全 文 ：应用 PCR技术定向引入 DNA小片段的策略*
张传生1 耿立英2 孟春花2 杨娜娜2 朱靖2 杜立新3
( 1山东农业大学生命科学学院,泰安 271018; 2山东农业大学动物科技学院,山东 271018;
3中国农业科学院畜牧研究所,北京 100094) )
摘 要: 描述一种应用 PCR技术定向引入 DNA 小片段和特异酶切位点的方法。为了获得 m2/ lo xp66EG
FPloxp71 基因片段。根据 EGFP基因序列, 设计一对特异引物, 上、下游引物分别引入 m2/ loxp66、loxp71 序列和
Xhol、Mlu1 酶切位点。以 pEGFPN1质粒为模板, 采用 PCR 扩增以合成 DNA 双链, 插入到克隆载体 pMD18T。
对重组子测序结果表明,实现了 DNA小片段和酶切位点的定向引入。
关键词: DNA 重组 DNA 小片段 PCR
The Strategy of Directed Introducted LowMolecular
Weight DNA by PCR
Zhang Chuansheng 1 Geng Liying2 Meng Chunhua2 Yang Nana2 Zhu Jing2 Du Lix in3
( 1 Col l ege of L if e S cie nce , S handong Ag ri cul tural Univ er si t y , T aian 271018;
2 Col l ege of A nimal S ci ence and T echnolog y , Sh andong A g ri cul tu ral Univ ersi ty , Taian 271018;
3 Animal H usbandr y Resear ch Inst i tut ion of Chine se A g ri cul tu ral S ci ence Coll eg e , Bei j ing 100094)
Abstract: A method of directed intr oduced low DNA fragments and site dur ing construction of recombinant
vector w as discr ied . U sing pEGFPN1 plasmid as the template , t he gene EGFP was amplified by polymerase chain
reaction w ith a pair o f specific containing the sites o f Xhol, M lu1 and these sequences m2/ loxp66, lo xp71. T hen the
m2/ lo xp66EGFPlo xp71 fr agment w as subcloned into cloning vecto r pMD18T . The r ecombinant plasmid was iden
tified by sequencing. The results showed that the sites and low mo lecular w eight DNA were successfully introduced .
Key words: DNA recombination Low molecular w eight DNA PCR
DNA 小片段的连接一直是载体构建过程中经常遇到, 但又十分头疼的事。经典的方法是首先合成
DNA 小片段寡核核苷酸单链, 经退火互补后形成双链, 然后酶切回收后连接于载体上。实验过程步骤繁琐、
费时费力,而且 DNA小片段在琼脂糖分离困难, 回收效率低, 一次实验很难成功。因此, DNA 小片段的连
接是一个需要迫切解决的技术问题。
在构建 RMCE( recombinase mediated casset te exchange,重组酶介导的盒式交换)基因打靶载体时,需
要将两个 34bp的 loxp突变体定向连接于报告基因 GFP 的两端, 本研究采用在特异性引物两端加载目的
DNA 小片段的策略, 对目的基因进行 PCR扩增,利用 DNA 聚合酶末尾加 A 的特点, 将 DNA 片段回收后,
导入 T 载体中,经酶切和测序鉴定,实验成功将 DNA 小片段加在目的基因的两端,并获得特异的酶切位点。
具体描述如下:
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 表达载体 pEGFPN1购自 Clontech公司。高保真 ExTaq DNA 聚合酶、DNA 回收试剂盒、pMD18
收稿日期: 20041112
作者简介:张传生( 1976 ) ,山东宁阳人,博士,研究方向:动物遗传育种与生物技术
通讯作者:杜立新( 1956 ) ,陕西华阴人,教授,博士生导师,研究方向:动物遗传育种与生物技术, Email: Lxdu@ 263. n et
生物技术通报
研究报告 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 3期
T 载体、限制性内切酶 X hol、BamH 1、K p n1 、Mlu1均为 T aKaRa公司产品。
1. 1. 2 引物 GFP 引物: GFPR5CACCATGGTGAGCAAGGGCG3 , GFPL 5T TACT TGTA CAGCTC
GT C3加载 Loxp 突变体和酶切位点 EGFP 特异引物: m2/ loxp66EGFP 5A CGCGTT ACCGT TCG
