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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(11):121-124
点杂交是一种快速检测 DNA、RNA 和蛋白等生
物分子种类和含量的简便方法，广泛应用于分子生
物学、生物化学、免疫遗传学和医药、农业、食品
等领域［1-3］。在点杂交实验中，先将样品点到介质上，
收稿日期 ：2015-03-24
基金项目 ：中国农业科学院科技创新工程
作者简介 ：姜超，男，硕士研究生，研究方向 ：细胞生物学 ；E-mail ：1025160733@qq.com ；苏小琴为本文并列第一作者
通讯作者 ：潘映红，男，研究员，研究方向 ：蛋白质组学 ；E-mail ：panyinghong@caas.cn
一种点杂交膜预处理方法的建立及应用
姜超1，2  苏小琴2，3  张学文1  潘映红2
（1. 湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128 ；2. 中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良重大科学工程，
北京 100081 ；3. 云南农业大学普洱茶学院，昆明 650201）
摘 要 ： 旨在解决手工点样斑点杂交中样品点密度小、点样体积受限制和点样点不规整等问题，建立了一种新的点杂交膜
预处理方法。首先根据预设点样点的大小、排列方式和密度，制作柱状凸起模具 ；其次将模具固定于杂交膜上，使模具凸起部位
与膜紧密接触 ；再将熔化的石蜡涂布于膜上非模具接触部位，待石蜡凝固后移走模具，获得预处理杂交膜。以荧光染料 IRDye800
标记的抗体为样品进行直接点样检测，同时提取水稻、小麦和大豆的蛋白进行点杂交实验验证。结果显示，利用上述方法得到非
点样部位具有疏水性的预处理 NC 膜和 PVDF 膜，其点样点位置、形状和大小固定，点样密度高。不同体积荧光染料标记抗体直接
点样得到的荧光图像整齐规范，水稻、小麦和大豆蛋白与水稻看家蛋白抗体 Anti-HSP 杂交后均能检测到稳定信号。杂交膜经预处
理后可最大限度实现点样点位置、大小和形状的统一，并能显著提高上样体积和点样密度。
关键词 ： 杂交膜 ；点杂交 ；预处理 ；预处理膜
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.013
Pretreatment and Application of Membrane for Dot Hybridization
Jiang Chao1，2 Su Xiaoqin2，3 Zhang Xuewen1 Pan Yinghong2
（1. College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agriculture University，Changsha 410128 ；2. Institute of Crop Science，Chinese
Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081 ；3. College of Longrun Pu-erh tea，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201）
Abstract: In order to solve the problems of the low density, the volume limitation, and the irregular shape of sample point in dot
hybridization when samples were manually loaded, the hybridization membrane was pretreated with low melting paraffin waxes to fix sample
position, size and shape. Firstly, according to the designed size, arrangement and density of sample location on membrane, different columnar
salient moulds could be made. After placed a mould on membrane and tightly closed the columnar salient to the membrane, heated waxes was
covering on. When waxes become solidification, the mould was removed and pretreated hybridization membrane was obtained. Using pretreated
membrane, fluorescent dye IRDye800 labeled protein sample was directly loaded and detected. And finally, the protein samples of rice, wheat,
and soybean were extracted, and detected by dot hybridization assay using this membrane. Results showed that pretreated NC and PVDF
membrane with hydrophobic area outside of sample point could be obtained by using this method, and the densities, locations, shapes and sizes
of sample points could be designed in advance. All fluorescence images of sample points, onto which different volumes of an antibody tagged
with a fluorescent dye were loaded directly, showed similar dimensions. Proteins from leaves of rice, wheat and soybean were also detected with
Anti-HSP antibody and stable signals could be got. Our results show that when samples were manually loaded on the pretreated membrane, the
position, size and shape of sample points can be unified, and the volume and density of samples can significantly improved.
