全 文 ：西北植物学报 , 2011 , 31(7):1453-1457
Acta Bot.Boreal.-Occident.Sin.
　　文章编号:1000-4025(2011)07-1453-05 ①
巴东木莲种子贮藏和萌发过程中同工酶分析
张德春1 ,张　博1 ,刘　曦1 ,王希群2 ,陈发菊1＊
(1 三峡大学生物技术研究中心 ,湖北宜昌 443002;2 国家林业局林产工业规划设计院 ,北京 100010)
摘　要:以贮藏和萌发过程中的巴东木莲种子为材料 , 采用非变性聚丙烯凝胶电泳技术分析其种子中淀粉酶
(AM Y)、酯酶(ES T)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)同工酶酶谱 , 并测定其酸性磷酸酶(ACP)和 POD
的活性 ,以探讨巴东木莲种子休眠和萌发过程中的生理生化变化特征.结果表明:巴东木莲种子在贮藏和萌发过程
中 , ES T 和 SOD 同工酶在萌发过程中表达增强 ,并不断有新酶的合成;AM Y 同工酶在萌发初期表达强度高且酶
带数较多 , 到后期表达水平较低 ,其可能启动并控制种子萌发快慢;POD 同工酶在萌发后期酶的活性增强 , 且酶的
种类也增加 , 与 EST 和 AM Y同工酶的变化相适应.巴东木莲种子 ACP和 POD活性在储藏条件下以干藏种子最
低 , 在萌发过程中总体上随发育进程呈升高的趋势 , 与同工酶电泳的结果吻合.因此 , EST 、AM Y、SOD 和 POD 同
工酶酶谱变化及表达强弱可作为巴东木莲种子萌发各阶段转变的重要标志.
关键词:巴东木莲;种子;同工酶;非变性聚丙烯凝胶电泳
中图分类号:Q945.34 文献标志码:A
Seed Isozyme Analysis of Manglietia patungensis
during Storage and Germination
ZHANG De-chun1 ,ZHANG Bo1 ,LIU Xi1 ,WANG Xi-qun1 , 2 ,CHEN Fa-ju1＊
(1 Biotechnology Research C enter , China Th ree Gorges Universi ty , Yich ang , Hubei 443002 , China;2 Planning and Design Acade-
my of Forest Produ cts In dust ry , State Fo rest ry Adminis trat ion , Beijin g 100010 , China)
Abstract:Amy lase (AMY), esterase (EST), supe ro xide dismutase (SOD)and pero xidase (POD)i sozymes
w ere analy zed by non-denaturing po ly acry lamide gel elect rophoresis and the activi ties of ACP and POD
were determined from the pro cess of Mangl ietia patungensis seed sto re and ge rmination.The results
showed:the isozyme activit ies all had different deg rees o f changes in their co rresponding contro l metabo-
lism s.Among them ,EST and SOD ,w ith the passage o f time , enhanced thei r expressions and the seed con-
tinually had some new enzyme (ES T and SOD)synthesis in the process of ge rminat ion.Such changes pro-
mo ted the germination process.In the pro cess of seed germinat ion , early expression of AMY was in high-in-
tensi ty w ith a few more , only late r to the low er lev el of e xpre ssion.This indicated that AMY may play an
impor tant role on initialing the process of seed germination and contro lling the speed of seed germination.
POD enzyme in the late of germination ,not only the expression of enzyme increased ,but the type of expres-
sion also increased.This w as cor related w ith the changes ES T and AMY.ACP and POD act ivities o f seed
which sto red a t room temperature w as the low est and w as increased wi th the development t rend of seed
ge rmination in general , which confirmed iso zyme electrophoresis results.The resul ts on iso zyme pat terns
during M.patungensis seed store and germina tion showed that the regular variations in increase or decline
of the activit ies of ES T ,AMY ,SOD and POD isozymes w ould be as a reference label of the seed germina-
tion stages.
