全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
收稿日期 ： 2014-04-10
作者简介 ：李正，男，硕士研究生，研究方向 ：细菌分类 ；E-mail ：lizheng2014@gmail.com
通讯作者 ：韩素贞，女，博士，副教授，研究方向 ：细菌分类，E-mail ：hansuzhen@vip.sina.com
甘肃酒泉等地区豆科植物根瘤菌的遗传多样性和系统
发育分析
李正 单辉辉 齐雅琳 刘磊 韩素贞
（首都师范大学生命科学学院，北京 100048）
摘 要 ： 采用 16S rDNA PCR-RFLP 和 16S rDNA 全序列分析技术对采集自甘肃酒泉、嘉峪关等 8 个地区的豌豆、菜豆等几个
不同豆科植物根瘤中分离的 53 株供试菌株和 9 株参比菌株进行了遗传和系统发育分析。16S rDNA PCR-RFLP 结果表明，在 77.5%
的相似性水平上全部供试菌株聚成 5 个分支。分支 I 为 Sinorhizhobium-Rhizobium 分支，分支 II 为 Agrorhizobium-Bradyrhizobium 分支，
分支 III 是未知供试菌组成的分支，分支 IV 为 Mesorhizobium 分支，分支 V 为 2 株未知供试菌组成的分支。在 89.8% 的相似性水平上，
分支 I 包括 2 个亚分支 ：亚分支 1 由 CNU1008 等 14 株供试菌组成，与 Sinorhizobium meliloti LISPA1002T 菌株聚在一起 ；亚分支 2
包括 6 株未知菌，与 Rhizobium leguminosarum USDA 2370T 聚在一起。分支 II 包括 3 个亚分支 ：亚分支 1 包括 CNU 1041 等 4 株菌，
与 2 株 Agrobacterium tumefaciens IAM 13129T 和 IAM 13569T 聚在一起 ；亚分支 2 包括 5 株菌，与 Bradyrhizobium japonicum USDA 6T
菌株聚在一起 ；亚分支 3 包括 3 株未知菌。选取各分支和亚分支的代表菌株进行 16S rDNA 测序，结果表明，两种分析方法在结
果上具有较好的一致性。处于分支 I 的 Sinorhizobium 亚分支的菌株，与 S.fredii 和 S.meliloti 的相似性达到 99%，该亚分支菌株的确
切系统发育地位有待于 DNA-DNA 杂交来确定。处于分支 I 的 Rhizobium 亚分支的菌株，与 R.giardinii 的相似性达到 99%，与 R.etli
的相似性为 98%。同样，该亚分支的确切地位有待于 DNA-DNA 杂交来确定。处于分支 II Agrobaterium 亚分支的菌株与 A.rubi 的相
似性达到 99%。处于分支 II Bradyrhizobium 亚分支的菌株，与 B.liaoningense 的相似性达到 99%。
关键词 ： 根瘤菌 16S rDNA PCR-RFLP 分析 16S rDNA 全序列分析
Diversity and Phylogeny of Rhizobium Isolated from Root Nodules of
Legumes in Jiuquan and Other Regions，Gansu
Li Zheng Shan Huihui Qi Yalin Liu Lei Han Suzhen
（College of Life Science of Capital Normal University，Beijing 100048）
Abstract: The 16S rDNA PCR-RFLP and 16S rDNA sequence analysis were used on genetic and phylogeny of 53 strains isolated
from Glycine max, Vicia faba, Pisum sativum and Phaseolus vulgaris of Jiuquan and other regions, Gansu and 9 known strains. Results of 16S
rDNA PCR-RFLP indicated that all isolates included 9 reference strains were clustered into 5 branches at 77.5% similarity. Branch I was
Sinorhizhobium-Rhizobium, branch II Agrorhizobium-Bradyrhizobium, branch III unknown bacteria branch, branch IV Mesorhizobium, and