T ATA ATGTA TGCTAT ACGAAGT TAT TT ACTT GTACAGCTCGTCC 3, loxp71EGFP 5CTCGAG
T ACCGT TCGTAT AT GGT TT CTT ATACGAAGTT ATCACCATGGTGAGCAAGGGC3, 上下游引物分
别设计有 M lu1和 Xhol酶切位点, 由上海博亚生物工程公司合成。
图 1 PCR 扩增结果 ( 1. 5%的琼脂
糖)
图 2 阳性质粒酶切鉴定结果
(1. 5%的琼脂糖)
1. 2 方法
1. 2. 1 PCR 扩增和回收目的片段 以
pEGFPN1为模板应用 GFP 引物和加载
Loxp突变体和酶切位点的 GFP 特异引物分
别扩 增 GFP 基 因 和 m2/ loxp66EGFP
Loxp71 DNA 片段。PCR 反应总体积为
25l,其中基因组 DNA 约 50ng , 0. 20M 引
物, 200MdN TPs, 2. 0 mM M gCl2 , 1. 0 U
T aq酶。反应参数为: 95 4 min; 进入以下
循环︰ 95 30s, 55 1 m in , 72 1 m in,
30个循环; 72 延伸 8 min。用 1. 5%琼脂糖凝胶电泳, 紫外检测。按照试剂盒
说明回收目的片段。
1. 2. 2 连接、转化 按常规进行连接反应 [ 1] , 连接对照反应体系不含插入片
段,转化 HB101感受态细菌,于 37 培养 16h。
1. 2. 3 质粒的提取、鉴定 和测序分析 采用常规的碱裂解法 [ 1]提取质粒,应用 BamH1, Kpn1酶切鉴定阳
性克隆,测序由上海博亚生物工程公司完成。序列分析应用 DNAMAN ( 5. 0)进行。
2 结果
2. 1 扩增结果
应用特异引物扩增 GFP 基因和 m2/ loxp66EGFPLoxp71基因片段, 电泳检测。预计引入 lo xp突变体
的 GFP 基因比野生的GFP 基因大 80bp。从图 1中可以看出其 PCR产物略大, 初步判断 Loxp66/ m2EG
FPLoxp77获得成功扩增。
图 3 阳性质粒的部分序列
352005年第 3期 张传生等:应用 PCR技术定向引入 DNA小片段的策略
2. 2 阳性质粒鉴定结果
应用 X hol和M lu1酶切鉴定阳性质粒,结果如图 2所示, 可见 Loxp66/ m2EGFPLoxp77 DN A片段已
经成功连接在 pMD18T 载体上,而且可以看出酶切位点也已经被成功引入。
2. 3 测序结果
对获得阳性质粒测序结果如图 3,表明 DNA小片段 loxp突变体已经成功连接在 GFP 基因两端。
3 讨论
在现代分子生物学研究中, DNA 重组技术是一种非常基础而常用的技术。DNA 重组中经常需要将小
的 DNA 的片段连接于载体上或者加载于目的基因的一端或两端。常规的做法需要合成两条寡核苷酸单
链,经退火后形成双链,用相应的限制性内切酶消化, 电泳回收连接。一般情况下, DNA 小片段在琼脂糖凝
胶难以分离,需要在聚丙烯聚酰胺凝胶中分离,步骤繁琐,而且 DNA 小片段回收效率一般偏低,因此难以操
作[ 1, 2]。
本实验在 GFP 基因上下游引物分别两端加载 34bp的 loxp突变体 m2/ loxp66 和 loxp71寡核苷酸,同
时在引物上设计特异的限制性酶切位点,应用 PCR技术扩增来实现 DNA 双链的合成,利用 DNA 聚合酶末
端加 A 的特点,将目的基因直接克隆于 T 载体中,测序结果表明一次实验实现了加载 DNA 小片段和酶切
位点的两个目的。本实验策略不必合成两条寡核苷酸单链, 可以节省实验费用。同时有避开对 DNA 小片
段的一系列的分子生物学操作,节省了时间。对引入的酶切位点,不必加保护碱基,直接利用载体上的序列
来实现所加的酶切位点的保护。
因此,应用 PCR技术定向的引入 DNA 小片段具有高效、快捷、安全的优点, 避免了传统方法中各种繁
琐复杂的操作过程, 具有十分重要的应用前景。
参 考 文 献
1 J ,萨姆布鲁克, E F弗里奇, T 曼尼阿蒂斯等著.金冬雁, 黎孟枫,侯云德等译校.分子克隆实验指南.北京: 科学出版社, 1993, 19~ 23, 55~
56, 304~ 315.
2 郑敬民,李坚,傅继梁.生物工程学报, 2001, 17( 5) : 566~ 568.
国外动态
腾飞中的印度生物技术产业
Pharmaceutical Business New s 2003年 442期 14 页报道: 印度的生物技术产业已进入爆炸性发展阶
段。统计表明, 印度生物技术产业的年销售额,已从数百万美元猛增至数十亿美元。
根据印度工业联合会( CII)的报告,印度生物技术产业在世界生物技术市场中所占的份额,将从 2002年
的 2%猛升至 2007年的 10% ,销售额将增至 15亿美元(相当于 9亿英镑或 13亿欧元)。预计到 2010年,印
度生物技术产业的销售额,将达 45亿美元。
另据市场分析家 Frost和 Sullivan的报告提示, 到 21世纪 10年代末,印度生物技术产业的市场产值将
达到 67. 5亿美元。Fro st和 Sullivan说,印度将于 2005年实验的对专利权的全面保护政策,已使印度的众
多生物技术公司将其生产发展策略和方向,从生产传统的一般产品转变为开展生物技术产品的研发。
印度政府不仅大力支持印度全部生物技术产业的基础设施,而且已将其对生物技术产业的投资金额,从
1987/ 88年的 150百万美元,提高至 2002/ 03年的 500百万美元。 汪开治
36 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 3期