①收稿日期:2010-10-13;修改稿收到日期:2011-04-08
基金项目:国家自然科学基金(30670202);国家林业局林业科学技术项目(2008-03)
作者简介:张德春(1969-),男(汉族),博士 ,副教授 ,主要从事植物遗传育种研究.E-mail:zh angdc227@163.com
＊通讯作者:陈发菊 ,博士 ,教授 ,主要从事植物发育生物学及植物细胞工程研究.E-mail:chenf j616@163.com
Key words:Mangliet ia patungensis;seed;i sozyme;PAGE
　　多细胞植物的发育是一系列基因在时空上顺序
表达的过程.种子贮藏和萌发过程是种质资源研究
的一个重要内容 ,种子萌发标志植物进入营养生长 ,
有关基因不断开启 、表达.基因表达一方面是通过特
殊酶的合成 —调控代谢;另一方面是通过一种酶的
多种分子形式—同工酶 ,在更精细的程度上调节代
谢 ,由此控制分化与形态建成.许多报道都表明 ,在
种子萌发过程中各种同工酶陆续形成 、活动并不断
变化.因此 ,同工酶酶谱在种子不同生长发育时期可
作为阶段发育的生化指标[ 1-2] .
巴东木莲(Mangliet ia patungensis)属木兰科
常绿阔叶树种 ,为中国特有种.它分布零散 ,种群数
量不多 ,自然条件下种子萌发力极低 ,天然更新能力
差 ,处于濒危状态 ,属国家二级保护植物.巴东木莲
不仅在研究植物系统发育与演化上具有重要的意
义 ,而且其树形优美 ,花大而美丽 ,具有很高的观赏
价值.目前 ,国内外关于巴东木莲的研究报道较少 ,
且其研究主要多集中在分类学[ 3-4] 、组织培养 、嫁接
和扦插繁殖[ 5] 、群落学[ 6] 、保护生物学[ 7] 等方面 ,而
对其种子贮藏和萌发过程中的同工酶研究尚无相关
报道.本试验针对巴东木莲种子萌发困难特点 ,通过
对不同储藏条件和萌发过程中其种子同工酶(酯酶 、
淀粉酶 、超氧化物歧化酶 、过氧化物酶)的研究 ,以及
酸性磷酸酶和过氧化物酶活性的测定 ,探讨该种子
休眠和萌发过程中相关生理生化的变化特征.
1　材料和方法
1.1　材　料
巴东木莲种子于 2009年 10月份采自湖南省永
顺县 ,分别取新鲜(原材料)、室温干藏(储藏时期 4
个月)、4℃湿沙储藏(储藏时期 4个月)以及萌发各
时期(萌动 5 d的种子 、萌动 11 d种子 、胚根突破种
皮期材料 、根长至 2 ～ 3 cm 期材料 、胚轴伸长期材
料)的巴东木莲种子 ,于液氮中处理 2 h ,然后放入
-70℃超低温冰箱中保存备用.
1.2　方　法
1.2.1　酶液制备　分别取-70℃下保存的材料0.5
g ,加入 PVP 0.1 g ,2.5 mL 的0.05 mol/L 磷酸缓
冲液(pH 值为 7.8 ,使用时需预冷),冰浴研磨成匀
浆 ,12 000 r/min ,4℃离心 20 min ,取上清液 ,离心3
次 ,即为酶提取液 , 用于同工酶分析;酸性磷酸酶
(ACP)和过氧化物酶(POD)酶液提取时 ,分别将
0.05 mo l/L 磷酸缓冲液(pH 7.8)换为 0.05 mol/L
T ris-HCl缓冲液(pH 7.5)和 0.1 mo l/L T ris-HCl
缓冲液(pH 8.5).
1.2.2　电泳和酶活性测定　采用 PAGE凝胶电泳
和组织化学染色相结合的方法[ 8] ,分析巴东木莲种
子不同储藏条件和萌发过程中的同工酶酶谱.ACP
和 POD活性测定分别采用对硝基酚磷酸钠法[ 9] 和
愈创木酚法[ 10] .
