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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):68-72
在生命科学飞速发展的今天，对于生命的探索
已深入到分子水平。在分子生物学试验中，对 PCR
扩增获得的目的 DNA 片段进行回收和纯化，除去非
特异性的 DNA 片段，进行后续研究是一个必不可少
的环节。鉴于琼脂糖凝胶电泳的分辨率相对较低，
尤其是回收片段大小在 50 bp 的 DNA 片段 时存在较
大的局限性［1，2］，借助于分辨率更高的聚丙烯酰胺
凝胶电泳（Polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）
回收纯化小片段 DNA，具有操作简单、回收纯度高、
价格经济、同时可操作回收多个样品等优点，现已
被广泛应用于小片段 DNA 的回收纯化［3，4］。目前有
几种常用的回收方法［5-7］，在市场上也有知名生物
试剂公司开发了相应的回收纯化试剂盒，但这些回
收方法都表现出经济成本与高效性不可兼得的矛盾。
因此，探索一种操作相对简单、回收效率较高、回
收成本较低的实用方法尤为重要。本研究在前人研
收稿日期 ：2014-08-27
基金项目 ：公益行行业专项（201203091），国家烟草专卖局重点项目（110201002002）
作者简介 ：向小华，男，博士研究生，研究方向 ：烟草分子育种 ；E-mail ：xiangxiaohuacaas@163.com
通讯作者 ：王元英，男，研究员，博士生导师，研究方向 ：烟草遗传育种 ；E-mail ：wyytob@126.com
一种从非变性聚丙烯凝胶中回收小片段 DNA 的方法
向小华1，2  焦禹顺1，2  吴新儒1  程亚增1，2  侯烁1，3  刘贯山1  王元英1
（1. 中国农业科学院烟草研究所 中国农业科学院烟草遗传改良与生物技术重点开放实验室，青岛 266101 ；
2. 中国农业科学院研究生院，北京， 100081 ；3. 青岛农业大学农学与植物保护学院，青岛 266109）
摘 要 ： 利用高分辨率的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、纯化特异性小片段 DNA 的首选方法，也是开展后续多种分子
生物学试验的前提。本试验比较了改良煮沸法（液氮研磨 + 煮沸 + 低温浓缩）、煮沸法及直取法回收小片段 DNA，以回收样品模
板进行第二次 PCR 扩增，结果表明 ：改良方法回收的 DNA 的纯度高，特异性好，回收率与经典煮沸法相当。在保证回收产物的
特异性时，用低温浓缩法替代乙醇 / 醋酸钠共沉淀也具有可行性及一定的创新性。
关键词 ： 非变性聚丙烯凝胶 ；DNA 小片段 ；二次 PCR ；改良煮沸法 ；胶回收
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.011
A Method of Recovering Short DNA Fragments from Non-denaturing
Polyacrylamide Gel
Xiang Xiaohua1，2 Jiao Yushun1，2 Wu Xinru1 Cheng Yazeng1，2 Hou Shuo1，3 Liu Guanshan1 Wang Yuanying1
（1. Tobacco Research Institute of CAAS，Key Laboratory of Tobacco Genetic Improvement and Biotechnology，CAAS，Qingdao 266101 ；
2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081 ；3. College of Agriculture and Plant Protection，Qingdao
Agricultural University，Qingdao 266109）
Abstract: The polyacrylamide gel electrophoresis with high resolution is a top choice for isolating and purifying specific short DNA
fragments, and also serves as a prerequisite for a variety of subsequent molecular biology experiments. In this study, three methods, i.e.,
modified boiling method（grinding with liquid nitrogen + boiling + concentrating at low temperature）, traditional boiling method（in which
DNA is precipitated with absolute ethanol and 3 mol/L sodium acetate together）, and direct recovery method were used to extract short DNA
fragments. The short DNA fragments were used as the template for a second PCR reaction. The results showed that recovered DNA fragments by
the modified boiling method had higher purity and finer specificity, and the recovery rate was nearly the same as the traditional boiling method.
Replacing the method of precipitation with ethanol and sodium acetate by method of concentrating at low temperature is feasible and novel.