branch V also unknown branch. Branch I included 2 sub branches at 89.8% similarity ：Sub branch 1 included strains CNU1008 and 14 strains
witch clustered with Sinorhizobium meliloti LISPA1002T, Subbranch 2 included 6 strains which clustered with Rhizobium leguminosarum USDA
2370 T. Branch II included 3 sub branches ：Sub branch 1 included CNU 1041 and other 3 strains witch clustered with 2 strains of Agrobacterium
tumefaciens IAM 13129T and IAM 13569T together, sub branch 2 included 5 strains which clustered with Bradyrhizobium japonicum USDA 6T,
sub branch 3 included 3 unknown strains. Representative strains were selected in the analysis of 16S rDNA sequencing, and the results show
that 16S rDNA PCR-RFLP and16S rDNA sequencing analysis were in good agreement. Strains of Sinorhizobium sub branch of branch I were
clustered with S.fredii and S.meliloti at 99% similarity, and their exact system status should be determined by DNA-DNA hybridization. Strains
of Rhizobium sub branch of branch I were clustered with R.giardinii at 99% similarity and with R.etli at 98% similarity. So the exact position of
2014年第10期 189李正等：甘肃酒泉等地区豆科植物根瘤菌的遗传多样性和系统发育分析
根瘤菌与豆科植物的共生固氮体系是生物固氮
中效率最高的体系，约占生物固氮总量的 65%。该
体系具有固氮能力强、固氮量大、抗逆能力强等特点，
可以提高土壤肥力，对可持续农业的发展具有重要
的意义。
16S rDNA 已被作为一个分子指标，广泛地应用
于各种细菌的遗传特征和分子差异的研究［1］。16S
rDNA PCR-RFLP 在研究根瘤菌的遗传多样性方面因
其简便快捷的特点，应用已较成熟，与 16S rDNA 全
序列分析结果具有很好的一致性［2，3］。
甘肃酒泉、敦煌、嘉峪关、甘谷、麦积山、德隆、
泾川等地区属河西走廊地区，气候干燥寒冷，降水
短缺。这些地区豆科植物根瘤菌种质资源的研究报
道 较 少。 本 研 究 通 过 16S rDNA PCR-RFLP 和 16S
rDNA 全序列分析对这些地区大豆根瘤菌多样性和系
统发育进行研究，旨为这些根瘤菌菌株的应用打下
基础。
1 材料与方法
1.1 材料
将采集自甘肃省河西走廊地区的根瘤用无菌水
浸泡过夜，在无菌操作台上用 95% 乙醇浸泡 5 min，
用 0.1% HgCl2 表面灭菌 5 min，再用无菌水冲洗 6
次，然后用镊子夹碎根瘤，挤出汁液，划线接种于
YMA 培养基，于 28℃培养 3-7 d 后挑取单菌落划线
纯化，进行革兰氏染色并镜检，将革兰氏阴性（G-）
杆菌作为供试菌［4，5］。如表 1，本研究采用 53 株宿
主为豌豆、蚕豆、菜豆等豆科作物的供试菌和 9 株
参 比 菌。 参 比 菌 分 属 于 Sinorhizobium、Rhizobium、
Agrobacterium、Mesorhizobium 和 Bradyrhizobium。
1.2 方法
1.2.1 16S rDNA PCR-RFLP DNA 提取步骤详见参考
文 献［6］。 引 物 P1 为 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA
GAACGAACGCT-3，其序列对应于 E.coli 16S rDNA
