-19.
［16］ 兰丽盼 , 吴小锋 . 昆虫杆状病毒研究和应用新进展［J］. 农业
生物技术学报 , 2008, 16（6）：1056-1060.
（责任编辑 李楠）