全 文 ：沈阳医学院学报 Journal of Shenyang Medical College 第 15 卷 第 3 期 2013 年 9 月 ·137·
茅莓提取物体内抗乙型肝炎病毒的实验研究
柳勤译，陈晓武，杨小乔，许鸣
(广东省第二人民医院消化内科，广东 广州 510317)
摘要 目的:观察茅莓提取物 (乙酸乙酯部位)体内抗乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus，HBV)的作用。方法:采用聚
合酶链反应 (polymerase chain-reaction，PCR)法筛选 3 日龄鸭乙型肝炎病毒 (duck hepatitis B virus，DHBV)阳性麻鸭 50
只，将麻鸭随机分为盐水对照组、茅莓提取物高、中、低剂量组和拉米夫定组，于用药前、用药第 7、14、21 天及停药后
第 3、7 天，取各组麻鸭静脉血，作鸭血清 DNA 斑点杂交，计算鸭血清 DHBV-DNA 密度，最后一次取血后取肝脏组织进
行病理组织学观察。结果:体内实验显示，盐水对照组动物血清 DHBV-DNA水平与用药前比较未见变化 (P ＞ 0. 05) ，拉
米夫定组血清 DHBV-DNA于用药第 14 天和第 21 天与用药前比较明显减低 (P ＜ 0. 01) ，与盐水对照组用药第 7 天、第 14
天和第 21 天血清 DHBV-DNA比较明显降低 (P ＜ 0. 05 和 0. 01)。与盐水对照组比较，茅莓提取物各剂量组 21 d疗程各时
点血清 DHBV-DNA未见变化 (P ＞ 0. 05)。肝脏病理检查示各组差异无显著性。结论:茅莓提取物抗 HBV作用主要是通过
其原形发挥作用，该原形在麻鸭体内经过代谢后，失去抗 HBV的作用。
关键词 茅莓提取物;鸭乙型肝炎病毒;斑点杂交
中图分类号 R512. 6 文献标识码 A 文章编号 1008 － 2344(2013)03 － 0137 － 03
doi:10. 3969 / j. issn. 1008 － 2344. 2013. 03. 003
The Research of Rubus Parvifolius Extract on Anti-hepatitis B Virus in Vivo
LIU Qinyi，CHEN Xiaowu，Yang Xiaoqiao，XU Ming
(Department of Gastroenterology，The Second Peoples Hospital of Guangdong Province，Guangzhou 510317，China)
Abstract Objective:To observe the role of Rubus parvifolius extract (extract of Ethyl acetate)on against duck hepatitis B virus
(DHBV)in vivo． Methods:Polymerase chain reaction (PCR)technology screening was used to select three-day-old DHBV posi-
tive 50 ducks． The ducks were randomly divided into blank control group and Rubus parvifolius extract group with high，medium and
low-dose and lamivudine group． Before the medication，The medication of 7，14 and 21 days，and 3 days and 7 days after withdraw-
al，duck blood in each group were taken for duck serum DNA dot-blot hybridization，duck serum DHBV-DNA density was calculat-
ed，and pathological liver tissue was taken to do the histological observation at the last time． Results:In this experiment，the levels
of serum DHBV-DNA in blank control group remained stable． Limivudine group after 14 and 21 days could significantly inhibit the se-