Key words: non-denaturing polyacrylamide gel ；short DNA fragments ；secondary PCR ；modified boiling method ；gel recovery
2015,31(5) 69向小华等：一种从非变性聚丙烯凝胶中回收小片段 DNA的方法
究的基础上［8-10］，通过液氮研磨增加 PAGE 凝胶的
破碎度，利用煮沸法从非变性聚丙烯酰胺凝胶中最
大程度地释放、回收纯化目的 DNA 片段并结合低温
浓缩的方法，并将回收后的 DNA 用于第二次 PCR
的模板，再与常规直取法的结果进行比较，旨在验
证这种纯化方法的实用性和可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 植物材料为中烟 100 经过 EMS 诱
变处理得到的白茎突变体（Mutant，M）［11］和野生
型中烟 100（Wild type，WT）的种子各 30 粒，由中
国农业科学院烟草研究所刘贯山研究员提供。种子
经常规消毒培养 4 周后进行假植，待材料生长到 5-6
片真叶时，取材料的新鲜叶片提取基因组 DNA，进
行后续试验。
1.1.2 试剂 30% 丙烯酰胺储液（丙烯酰胺∶N，N-
亚甲叉双丙烯酰胺 =29∶1）；双蒸水 ；10% 过硫酸
铵（APS）；10×TBE ；1×TBE Buffer ；TEMED ；
20 bp DNA Ladder Marker（TaKaRa）；亲和硅烷，剥
离硅烷，植物基因组 DNA 提取试剂盒（Tiangen），
特 异 性 SSR 引 物 PT51778，Thermor PCR mix（ 内
含 ：Taq 酶、dNTPs、Mg2+，Reaction Buffer、Loading
Buffer）。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取 参照试剂盒提供的步骤
提取材料的基因组 DNA，具体操作步骤如下 ：（1）
取烟草新鲜叶片组织 0.1 g，加入液氮充分研磨，每
个样品 3 个重复。（2）将研磨好的粉末迅速转移到
预先装有 700 μL 65℃预热缓冲液 GP1 的离心管中
（试验时现加 β-巯基乙醇，使终浓度达 0.1%），迅速
颠倒混匀后，65℃温育 20 min，期间颠倒混匀 3-4 次。
（3）加入 700 μL 氯仿，充分混匀，12 000 r/min 离
心 5 min。（4）取上清液转入一新的离心管中，加入
700 μL 缓冲液 GD2，充分混匀。（5）将混匀的液体
转到吸附柱 CB3 中，12 000 r/min 离心 30 s，弃掉废
液。（6）向吸附柱中加入 500 μL 缓冲液 GD，12 000
r/min 离心 30 s，倒掉废液。（7）向吸附柱中加入
600 μL 漂洗液 PW，12 000 r/min 离心 30 s，倒掉废
液。（8）重复步骤（7）。（9）将吸附柱放入收集管
中，12 000 r/min 离心 2 min，倒掉废液。将吸附柱
于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中的漂洗液。
（10）将吸附柱置于另一干净的离心管中，加入 100
μL TE，室温放置 2-5 min，12 000 r/min 离心 2 min，
将溶液收集到离心管中，并进行定性定量检测。
1.2.2 PCR 扩 增 目 的 片 段 使 用 Bio-Rad PCR 仪
C1000 进行 DNA 片段扩增。10 μL 反应体系包括 ：
2×Thermor supermix 5 μL，正反向引物（10 μmol/L）
各 0.6 μL， 模 板 DNA 2 μL，50 ng， 加 ddH2O 至 反
应 体 积 为 10 μL。PCR 反 应 条 件 为 ：94 ℃ 预 变 性
5 min ；94 ℃ 变 性 30 s，55 ℃ 退 火 30 s，72 ℃ 延 伸
1 min，72℃后延伸 10 min，产物 4℃保存备用。