基 因 第 8-37 碱 基 位 置 ；P6 为 5-TACGGCTACCTT
GTTACGACTTCACCCC-3， 其 序 列 为 对 应 第 1479-
1506 碱基位置［7］。16S rDNA PCR 步骤详见参考文
献［8］。用 4 种限制性内切核酸酶 Hinf Ⅰ、Msp Ⅰ、
Alu Ⅰ和 Hae Ⅲ对扩增产物进行消化处理，Hinf I 的
酶切位点为 5-G/ATC-3，MspI I 为 5-C/CGG-3，Alu
I 为 5-AG/CT-3、Hae III 为 5-GG/CC-3， 酶 切 体 系
为 30 μL，37℃水浴过夜。酶切产物经 3.0% 琼脂糖
凝胶 100 V 电泳 4 h、UV 扫描后，文件用 TIF 格式保
存［9， 10］。将 4 种酶切图谱做均一化处理之后，把所
得的酶切带型转化为“0”和“1”，即有条带记为“1”，
无条带记为“0”，以平均连锁法（UPGMA）为基础
聚类，通过 NTSYS.2.10 软件进行相似性分析，最后
绘制成 UPGMA 树状图［11］。
1.2.2 16S rDNA 全 序 列 分 析 16S rDNA PCR 扩
增产物交由上海 SanGon 生物工程有限公司进行测
序。将测得序列与 GenBank 中相关根瘤菌已知种序
列，通过 MEGA5.0 中的 ClustalW 进行多序列比对，
采 用 邻 接 法（neighbor joining method）、Kimura two-
parameter 模型通过 MEGA5.0 构建系统发育树，通
过自展值（Bootstrap）1 000 进行置信度检测［12，13］。
同时序列间的相似性也通过该软件加以计算。
1.2.3 BOX-PCR 指纹图谱分析 DNA 提取同 1.2.1。
引 物 序 列 为 BOXA1R ：5-CTA CGG CAA GGC GAC
GCT GAC G-3，扩增过程见参考文献［14］。BOX-PCR
产物经 1.5% 琼脂糖凝胶（含 EB）电泳分离，电泳
条件为 70 V、2-3 h。电泳结束后，在凝胶成像仪中
扫描凝胶，将指纹图谱用 TIFF 文件保存，之后对
BOX-PCR 指纹的电泳图像进行观察比较和分析。
2 结果
2.1 16S rDNA PCR-RFLP聚类分析
16S rDNA 扩 增 产 生 1 500 bp 左 右 大 小 的 片
段，53 株供试菌株和 9 株已知参比菌株扩增产物经
Hinf Ⅰ、Msp Ⅰ、Alu Ⅰ和 Hae Ⅲ 4 种限制性内切核
酸酶酶切，得到电泳图谱（图 1）。
通过分析电泳图谱，得到了树状图（图 2）。由
图 2 可知，在 77.5% 的相似性水平上全部供试菌株
聚 成 5 个 分 支。 分 支 I 为 Sinorhizhobium-Rhizobium
the sub branch waited for DNA-DNA hybridization to determine. Strains of Agrobacterium sub branch of the branch II clustered with A.rubi at the
similarity of 99%. Strains of Bradyrhizobium sub branch of the branch II were clustered with B.liaoningense at the similarity of 99%.
Key words: Rhizobia 16S rDNA PCR-RFLP 16S rDNA sequencing
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期190
分支，分支 II 为 Agrorhizobium-Bradyrhizobium 分支，
分支 III 是 16 株未知供试菌组成的分支，分支 IV 为
Mesorhizobium 分支，分支 V 为 2 株未知供试菌组成
的分支。在 89.8% 的相似性水平上，分支 I 包括 2
个亚分支：亚分支 1 由 CNU1008 等 14 株供试菌组成，
与 Sinorhizobium meliloti LISPA1002T 菌株聚在一起，
涵盖泾川、甘谷、嘉峪关、麦积山、德隆和敦煌等
6 个采样地区，宿主主要是大豆、豌豆、菜豆。亚
分支 2 包括 6 株未知菌，与 Rhizobium leguminosarum
USDA 2370T 聚在一起，分离自酒泉和德隆地区，宿
主为菜豆和蚕豆。分支 II 也包括 3 个亚分支 ：亚
分支 1 包括 CNU 1041 等 4 株菌，分离自德隆、酒
泉和泾川地区，宿主为豌豆、菜豆和大豆，与 2 株