rum DHBV-DNA compared with that before medication (P ＜ 0. 01)． Serum DHBV-DNA after 7，14 and 21 days showed a signifi-
cant difference compared with blank control group (P ＜ 0. 05 and 0. 01)． After 21 days of Rubus parvifolius extract treatment with
various doses，serum DHBV-DNA at each time point did not show a significant difference compared with blank control group (P ＞
0. 05)． Among the groups，pathological examination of liver had no significant difference (P ＞ 0. 05)． Conclusion:Rubus parvifo-
lius extract main function of anti-hepatitis B virus plays a role through its prototype． The prototype through the metabolism of the body
in the duck，and the role of anti-hepatitis B virus was lost．
Key words Rubus parvifolius extract;duck hepatitis B virus;dot-blot hybridization
乙型肝炎是一种全球性分布的病毒传染病，
其感染面广，传染性强，易慢性化。我国每年约
有 40 万人死于与慢性乙型肝炎 (chronic hepatitis
B，HBV)相关的疾病，抗病毒治疗是治疗 HBV
最主要的治疗措施，目前国内外公认批准有效的
抗 HBV药物主要包括干扰素类［1］和核苷 (酸)类
似物 (nucleoside analogues，NA) ，但单一抗病毒
药如干扰素需注射治疗，不良反应较大，不适用
于肝硬化失代偿期和白细胞及血小板明显减少的
肝病患者;核苷类药物，其中以拉米夫定疗效最
为确切。细胞研究证实，拉米夫定能有效抑制
HBV复制，但仅仅抑制病毒 DNA 的复制量及其复
制中间体的产量，核苷类药物疗程难以确定，因
此在停止用药后可发生反跳，长期应用可产生耐
药突变，且副作用大，费用高。与干扰素和核苷
类药物相比，传统中药在长期治疗 HBV 过程中体
现了其疗效稳定、毒副作用小的独特优势。中草
药治疗 HBV的有效性在于它具有促进肝脏细胞的
·138· 沈 阳 医 学 院 学 报 第 15 卷
修复、保护细胞膜、调节免疫功能和抑制病毒复
制等方面的作用。茅莓是一种传统民间中药，据
《中药大辞典》记载，茅莓的根、茎和叶均可药
用，用于治疗肝脾肿大、黄疸、慢性肝炎等［2］。
目前有国内外学者报道茅莓提取物 (乙酸乙酯部
分)对 HBsAg和 HBeAg两种抗原的表达均有抑制
作用，但尚无茅莓提取物 (乙酸乙酯部分)在体
内抗乙型肝炎病毒相关方面的报道，为此进行本
研究。
1 材料与方法
1. 1 药物 受试药物茅莓提取物 (乙酸乙酯部
分) ，为粉末剂由南方医科大学药理教研室提供。
阳性药选择:选择对鸭乙型肝炎病毒 (duck hepa-
titis B virus，DHBV)抑制作用较强的拉米夫定作
为阳性对照药，规格 0. 1 g，中国苏州葛兰素史克
制药 (苏州)有限公司生产，批号:H20070581。
1. 2 动物 3 日龄麻鸭，购自广西临桂县五通镇
孵化场，体重约 50 g /只，常规饲养。饲养环境:
温度 20 ～ 25 ℃，相对湿度 60% ～ 80%，定时通风
换气，每日约 12 h 光照。饲料:宝鼎 501 小鸭饲
料，由穗屏企业有限公司饲料厂生产，40 kg /包。
1. 3 主要试剂及仪器 Taq 酶，10 × PCR buffer、
dNTP mixture、6 × loading buffer，均购自北京赛百
盛生物工程有限公司。引物由北京赛百盛生物工
程有限公司合成，梯度聚合酶链反应 (polymerase
chain reaction，PCR)仪，mastercycler gradint 型号