1.2.3 目 的 片 段 的 非 变 性 PAGE 检 测 6% 非 变
性 PAGE 胶的制备参照《分子克隆技术指南（第 3
版）》［12］，待凝胶完全凝聚后，于电泳槽中加入足量
的 1×TBE 缓冲液 60 W 预电泳 15 min，取 4 μL PCR
产物进行 60 W 恒功率电泳检测，电泳至指示剂二甲
苯青接近胶板 2/3 处停电泳。
1.2.4 凝胶的硝酸银染色显示 电泳结束后，凝聚
染色按照朱丹等［13］报道的方法加以改进。具体步骤
如下 ：（1）水洗 ：将凝胶板放入含 1 L 去离子水的
染色盘中，再漂洗 30 s。（2）银染 ：在盘中加入 1 L
蒸馏水，1.5 g AgNO3 和 1 mL 甲醛，120 r/min 振荡
10-15 min。（3）水洗 ：取出染色板，在 1 L 蒸馏水
中快速荡洗十几秒。（4）显影 ：在 1 L 冷的显影液
（1000 mL 蒸馏水 +16 g NaOH+4-5 mL 甲醛）中振荡，
然后将盆放在摇床上轻轻摇动至条带清晰显现，直至
条带出现，终止显影并用去离子水润洗胶面 3-4 次。
1.2.5 PAGE 胶中差异条带的回收
1.2.5.1 直取法 参照陈亮等［14］方法进行。在胶湿
润时直接使用无菌的 10 μL 枪头在聚丙烯酰胺凝胶
的目标条带的同一位置上轻扎 1-3 次，在 PCR 反应
液中反复吸打，以枪头上沾有的小胶块作为 PCR 反
应的 DNA 模板，重复 2-3 个 PCR 反应以避免模板
未转移到管中的情况。
1.2.5.2 煮沸法 参照文献［15，16］进行。切下
目的条带，取等量的凝胶分别放入两个无菌离心管
中，向保留有凝胶的离心管中用 100 μL 双蒸水清
洗两遍后吸干残留液，用无菌枪头尖将凝胶碾碎，
在含有凝胶的离心管中加入 100 μL 双蒸水，100℃
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.570
煮 沸 15 min，12 000 r/min 离 心 5 min 后， 将 上 清
液（DNA 粗回收液）移至一新的离心管中。参照文
献［15］的方法步骤进行纯化回收，在上清液加入
2 倍体积预冷的无水乙醇和 1/10 体积 3 mol/L 的醋酸
钠（pH5.2），-20 ℃ 放 置 1 h ；4 ℃，12 000 r/min 离
心 20 min，吸弃上清 ；用 75% 乙醇洗涤沉淀 2 次 ；
4℃，12 000 r/min 离心 2 min，吸弃上清 ；待乙醇挥
发干净后，用双蒸水溶解沉淀，取 5 μL 用作 PCR
模板进行扩增，取 5 μL 扩增产物进行电泳检测。
1.2.5.3 改良的煮沸法 切下目的条带，取等量的
凝胶分别放入两个无菌离心管中，向保留有凝胶的
离心管中用 100 μL 双蒸水清洗两遍后吸干残留液。
在吸干水分的凝胶中 2 mL 离心管中加入两颗干净的
钢珠，置于液氮中 5 min 左右，在植物组织破碎仪
上研磨（频率为 1 000 Hz/min），使凝胶呈粉末状，
后在管中加入 100 μL 双蒸水，98℃煮沸 15 min。后
在室温放置 30 min，以 12 000 r/min 离心 10 min，取
上清液于新离心管中，将离心管放置在浓缩仪中低
温（4℃）浓缩至液体体积为 30 μL 时，测定浓度，
并取 5 μL 做为 PCR 反应的模板进行扩增，取 5 μL
PCR 扩增产物进行电泳检测。
2 结果
2.1 烟草基因组DNA的提取
1% 琼脂糖凝胶电泳结果表明，提取的烟草基
因组 DNA 条带单一，无弥散现象，且一致性较好
（图 1）。紫外分光光度计测定结果表明，所提取的
DNA 的 OD260/OD280 基本在 1.7-1.9 之间，没有超出
2.0，说明提取的 DNA 中没有蛋白质、酚污染 ；且
OD260/OD230 基本都在 1.9-2.1 之间，表明 DNA 纯度
较高，没有小分子污染。综上分析，提取的烟草基
因组 DNA 符合后续实验要求。
2.2 目的DNA的获取
SSR 引物 PT51778 在烟草野生型和突变体中的
PCR 扩增产物通过 1% 的琼脂糖胶电泳检测的结果