Agrobacterium tumefaciens IAM 13129T 和 IAM 13569T
聚在一起 ；亚分支 2 包括 5 株菌，分离自麦积山、
酒泉、嘉峪关和敦煌等地区，宿主为大豆、蚕豆和
豌 豆， 与 Bradyrhizobium japonicum USDA 6T 菌 株 聚
在一起 ；亚分支 3 包括 3 株菌，分离自甘谷和高平
地区，宿主为大豆和菜豆。分支 III 包括 16 株未知
菌，分离自嘉峪关、甘谷、德隆、麦积山和敦煌地
表 1 供试菌一览表
菌株编号 宿 主 来 源 菌株编号 宿 主 来 源
CNU 1001 Glycine max 嘉峪关 CNU 1032 Phaseolus vulgaris 酒泉
CNU 1002 Glycine max 嘉峪关 CNU 1033 Phaseolus vulgaris 德隆
CNU1003 Glycine max 嘉峪关 CNU 1034 Glycine max 高平
CNU 1004 Glycine max 嘉峪关 CNU 1035 Phaseolus vulgaris 酒泉
CNU 1005 Glycine max 嘉峪关 CNU 1036 Phaseolus vulgaris 酒泉
CNU 1006 Glycine max 嘉峪关 CNU 1037 Glycine max 麦积山
CNU 1007 Glycine max 嘉峪关 CNU 1038 Glycine max 麦积山
CNU 1008 Glycine max 嘉峪关 CNU 1039 Glycine max 泾川
CNU 1009 Glycine max 甘谷 CNU 1040 Pisum sativum 敦煌
CNU 1010 Glycine max 麦积山 CNU 1041 Pisum sativum 德隆
CNU 1011 Glycine max 甘谷 CNU 1042 Pisum sativum 德隆
CNU 1012 Glycine max 敦煌 CNU 1043 Phaseolus vulgaris 敦煌
CNU 1013 Glycine max 泾川 CNU 1044 Vicia faba 德隆
CNU 1014 Vicia faba 德隆 CNU 1045 Pisum sativum 敦煌
CNU 1015 Vicia faba 嘉峪关 CNU 1046 Phaseolus vulgaris 高平
CNU 1016 Glycine max 甘谷 CNU 1047 Glycine max 高平
CNU 1017 Vicia faba 嘉峪关 CNU 1048 Pisum sativum 泾川
CNU 1018 Vicia faba 德隆 CNU 1049 Glycine max 嘉峪关
CNU 1019 Glycine max 敦煌 CNU 1050 Phaseolus vulgaris 嘉峪关
CNU 1020 Vicia faba 嘉峪关 CNU 1051 Pisum sativum 酒泉
CNU 1021 Vicia faba 嘉峪关 CNU 1052 Vicia faba 酒泉
CNU 1022 Vicia faba 嘉峪关 CNU 1053 Phaseolus vulgaris 酒泉
CNU 1023 Vicia faba 嘉峪关 Agrobacterium tumefaciens IAM 13129T 日本
CNU 1024 Glycine max 嘉峪关 Agrobacterium tumefaciens IAM 13569T 日本
CNU 1025 Vicia faba 嘉峪关 Bradyrhizobium japonicum USDA 6T Glycine max 美国
CNU 1026 Phaseolus vulgaris 德隆 Mesorhizobium loti LMG 6125T Glycine max 比利时
CNU 1027 Glycine max 麦积山 Mesorhizobium loti NZP 2234 Lotus corniculatus 新西兰
CNU1028 Phaseolus vulgaris 德隆 Rhizobium leguminosarum USDA 2370T Pisum sativum 美国
CNU 1029 Glycine max 嘉峪关 Mesorhizobium loti NZP 2213T Lotus corniculatus 新西兰
CNU 1030 Glycine max 敦煌 Mesorhizobium plurifarium LMG11892T Biserrula pelecinus 比利时
CNU 1031 Glycine max 麦积山 Sinorhizobium meliloti USDA 1002T Medicago sativa 美国