2　结果与分析
2.1　种子不同储藏和萌发期同工酶电泳图谱比较
2.1.1 　酯酶同工酶 　酯酶(esterase isozymes ,
ES T)在植物体内广泛存在 ,它可能参与酯代谢与内
膜系统的发育过程 ,也参与若干酶类的修饰 、激活或
钝化[ 11] ,导致一系列的激素和酶的变化 ,这些变化
都离不开细胞内膜系统(内质网等)的参与 ,从而都
可能直接或间接与酯酶代谢有关[ 12] .本试验中 ,巴
东木莲种子储藏和萌发过程中酯酶同工酶共出现 9
条酶带(图 1),从负极到正极依次为 E1 ～ E9 ,其中的
E1 、E2是各时期的共有酶带 ,并且酶带 E1 着色深且
酶带宽 ,表明酶带 E1对应同工酶的活性强.就 EST
同工酶酶带数而言 ,胚根突破种皮期 ～ 胚轴伸长期
种子(Ⅵ ～ Ⅷ)酶带明显较多 ,萌动 5 d 的种子最少
(Ⅳ);室温干藏种子(Ⅱ)的酶带数多于 4℃湿沙藏
种子(Ⅲ)且其酶带着色深 ,即前者的 ES T 同工酶活
性强于后者;巴东木莲种子在萌发过程中 , EST 同
工酶合成增加 ,并出现新酶带 E3 、E5 、E6 、E7 、E8 ,且
同工酶活力在胚轴伸长期达到高峰 ,表明在此期间
细胞内代谢体系更加活跃 ,代谢活动旺盛.
2.1.2　淀粉酶同工酶　淀粉酶(AMY)同工酶参与
糖类代谢 ,其表达的强弱直接影响到营养物质的供
应速度.因而 ,其活性和表达强弱的变化可能控制着
种子的萌发速度.贮藏和萌发过程中巴东木莲种子
AMY 同工酶电泳结果(图 2)显示 ,AMY 同工酶共
出现 4条酶带 ,从负极到正极依次为 A 1 ～ A 4 ,而且
变化明显.其中 ,A 3 存在于巴东木莲种子贮藏到萌
发的各个时期 ,即 A 3 的基因表达贯穿于各个时期;
而 A 4 和 A 1 、A 2 先后于萌动 11 d 种子(Ⅴ)和胚根
长 2 ～ 3 cm 期(Ⅶ )停止了表达 ,说明种子萌发早期
对淀粉酶的依赖性较大.
2.1.3　超氧化物歧化酶　从巴东木莲种子储藏和
萌发过程中超氧化物歧化酶(SOD)同工酶电泳结果
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(图 3)分析来看 ,共有 8条酶带 ,从负极到正极依次
为 S1 ～ S8 .其中 ,酶带 S5 、S6 为各时期共有酶带 ,表
明这两者是巴东木莲种子内 SOD同工酶的特征酶
带.4℃湿沙藏种子(Ⅲ)与室温干藏种子(Ⅱ)相比 ,
出现了酶带 S2 、S3 且着色较深 ,说明 4℃湿沙储藏
种子代谢活动较室温干藏种子旺盛;S1 、S7 、S8 酶带
出现在种子萌发后期 ,说明萌发后期的种子内代谢
的有害产物增加 ,同时 SOD同工酶的表达种类增多 ,
能通过有效地清除细胞内过量的活性氧 、自由基 ,维
持胞内活性氧水平平衡 ,避免对细胞造成伤害.
2.1.4　过氧化物酶　图 4显示 ,不同贮藏和萌发过
程中的巴东木莲种子过氧化物酶(POD)同工酶共
有 9条酶带 ,从正极到负极依次为 P1 ～ P9 ,且 P9 是
各时期的共有酶带.不同储藏条件下(室温干藏和
4℃湿沙藏)的种子 POD同工酶不仅酶的表达量差
异明显 ,而且表达的同工酶种类也差别很大.其中 ,
室温干藏后的种子(Ⅱ)仅有酶带 P 9 ,不但酶带数最
少 ,且酶含量最低 ,表明此时种子的活力很差.在萌
发过程中 ,种子的POD同工酶酶带总的变化趋势是
先减少后增加 ,即从种子萌动 5 d(Ⅳ)到胚根突破种
皮期(Ⅵ),酶带 P 3 、P6 依次消失;再到胚轴伸长期
(Ⅷ),依次出现酶带 P 6 和 P1 、P2 、P4 ,特别是到胚轴
伸长期不仅酶的表达种类最多 ,而且表达量很高.结
合 ES T 和 AMY同工酶电泳结果可知 ,由于巴东木
莲种子在胚根突破种皮及后期 ,代谢了大量的营养
物质 ,从而导致种子中POD同工酶的表达种类和含
量相应增加.