5331。高速离心机，Eppenolf 型号 5415D。Dyy-6C
型电泳仪。NC 膜:购自 Amersham 公司;DHBV
质粒:由广州中医药大学热带病研究所病毒室提
供;缺口翻译药盒:购自 promega 公司;α-32 p-
dCTP，购自北京亚辉公司;Sephadex G-50:购自
Pharmacia公司;96 孔杂交点样器:美国 Bio-rad
公司产品;盖革氏计数器:美国 S. E. International
公司产品。常规 HE染色所需试剂由南方医科大学
组胚教研室提供。
1. 4 方法
1. 4. 1 模型筛选 DHBV 阳性鸭子的筛选:3 日
龄麻鸭 200 只于第 2 天经胫静脉取血，分离血清
后，用常规 PCR方法检测 DHBV，第 5 天出结果，
筛选出先天感染 DHBV鸭 65 只。
1. 4. 2 分组与给药 取经 PCR方法筛选出的先天
感染 DHBV鸭 50 只，随机分为 5 组，每组 10 只:
茅莓提取物 400、200、100 mg /kg组，生理盐水对
照组 1 ml /kg;拉米夫定 50 mg /kg 组，每天灌胃 2
次，连续灌胃 21 d。
1. 4. 3 取样方法 在给药前 (T0) ，用药后 7 d
(T7)、14 d (T14)、21 d (T21) ，停药后 3 d
(P3)、7 d (P7)自胫静脉取血分离血清， － 20
℃冻存待检。停药 7 d后将实验动物全部颈动脉放
血处死，立即摘取肝脏，取肝右叶相同部位组织
0. 5 cm ×0. 5 cm大小，用 10%中性福尔马林固定，
石蜡包埋切片，HE染色待检。
1. 4. 4 DHBV-DNA 检测方法取上述鸭血清采用
斑点杂交法，每批同时点膜，测定鸭血清中 DH-
BV-DNA水平的变化，按缺口翻译试剂盒说明书方
法，用32 P 标记 DHBV-DNA 探针，并作鸭血清
DNA斑点杂交，放射自显影膜片斑点，在酶标检
测仪上测定 OD值 (滤光片波长为 490 nm) ，计算
鸭血清 DHBV-DNA密度。
1. 4. 5 肝组织病理学观察 参照 2001 年 《病毒
性肝炎防治方案》及目前国际上常用 Knodell HAI、
Ishak、Scheuer 和 Chevallier 等评分系统或半定量
计分方案，了解肝脏炎症病理变化程度，以及评
价药物疗效。本实验观察指标:细胞水肿、气球
样变、间质炎细胞浸润、点状坏死。400 倍光学显
微镜下观察 HBV肝组织: (1)细胞水肿:不出现
者为 (–) ;占肝小叶 1 /2 ～ 1 /3 者为 (+) ;占肝
小叶 1 /2 以上者为 (+ +) ;肝小叶广泛水肿者为
(+ + +)。 (2)气球样变:评分同细胞水肿。
(3)间质炎细胞浸润:未见者为 (–) ;偶见者为
(+) ;广泛可见者为 (+ + +) ;居于 (+)与
(+ + +)之间者为 (+ +)。(4)坏死:不出现
为 (–) ;肝小叶出现 1 ～ 2 个坏死灶者为 (+) ;
出现 3 ～ 4 个坏死者 (+ +) ，出现 4 个以上坏死
灶者为 (+ + +)。
1. 5 统计学方法 采用 SPSS 13. 0 软件包进行统
计分析，多组计量资料分析采用 One-way ANOVA，
多重比较采用最小显著差数法 (least significant
difference，LSD) ;双向有序等级资料采用线趋势
检验，两两比较采用 S-N-K法。
2 结果
2. 1 鸭血清 DHBV-DNA检测结果 盐水对照组动
物血清 DHBV-DNA水平稳定。拉米夫定口服 21 d
可显著抑制血清 DHBV-DNA，停药 3 d 和 7 d 后
DHBV-DNA显著回升。茅莓提取物各剂量组各时
点血清 DHBV-DNA变化差异无显著性，见表 1。
第 3 期 柳勤译等． 茅莓提取物体内抗乙型肝炎病毒的实验研究 ·139·
表 1 茅莓提取物在鸭体内对 DHBV-DNA的抑制作用 (x ± s)
组别 n T0 T7 T14 T21 P3 P7
盐水对照组 10 1. 02 ± 0. 40 1. 34 ± 0. 17 1. 15 ± 0. 18 1. 11 ± 0. 39 1. 04 ± 0. 32 0. 96 ± 0. 27
拉米夫定组 8 0. 98 ± 0. 32 0. 59 ± 0. 271) 0. 31 ± 0. 332)3) 0. 25 ± 0. 152)3) 0. 99 ± 0. 12 1. 03 ± 0. 12