IAM ：Institute of Applied Microbiology，The University of Tokyo，Tokyo，Japan ；LMG ：Collection of the Laboratorium voor Microbiologie en Microbiele Genetics，
Rijksuniversiteit，B-9000，Gent，Belgium ；USDA ：The United States Department of Agriculture ；NZP ：Division of Scientific and Industrial Research，Palmerston
North，New Zeland
2014年第10期 191李正等：甘肃酒泉等地区豆科植物根瘤菌的遗传多样性和系统发育分析
区，宿主为蚕豆、大豆和菜豆。分支 IV 包括 4 株
Mesorhizhobium 的参比菌。分支 V 包括 2 株未知供
试菌，分离自酒泉和高平地区，宿主为大豆和菜豆。
2.2 16S rDNA全序列测定和系统发育分析
依据 16S rDNA PCR-RFLP 聚类结果，选取各分
支代表菌株 1-3 株进行 16S rDNA 全序列测定，并依
此序列构建了系统发育树状图（图 3）。图 3 显示，
16S rDNA 测序结果与 16S rDNA PCR-RFLP 的结果
基本一致。菌株 CNU 1001、1004、1006 和 1008 处
于分支 I 的 Sinorhizobium 亚分支，与 S.fredii 的相似
性达到 99% ；菌株 CNU 1009 也处于分支 I 的亚分支
1，与 S.meliloti 的相似性达到 99%。该亚分支菌株
的确切系统发育地位有待于 DNA-DNA 杂交来确定。
菌 株 CNU 1014 和 1036 处 于 分 支 I 的 Rhizobium 亚
分支，与 R.giardinii 的相似性达到 99%，而该分支
的另一株菌 CNU 1032 与 R.etli 的相似性为 98%。因
此，该亚分支的确切地位有待于 DNA-DNA 杂交来
确定。处于分支 II Agrobaterium 亚分支的菌株 CNU
1039 和 1041 与 A.rubi 的 相 似 性 达 到 99%。CNU
1031 和 1049 处于分支 II Bradyrhizobium 亚分支，与
B.liaoningense 的相似性达到 99%。从测序结果还可
以看出（图 3），从根瘤中可以分离到非根瘤菌 ：处
于分支 II 亚分支 3 的菌株 CNU 1011、1012 和 1046
属 于 Brevibacillus， 与 B.reuszeri 的 相 似 性 达 到 99%
以上 ；处于分支 III 的菌株 CNU 1016、1028 和 1037
属于 Enterobacter，与 E.aerogenes 的相似性达到 99%
以 上 ；菌 株 CNU 1034 处 于 分 支 V， 与 Candidatus
Roseomonas massiliae 的相似性达到 99% 以上。
2.3 BOX-PCR指纹图谱
分 支 ISinorhizobium 亚 分 支 的 菌 株 CNU 1001、
1004 和 1006 的 16S rDNA 序 列 相 似 性 达 到 100%，
Rhizobium 亚分支的菌株 CNU 1014 和 1036 的相似
性也达到了 100%（图 3）。对这些菌株进行了 BOX-
PCR（图 4）。从图 4 可以看出，它们的 BOX 指纹图
谱不一样，所以不是相同的克隆。
3 讨论
3.1 分离自大豆、蚕豆、豌豆和菜豆等宿主的根
瘤菌有很大的遗传多样性
从甘肃河西走廊地区大豆分离到 26 株菌，经
16S rDNA PCR-RFLP 及序列分析表明，其中 9 株属
于 S. fredii 或 S.meliloti，4 株属于 B.liaolingense，其
余 13 株属于非根瘤菌的 A.rubi、Candidatus Roseom-
onas massiliae、B.reuszeri 和 E.aerogenes。从蚕豆分离
到的 11 株菌，2 株属于 R.giardinii 或 R.etli，1 株属于
B.liaolingense，其余 8 株菌属于非根瘤菌的 E. aerog-
enes。从豌豆分离到的 6 株菌，2 株属于 S. fredii 或
S.meliloti，1 株 属 于 R.giardinii 或 R.etli，1 株 属 于
B.liaolingense，2 株属于非根瘤菌 A.rubi，。从菜豆分
离到的 10 株菌，3 株属于 S. fredii 或 S.meliloti，3 株