（图 2-A）显示，目的 DNA 片段（大小在 100-200
bp 之间）得到了有效扩增。利用 1% 琼脂糖凝胶电
泳结果显示，除了目的条带以外没有展示出非特异
性扩增的条带。但利用 6% 非变性聚丙烯凝胶电泳
检测，除目的条带外，还有一些大小不等的非目的
条带（图 2-B），这也验证了非变性聚丙烯凝胶的分
辨率高于普通琼脂糖凝胶。
M ：DNA Marker ；1-4 ：M samples ；5-8 ：WT samples
图 1 1% 琼脂糖检测基因组 DNA
10000
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8
1000
500
250
M ：DL2000 DNA Marker ；1 ：WT sample ；2 ：M sample
图 2 1% 琼脂糖（A）和 6% 非变性聚丙烯凝胶（B）电
泳检测 PCR 扩增产物
bp
M 1 2
2000
750
200
100
bp
M
A B
1 2
200
100
2.3 不同回收DNA方法的比较
将目的条带从非变性凝胶上切下按照不同方法
回收，取回收产物为模板经 PCR 二次扩增。结果显
示，3 种方法回收的目的片段的扩增产物均获得了
预期大小（150 bp 左右）的目的片段，这进一步验
证了试验选用的方法对于回收 DNA 小片段具有的可
行性。但比较不同方法之间的回收产物用于第二次
PCR 扩增得到的产量表明，直取法回收的 DNA 经
PCR 反应扩增出有效目标片段大小的产物量平均约
为 30 ng/μL。而改良煮沸法回收 DNA 为模板的 PCR
反应扩增出有效目标片段大小的产物平均量与经
典煮沸法的量相当，约是直取法的 4 倍，均在 120
ng/μL 左右（图 3）。产物经与克隆载体连接、转化，
蓝白斑筛选等操作，阳性克隆的测序结果显示插入
片段单一。因此可用于后续的研究，这也验证了本
2015,31(5) 71向小华等：一种从非变性聚丙烯凝胶中回收小片段 DNA的方法
实验方法是可行的。
3 讨论
目 标 DNA 片 段 的 回 收 和 纯 化 是 进 行 下 游 分
子生物学的基础步骤。近年来已有不少报道关于
DNA 回收与纯化的方法，但大都局限用于琼脂糖凝
胶［17，18］而从非变性 PAGE 胶中回收和纯化 DNA 的
报道较少［19］。由于琼脂糖凝胶的分辨率较低，所以
具有高分辨率的聚丙烯凝胶电泳（PAGE）在回收小
片段等多种基因工程操作中作用尤其重要。目前较
常用是煮沸法和沉淀法，但由于聚丙烯酰胺凝胶具
有在高温下不熔，强韧致密的结构，煮沸、挤压、
捣碎、浸泡的处理都不甚理想的特点，这些限制了
DNA 的释放，从而影响回收的效率［20］。目前报道
的几种方法，不是回收率低，就是操作繁琐，价格
昂贵［21］。因此，完善而高效的回收方案亟待探索。
本试验在现有研究的基础上采用直取法、煮沸法和
改良煮沸法回收 DNA 小片段，均得到了目的条带，
但改良方法获得的目的条带的浓度较直取法更大，
效率高，这也验证了本试验借助液氮对聚丙烯酰胺
凝胶的固化作用后研磨凝胶，破坏凝胶的结构使得
DNA 最大限度的从凝胶中释放出来，经煮沸后不用
乙醇沉淀，选用常温浓缩减少目的产物的损失，从
而提高了 DNA 的回收率。试验结果也表明，本研究
改良的方法是一种简单经济、回收率高的方法能被
广大实验室研究人员所接受。
4 结论
经过比较不同方法，本研究运用液氮研磨使凝
胶固化粉末，煮沸及常温浓缩处理，使凝胶中小片
段 DNA 最大限度的释放，得到了高浓度，纯度较好
的目的的片段。
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M ：DL2000 DNA Marker ；1，2 ：直取法 ；
3，4 ：改良煮沸法 ；5，6 ：煮沸法
图 3 不同方法回收 DNA 的 PCR 扩增产物检测
2000
bp
M 1 2 3 4 5 6
750
250
100
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（责任编辑 狄艳红）