2.2　巴东木莲不同萌发期种子 ACP和 POD 活性
比较
2.2.1　ACP活性　图 5显示:在不同储藏条件下 ,
新鲜种子(Ⅰ)、室温干藏种子(Ⅱ)和 4℃湿沙储藏
种子(Ⅲ)的酸性磷酸酶(acid phosphatase ,ACP)活
性分别为 1.339 、0.334 和 2.956 μmo l mg-1
min
-1 .由此可见 ,巴东木莲种子失水后 ,由于呼吸
作用受抑 ,代谢速率减慢 ,相应地营养代谢相关的酶
(如ACP)表达量也有所下降.而在萌发过程中(Ⅳ
图 1　巴东木莲种子不同储藏条件和萌发过程中的酯酶 PAGE 电泳图谱
Ⅰ .新鲜种子;Ⅱ.室温干藏种子;Ⅲ.4℃湿沙藏种子;Ⅳ.萌动 5 d的种子;Ⅴ.萌动 11 d种子;Ⅵ .胚根突破种皮期材料;
Ⅶ .根长至 2～ 3 cm 期材料;Ⅷ .胚轴伸长期材料(侧根已长出);Ⅸ .空白对照;下同
Fig.1　The electr opho resis map of the seed esterase of M.patungensis on the different sto rage
conditions and in the process of seed germination by PAGE
Ⅰ .Fresh seed s;Ⅱ.S eeds stored at room temperatu re;Ⅲ.Seeds s tored at 4℃ w et sand;Ⅳ.S eeds of germinating 5 d;
Ⅴ.S eeds of germinat ing 11 d;Ⅵ .The m aterial of radicle breaking the seed coat;Ⅶ .The material of root len gth to 2～ 3 cm ;
Ⅷ .H ypocotyl elon gat ion material(l ateral root s have g row n);Ⅸ .Blank con trol;The same as below
图 2　巴东木莲种子不同储藏条件和萌发过程中的淀粉酶 PAGE 电泳图谱
Fig.2　The elec trophore sis map of the seed amy lase of M.patungensis on the different
stor age conditions and in the pro cess of seed germination by PAGE
14557 期　　　　　　　　　　　　张德春 , 等:巴东木莲种子贮藏和萌发过程中同工酶分析
图 3　巴东木莲种子不同储藏条件和萌发过程中的超氧化物歧化酶 PAGE 电泳图谱
Fig.3　The electropho resis map of the seed supero xide dismuta se of M.patungensis on the diffe rent
stor age conditions and in the pro cess of seed germination by PAGE
图 4　巴东木莲种子不同储藏条件和萌发过程中的过氧化物酶 PAGE 电泳图谱
Fig.4　The elec trophore sis map of the seed pero xidase of M.patungensis on the different
stor age conditions and in the pro cess of seed germination by PAGE
～ Ⅷ),巴东木莲种子 ACP 活性总体上呈逐渐增加
趋势.其中 ,在萌动第 11 d时(Ⅴ),种子 ACP 活性
有一小高峰;随后稍有回落(Ⅵ),之后迅速持续上
升;ACP 活性最低为室温干藏种子(0.334 μmol
mg-1 min-1), 最高为胚轴伸长期材料(39.004
μmo l mg-1 min-1).在种子的胚根突破种皮之前 ,
小高峰期的 ACP 为胚根突破种皮时准备大量的营
养物质;随后续发育的进行 ,其对营养物质的需求增
加 ,导致 ACP 的表达量迅速增加.因此 , ACP 活性
变化与种子的萌发密切相关.