属于 R.giardinii 或 R.etli，其余的 4 株属于非根瘤菌
的 A.rubi，B.reuszeri 和 E.aerogenes。可见从这些地区
分离到的大豆等宿主的根瘤菌有较大的遗传多样性。
张 红 侠 等［14］ 采 用 BOX-PCR、16S rDNA PCR-
RFLP、16S-23S IGS PCR-RFLP 和 16S rRNA 基因序列
分析方法对分离自我国黄土高原地区山西、陕西、
宁夏和甘肃 4 个省的 15 个地区的 130 株大豆根瘤
M M M
M M M
M M
M M
左上为 Hinf Ⅰ酶切图谱，右上为 Msp Ⅰ酶切图谱，左下为 Alu Ⅰ
右下为 Hae Ⅲ酶切图谱
图 1 部分菌株 16S rDNA PCR-RFLP 酶切图谱
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期192
CNU 1001
CNU 1002
CNU 1009
Sinorhizobium meliloti USDA 1002T
CNU 1050
CNU 1048
CNU 1045
CNU 1043
CNU 1008
CNU 1003
CNU 1004
CNU 1005
CNU 1006
CNU 1027
CNU 1026
CNU 1036
CNU 1032
Rhizobium leguminosarum USDA 2370T
CNU 1042
CNU 1014
CNU 1044
CNU 1033
CNU 1007
Agrobacterium tumefacieus IAM 13129T
CNU 1041
CNU 1051
Agrobacterium tumefacieus IAM 13569T
CNU 1053
CNU 1039
CNU 1010
Bradyrhizobium japonicum USDA 6T
1
2
1
2
3
CNU 1031
CNU 1052
CNU 1049
CNU 1040
CNU 1013
CNU 1011
CNU 1047
CNU 1046
CNU 1012
CNU 1015
CNU 1016
CNU 1017
CNU 1022
CNU 1023
CNU 1024
CNU 1025
CNU 1020
CNU 1028
CNU 1029
CNU 1038
CNU 1021
CNU 1018
CNU 1019
CNU 1030
CNU 1037
Mesorhizobium loti
Mesorhizobium plurifarm
Mesorhizobium loti
Mesorhizobium loti
CNU 1034
CNU 1035
࠶᭟
I
࠶᭟
II
࠶᭟
III࠶᭟
IV࠶᭟
V0.74 0.74 0.74
Coeffsci
0.94 1.00
图 2 16S rDNA PCR-RFLP 聚类图
2014年第10期 193李正等：甘肃酒泉等地区豆科植物根瘤菌的遗传多样性和系统发育分析
菌及部分参比菌株进行了遗传多样性和系统发育分
析。3 种方法聚类分析结果基本一致，可将所有供
试菌株分为 Sinorhizobium 和 Bradyrhizobium 两大类
群。从系统发育来看，供试的快生大豆根瘤菌为 S.
fredii，慢生大豆根瘤菌为 B. japonicum 和辽宁慢生 B.
liaoningense。从甘肃分离到的 4 株大豆根瘤菌都属
于 S. fredii。Camacho 等［15］认为，S. fredii 是中国大
豆根瘤的优势种。本研究中大豆根瘤菌的遗传和系
统发育分析结果与上述报道基本一致，但表现了更
大的遗传多样性。
路敏琦［16］等采用数值分类、16S rDNA PCR -
RFLP、IGS PCR -RFLP 等方法对分离自我国 11 个省
的 50 株蚕豆根瘤菌及 11 株参比菌株进行了表型测
定、遗传型研究和 16S rDNA 全序列测定。试验结
果表明我国蚕豆根瘤菌具有极大的表型多样性和遗
传多样性，蚕豆根瘤菌的代表菌株均位于 Rhizobium
系 统 发 育 分 支， 与 R. leguminosarum USDA2370 的
全 序 列 相 似 性 达 99. 9%， 说 明 蚕 豆 根 瘤 菌 属 于
Rhizobium，系豌豆根瘤菌的一个生物型。Tian 等［17］
对从江西、安徽等地的蚕豆中分离到的根瘤菌进行
了 16S rRNA 基因的系统发育分析和 atpD 和 recA 基
因序列，表明这些菌株为属于 Rhizobium 的新种，即
CNU1004
CNU1001
CNU1006
Sinorhizobium fredii LMG6217
Sinorhizobium americanum CFNEI
CNU1008
Sinorhizobium kummerowiae CCBAU 71714