茅莓大剂量组 10 0. 86 ± 0. 23 1. 14 ± 0. 06 1. 01 ± 0. 12 1. 04 ± 0. 14 1. 02 ± 0. 14 0. 93 ± 0. 21
茅莓中剂量组 9 0. 70 ± 0. 24 1. 01 ± 0. 11 1. 02 ± 0. 08 0. 91 ± 0. 21 0. 87 ± 0. 15 0. 91 ± 0. 14
茅莓小剂量组 9 0. 83 ± 0. 22 0. 94 ± 0. 17 0. 85 ± 0. 27 0. 89 ± 0. 11 0. 86 ± 0. 10 0. 89 ± 0. 11
注:与对照组相同时间比较:1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01;与同组 T0 比较:3)P ＜ 0. 01
2. 2 肝组织病理学显微镜观察 茅莓提取物大剂
量组的鸭肝组织内可见重度细胞水肿，但气球样
变较其他各组轻，未见坏死、纤维化和间质炎细
胞浸润。对照组及各药物组动物均可见肝细胞重
度细胞水肿、气球样变性，几乎无点灶状及碎屑
样坏死，无纤维增生，可见轻度间质炎细胞浸润，
这些病理表现各组差异无显著性 (P ＞ 0. 05) ，见
表 2。
表 2 各组鸭肝病理变化结果
组别 n
细胞水肿 气球样变 间质炎细胞浸润 点状坏死
－ + ++ +++ － + ++ +++ － + ++ +++ － + ++ +++
盐水对照组 10 0 0 2 8 1 2 3 4 8 2 0 0 10 0 0 0
拉米夫定组 8 0 0 0 8 0 1 2 5 7 1 0 0 80 0 0
茅莓大剂量 10 0 1 2 7 4 1 1 4 6 2 2 0 10 0 0 0
茅莓中剂量 9 0 0 1 8 1 1 1 6 8 1 0 0 9 0 0 0
茅莓小剂量 9 0 0 1 8 3 0 0 6 9 0 0 0 8 0 1 0
注:各组肝组织病理检查，P ＞ 0. 05
3 讨论
HBV属于嗜肝 DNA病毒科，这个家族的所有
病毒都很小，嗜肝性，毒粒形态和基因组相似，
复制经 RNA逆转录，毒粒形态和基因组相似，复
制经 RNA逆转录。一些哺乳动物和禽类嗜肝病毒
的发现为人类研究人乙型肝炎病毒的生物学相关
机制提供了实验和道德伦理上的便利。由于禽类
嗜肝病毒的 DHBV 与人乙型肝炎病毒均属于嗜肝
病毒科，两者在毒粒形态、结构、基因组成、复
制及传播方式等方面均很相似［3 － 5］。国内目前多
选用后天感染的鸭为肝炎的动物模型。国外学者
目前普遍采用 DHBV感染 1 ～ 3 日龄雏鸭建立乙型
肝炎动物模型，通过比较，先天感染 DHBV 的雏
鸭较后天感染模型的血清病毒持续时间长，病毒
滴度高;对肝组织的炎性反应长期存在，细胞病
变较为明显，其病毒血症持续时间较长且较稳定，
无明显的自然转阴现象，是研究人类乙型肝炎发
病机制、病毒复制过程及筛选有效治疗药物的理
想动物模型［6］。本研究发现:盐水对照组鸭血清
DHBV-DNA水平稳定，阳性药物拉米夫定可显著
抑制血清 DHBV-DNA，停药 3 d和 7 d DHBV-DNA
显著回升，与国内外报道的结果和临床结果都相
吻合。国内外学者报道茅莓提取物 (乙酸乙酯部
分)对 HBsAg和 HBeAg两种抗原的表达均有抑制
作用，且在 96 h 达高峰，并呈现浓度依赖性和时
间依赖性，这说明茅莓提物 (乙酸乙酯部分)在
体外有抗乙型肝炎病毒的作用，然而在体内茅莓
提取物 (乙酸乙酯部分)各剂量组 21 d 疗程各时
点血清 DHBV-DNA 变化差异无显著性［7 － 8］。这结
果显示茅莓提取物经过体内代谢后在鸭体内对
DHBV-DNA无抑制作用。考虑原因有: (1)茅莓
提取物在体内确实无抗病毒作用，与国内报道的
有相当多的药物体外有抑制病毒复制作用，而体
内并无抗病毒作用相一致。(2)给药剂量不足不
能达有效血药浓度，茅莓提取物在细胞试验中已
表现出对 HBsAg和 HBeAg的表达抑制，并呈现出
浓度依赖性和时间依赖性。(3)给药途径的影响，
茅莓提取物在给鸭灌胃经鸭体内代谢后抗病毒的
有效成分可能已经被破坏。(4)给药时间可能太
短，目前常用两大类抗病毒药物都需要长期用药，
作用机制不同，药物起效需要的时间也不一样。
综上所述，本实验研究中发现:茅莓提取物
(乙酸乙酯部分)抗乙型肝炎病毒作用主要是通过
其原形发挥作用，该原形在麻鸭体内经过代谢后，
失去抗乙型肝炎病毒的作用。 (下转第 156 页)
·156· 沈 阳 医 学 院 学 报 第 15 卷
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