Key words: hybridization membrane ；dot hybridization ；pretreatment ；pretreated membrane
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11122
然后用特异性探针进行杂交，最终依据检测到的杂
交信号强弱判断样品中目标物的种类和含量。目前
高通量和自动化的基因和蛋白芯片技术已成为高效、
快速和大规模获取相关生物信息的重要手段［4］，但
芯片技术并不适合普通实验室使用，手工点杂交仍
然是最常使用的点杂交技术。手工点杂交常用的杂
交膜有 NC 膜、PVDF 膜和尼龙膜，这类膜在实际
使用时普遍存在点样点排列不整齐、上样体积受限
制、单位面积样品数量较少、样品在杂交膜上容易
扩散导致点样点的大小和形状不一致等问题［5，6］，
限制了该技术的应用，有必要对点样环节加以改进。
本研究针对手工点样斑点杂交实验中存在的样品点
密度小、点样体积受限制和点样点不规整等问题，
通过对杂交膜的预处理，使样品富集和吸附在点样
点部位，以期提高手工点样的通量和规范性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料和试剂 水稻、小麦和大豆均为常
规品种，叶片采自中国农业科学院作物科学研究所
实验温室，-80℃保存待用。鼠抗水稻看家蛋白抗体
Anti-HSP 购自北京华大蛋白公司 ；IRDye800 标记的
山羊抗鼠抗体购自宝生物工程有限公司。硝酸纤维
素膜（nitrocellulose membrane，NC 膜）和聚偏二氟
乙 烯 膜（polyvinylidene fluoride，PVDF 膜 ） 均 为 颇
尔公司产品。低熔点石蜡（48-50℃）和其他试剂购
自国药集团化学试剂公司。
1.1.2 主要仪器 Odyssey CLX 双色红外荧光成像仪
为美国 LI-COR 公司产品。
1.1.3 缓 冲 液 提 取 液 ：7 mol/L 尿 素，2 mol/L 硫
脲，4%（W/V）CHAPS，2 μg/μL DTT。洗脱液：0.01
mol TBST ：10 mmol Tris，100 mmol NaCl，用 0.1 mol
HCl 调 pH 为 7.5，加入 0.1% Tween-20。
1.2 方法
1.2.1 蛋白提取方法 蛋白质提取参考 Herman 等［7］
方法改进。植物叶片液氮研磨，取 0.2 g 溶于 1.5 mL
提取液，置于冰上静置 1 h ；离心（12 000×g，4℃，
15 min），上清液重复离心后加 4 倍体积预冷丙酮，
-20℃放置过夜；离心（12 000×g，4℃，15 min），沉
淀即为蛋白提取物。蛋白定量参照 Bradford 方法［8］。
1.2.2 膜预处理方法 根据预设点样点的孔径、排
列方式和密度，先制作塑料材质的柱状凸起模具。
制作模具时需保证柱状凸起的直径和间距与预设点
样点对应，且凸起部位平整。还可使用底面平整的
V 型底 384 孔深孔板等商品化的塑料孔板，以孔板
的 V 型底作为模具的柱状凸起部位。预处理杂交膜
前，将模具平放在用支撑平板托起的杂交膜上，再
用固定夹固定模具和支撑平板，使模具的凸起部位
与杂交膜紧密接触。然后将熔化的石蜡涂布于膜上
非模具接触部位，待石蜡凝固后小心移走模具，确
保预留的点样点无蜡质污染，同时使非点样部位具
有疏水性。
1.2.3 点杂交方法 点杂交实验参考 Cheley 等［9］方
法，封闭和抗体孵育后用洗脱液清洗 3 次，每次 10
min。
1.2.4 检测方法 用 LI-COR Odyssey CLX 双色红外
荧光成像仪直接扫描成像，选择 800 nm 绿光通道，
膜成像分辨率设置为 80 μm。
2 结果
2.1 杂交膜的预处理
点杂交实验常用的杂交膜是 NC 膜和 PVDF 膜，
这两种杂交膜均可以用柱状凸起模具和低熔点石蜡
进行预处理。图 1 为采用孔距 4.5 mm，凸起部位直
径 1.2-2.4 mm 的模具制备的预处理杂交膜，膜上浅
A B
C D
A ：点样点孔径 1.8-2.4 mm 的 NC 膜 ；B ：点样点孔径 1.2-1.7 mm 的 NC 膜 ；
C ：点 样 点 孔 径 1.8-2.4 mm 的 PVDF 膜 ；D ：点 样 点 孔 径 1.2-1.7 mm 的
PVDF 膜
图 1 预处理后的杂交膜