Sinorhizobium meliloti IAM 12611
CNU1009
Rhizobium daejeonense L61T
Rhizobium selenitireducens B1
Rhizobium sphaerophysae CCNWGS0238
Rhizobium giardinii RGU86344
CNU1014
CNU1036
CNU1039
CNU1041
Agrobacterium rubi ICMP 11833
CNU1032
Rhizobium etli CFN42
Rhizobium pisi DSM30132
Rhizobium petrolearium SL-1
Bradyrhizobium betae LMG 21987
CNU1031
Bradyrhizobium liaoningense USDA 3622
CNU1049
Candidatus Roseomonas massiliae 1461A
CNU1034
Brevibacillus reuszeri NBRC 15719
CNU1011
CNU1012
CNU1046
CNU1038
Enterobacter aerogenes ATCC 13048
CNU1016
CNU1037
CNU102860
86
89
100
94
100
100
95
94
100
79
100
89
96
99
100
99
100
87
100
95
72
91 100
100
85
94
87
0.02
图 3 16S rDNA 全序列系统发育树状图
M 1001 1004 1006 M M 1036 1014 WI M
图 4 BOX-PCR 指纹图谱
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期194
Rhizobium fabae。本研究中分离自蚕豆的根瘤菌 2 株
属于 R.giardinii 或 R.etli，确切地位需要 DNA-DNA
杂交试验来确定，但有 1 株菌属于 B.liaolingense，
这一结果尚属首次报道。
从 豌 豆 上 分 离 的 菌 株 只 有 一 个 种， 即 R.
leguminosarum。 杨 成 运 等［18］ 利 用 16S rRNA PCR-
RFLP、16S rRNA 基因序列分析以及 16S-23S rRNA
IGS PCR-RFLP 对分离自我国江苏盐城、浙江温州、
湖北仙桃及重庆等亚热带地区的 42 株分离自豌豆的
根瘤菌进行了群体遗传多样性的研究。结果表明，
40 株菌属于 R.leguminosarum USDA2370，2 株菌与
R. etli CFN42 相近。本研究与上述报道有相似之处，
即从豌豆分离到的 6 株菌中，1 株属于 R.giardinii 或
R.etli，但是其余 5 株菌中，有 2 株属于 S. fredii 或
S.meliloti，2 株属于 A.rubi，1 株属于 B.liaolingense，
同样显示了很大的遗传多样性。
从 菜 豆 中 分 离 的 根 瘤 菌 分 属 于 Rhizobium、
Sinorhizobium 和 Burkholderia，已确定了 13 个种，表
现了极大的多样性［19，20］。本研究中分离到的菜豆根
瘤菌 3 株属于 S. fredii 或 S.meliloti，3 株属于 R.giardinii
或 R.etli。
3.2 从甘肃河西走廊采集的根瘤中存在非共生的
内生菌
从 1957 年开始就发现根瘤中存在除根瘤菌以
为的其他微生物类群［21］，Muresu 等［22］对这方面的
研究进行了总结，提出了根瘤内生菌的概念。不同
豆科植物根瘤内的非共生内生菌种类并不完全相同，
报道比较多的是 Bacillus、Pseudomonas、Enterobacter
和 Klebsiella 等。在菜豆根瘤中，Mhamdi 等［23］ 发
现除了根瘤菌，Agrobacterium 被证实通过与根瘤菌
共接种，可以侵入新的根瘤，并影响它们的接瘤特
性［24］。邓振山等［25］从我国西北地区采集的苦马豆
根瘤中分离并获得 65 株根瘤内生菌，通过基于 16S
rDNA 全序列分析表明，这 65 株菌分别归属于 3 个
不同的门 ：变形菌门（Proteobacteria，G-菌）、放线
菌门（Actinobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes，G+ 菌），
并表现出丰富的遗传多样性。在变形菌门中有 4 个
菌 株 属 于 α-变 形 菌 纲（Paracoccus、Sphingomonas、
Inquilinus）；11 个 属 于 γ-变 形 菌 纲（Pseudomonas