2.2.2　POD活性　POD是植物细胞生长和植物体
发育的生化标志之一 ,也是植物抗逆境胁迫中非常
关键的酶.图 5 显示 , 巴东木莲新鲜种子(Ⅰ)的
POD活性为53.32 μmol mg-1 min-1 ,但室温干藏
种子(Ⅱ)的 POD活性下降为 0 ,而 4℃湿沙储藏种
子(Ⅲ)的POD活性相比新鲜种子又有所增加.在巴
东木莲种子萌发过程中(Ⅳ～ Ⅷ),其 POD活性先经
历一个低谷(Ⅴ), 后又呈迅速上升趋势.萌发期
POD活性低谷期出现在萌动 11 d(Ⅴ)的种子中(7.
08 μmo l mg -1 min-1),最高酶活性值出现在胚轴
伸长期 (257.201 μmo l mg-1 min-1).POD
是植物体内的保护酶之一 ,能消除活性氧和超氧阴
图 5　巴东木莲种子不同储藏条件下和萌发
过程中的 ACP和 POD活性
Fig.5　The activities of ACP and POD o f M.patungensis
on the different sto rage conditions and in the
process o f seed ge rmination
离子自由基对细胞造成的伤害.因此 , POD 活性的
高低可以反映植物生长发育及内在代谢水平 ,同时
也是植物抗性强弱的标志之一 .
3　讨　论
种子在萌发过程中其内部进行着一系列有序的
生理过程 ,而这一系列的生理过程是通过种子内的
酶来调控的 ,所以这一过程中同工酶的含量 、种类和
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程序性变化决定种子是否能正常萌发.熊丹等[ 13] 在
研究香果树体胚发生过程时 ,将同工酶作为识别各
时期的标志酶;朱彦涛等[ 14] 亦利用 EST 和 POD同
工酶鉴别不同甘蓝型油菜的遗传背景.在本试验巴
东木莲种子萌发过程中 , ES T 同工酶合成增加 ,并
出现新酶带;AMY同工酶不断减少 ,在萌发后期停
止表达;SOD同工酶在萌发后期出现新酶带;POD
同工酶合成先减少后增加.这与刘国勇等[ 15] 在分析
香果树种子萌发过程的 ES T 和 POD同工酶时的结
果一致.所以 , EST 、AMY 、SOD 和 POD 同工酶酶
谱变化及表达强弱可作为巴东木莲种子萌发各阶段
转变的重要标志.
本试验的巴东木莲种子在储藏过程中 ,4℃湿沙
储藏种子内 SOD和 POD同工酶的表达强度明显高
于室温干藏种子 ,表明该条件利于巴东木莲种子的
储藏.而在巴东木莲种子萌发过程中 , SOD 和 POD
在萌发后期表达量均增加.这主要是因为 SOD同工
酶为氧化还原系统的防御酶 ,与过氧化物酶 、过氧化
氢酶等酶协同作用防御活性氧或其他过氧化物自由
基对细胞膜系统的伤害[ 16] .在萌发中后期 ,种子内
与糖和脂类代谢相关的酶会有一个表达高峰 ,为胚
根突破种皮作准备;但糖类和脂类的代谢活跃 ,又会
产生大量的有害产物对细胞 、生物体造成伤害.因
此 ,这些有害产物就会诱导防御系统相关酶(如
SOD和 POD)的合成增加 ,以清除有害产物.
在巴东木莲种子储藏过程中 ,水分是维持其生
命活力并促进其萌发的重要物质.综合 EST 、AMY
和POD同工酶电泳结果 ,笔者认为巴东木莲种子不
耐脱水的原因可能是其种子脱水后 ,与耐脱水有关
的基因未表达或缺失.其中的 POD同工酶基因在巴
东木莲种子失水后 ,其表达量和种类很少 ,这可能是
巴东木莲种子不耐脱水的重要原因.本试验通过
ACP和 POD活性发现 ,巴东木莲种子失水后 ,不但
其 ACP表达量有所下降 ,而且其 POD的表达下降
到 0(无法测定出来).由于脂类代谢有害产物(脂质
过氧化物)的积累 ,而防御系统的酶(POD)几乎没
有表达 ,因而无法清除这些有害代谢产物 ,最终导致
了种子的劣变.这可能是巴东木莲种子对水依赖的
原因 ,也为巴东木莲种子采用湿法储藏提供了理论
上的依据.
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