2015,31(11) 123姜超等 ：一种点杂交膜预处理方法的建立及应用
色部分是保留了杂交膜原有特性的点样孔，深色部
分则为被石蜡覆盖的疏水区域。经过预处理的杂交
膜的点样点位置、大小和形状规范统一，使用时可
根据需要选择不同孔径的膜。
2.2 预处理膜的特性
将荧光染料 IRDye800 标记的山羊抗鼠抗体直接
点在普通 PVDF 膜和经预处理的 PVDF 膜上，待膜
干后用 Odyssey CLX 成像仪检测。结果（图 2）显示，
经过预处理的膜上样品点形状整齐规范，且随着点
样体积的增加荧光信号增强，而普通杂交膜上样品
点大小明显随点样体积变化，并呈现不规则的形状。
经过预处理的 NC 膜和 PVDF 膜上，与水稻看家蛋
白抗体 Anti-HSP 杂交，结果（图 4）显示在预处理
PVDF 膜上的水稻和小麦点样点均有较强信号，而
在预处理 NC 膜的杂交信号较弱，其中大豆的信号
几乎检测不到。
1 2 3 4
A
B
A ：预处理 PVDF 杂交膜 ；B ：普通 PVDF 膜 ；1-4 ：点样体积分别为 2 μL、
2×1 μL、1 μL、0.5 μL
图 2 预处理膜（A）和常规膜（B）手工点样结果的比较
2.3 蛋白质样品的制备
采用尿素硫脲法进行了水稻、小麦和大豆叶片
蛋白质样品制备，SDS-PAGE 分析（图 3）显示蛋白
质提取物条带多，得率高。结果说明，尿素硫脲法
提取的 3 种植物叶片蛋白较完整，可以用于点杂交
预处理膜的进一步实验验证。
1 2 3
1 ：水稻 ；2 ：小麦 ；3 ：大豆
图 3 水稻、小麦和大豆叶片全蛋白的 SDS-PAGE 分析
1
2
3
A B
1 ：大豆蛋白 ；2 ：小麦蛋白 ；3 ：水稻蛋白 ；A ：预处理 PVDF 膜 ；B ：预处
理 NC 膜 ；点样体积 ：0.5 μL
图 4 水稻、小麦和大豆叶片蛋白与 Anti-HSP 的预处理膜
点杂交
3 讨论
目前文献报道的手工点杂交实验普遍存在通量
低和可视性较差等问题［5，6］，主要原因是样品在杂
交膜上容易扩散和难以保证点样点规整一致。基于
自动点样和扫描技术的高通量芯片分析技术解决了
上述问题，在生物学和医药研究中发挥着重要的作
用［10-13］，但芯片技术在便捷性和成本方面并无优势
可言。
利用模具和石蜡对 NC 膜和 PVDF 膜进行预处
理，使膜上除点样点外的区域具有疏水性，确保样
品富集和吸附在点样部位，避免了手工点样时样品
容易扩散和点样点不统一规范等问题。模具的孔径
和孔间距可依据实际需要调整，以制备 15×20 cm
的预处理膜为例，采用孔距 4.5 mm，孔径 2.4 mm 的
柱状凸起模具，可得到 1 452 个点样孔，若孔距 3.0
mm，孔径 1.0 mm，则可制作出有 3 300 个点样孔的膜。
采用更简单的方法，即使用底面平整的 V 底 384 孔
深孔板做模具，则在 7×14 cm 的膜上可点 384 个样
品。需要注意的是，石蜡加热熔化后，宜保持石蜡
液体的温度高于熔点 5℃左右，温度太高或太低均
可能导致处理失败。涂布石蜡液时，还必须确保模
具和膜的紧密接触，防止石蜡液渗入模具凸起部位
和杂交膜之间。杂交膜经预处理后，仅在点样部位
保留了杂交膜原有特性，可根据样品数裁剪所需要
2.4 预处理膜的应用
将多次提取的水稻、小麦和大豆蛋白分别点在
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.11124
的预处理膜，实验成本低廉，操作简便。
直接点样检测和实际样品的点杂交实验证明，
使用预处理 NC 膜和 PVDF 膜能保证点样点的位置、
大小和形状统一规范，还能增加点样密度和点样体
积。提取水稻、小麦和大豆叶片全蛋白进行的点杂
交验证中，重复样品在预处理 NC 膜和 PVDF 膜上
均得到类似的结果，其中水稻和小麦点样点的信号
明显强于大豆信号，说明这种改进的手工点杂交实
验流程可用于实际样品分析。验证结果还显示，经
预处理的 NC 膜与普通膜的蛋白结合特性相似，检
测灵敏度相对较低。
4 结论
通过柱状凸起模具限定点样点的大小、排列方
式和密度，利用石蜡的疏水特性防止非点样部位吸
附样品，使预处理杂交膜的后续使用更方便。利用
本方法获得的预处理杂交膜适用于手工点杂交实验，
为解决点杂交实验过程中存在的问题提供了新的
选择。
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（责任编辑 马鑫）