和 Serratia）；6 个 菌 株 分 别 归 属 于 放 线 菌 门 中 的
Mycobacterium、Nocardia 和 Streptomyces ；有 45 株分
别归属于厚壁菌门中的 Paenibacillus、Brevibacillus、
Staphylococcus、Lysinibacillus 和 Bacillus。
本研究从大豆、蚕豆和菜豆中分离到了非共生
内生菌。从大豆根瘤中分离到的非共生内生菌 13 株，
属于 A.rubi、Candidatus Roseomonas massiliae、B.reuszeri
和 E.aerogenes。 从 蚕 豆 根 瘤 中 分 离 到 的 8 株 菌 是
E. aerogenes，从菜豆根瘤中分离到的 4 株菌属于
A.rubi、B.reuszeri 和 E.aerogenes。 其 中，Candidatus
Roseomonas massiliae 目前未见报道。
根瘤内生菌可能随着根瘤菌的侵染而进入植物
根部，并最后出现在植物根瘤内。当内生菌与根瘤
菌共同接种时，促进了其生长，从而也有利于植物
的生长，能否也扩大宿主范围到非豆科植物有待于
进一步研究［25］。
4 结论
16S rDNA PCR-RFLP 及 16S rDNA 全 序 列 分
析 表 明， 其 中 9 株 属 于 S. fredii 或 S.meliloti，4 株
属 于 B.liaolingense， 其 余 13 株 属 于 非 根 瘤 菌 的
A.rubi、Candidatus Roseomonas massiliae、B.reuszeri
和 E.aerogenes。 从 蚕 豆 分 离 到 的 11 株 菌，2 株 属
于 R.giardinii 或 R.etli，1 株 属 于 B.liaolingense， 其
余 8 株菌属于非根瘤菌的 E. aerogenes。从大豆分离
到的 6 株菌，2 株属于 S. fredii 或 S.meliloti，1 株属
于 R.giardinii 或 R.etli， 1 株属于 B.liaolingense，2 株
属于非根瘤菌 A.rubi，。从菜豆分离到的 10 株菌，3
株属于 S. fredii 或 S.meliloti，3 株属于 R.giardinii 或
R.etli，其余的 4 株属于非根瘤菌的 A.rubi，B.reuszeri
和 E.aerogenes，显示丰富的遗传多样性。
BOX-PCR 指 纹 图 谱 研 究 表 明，CNU1001、
CNU1004 和 CNU1006 三者并非同一菌株的克隆 ；
CNU1036 和 CNU1014 确定为贾氏根瘤菌（R.giardinii）
的两个不同的菌株。
参 考 文 献
［1］ 杨雪颖 , 张执欣 , 杨亚珍 , 等 . 甘草根瘤菌的 16S rDNA 全序列
测定及系统进化分析［J］. 西北植物学报 , 2006, 26（4）：707-
711.
2014年第10期 195李正等：甘肃酒泉等地区豆科植物根瘤菌的遗传多样性和系统发育分析
［2］ Gaunt MW, Turner SL, Rigottier GL, et al. Phylogenies of atpD and
recA support the small subunit rRNA-based classification of rhizobia
［J］. Int J Syst Evol Microbiol, 2001, 6（51）：2037-2048.
［3］ Vandamme P, Pot B, Gillis M, et al. Polyphasic taxonomy, a
consensus approach to bacterial systematics［J］. Microbiological
Reviews, 1996, 2（60）：407-438.
［4］ Wei GH, Gong MF, Lv SQ. Rhizobia in pamirs plateau of China ：
Investigation of symbiotic resources with leguminous plants［J］.
Acta Bot Boreal, 2005, 25（8）：1618-1622.
［5］ 林万明 . 分析微生物学专辑［M］. 北京 ：科学出版社 , 1988 ：
88-89.
［6］ Chen WP, Kuo TT. A simple and rapid method for the preparation of
gram-negative bacterial genomic DNA［J］. Nucleic Acids Research,
1993, 21（9）：2260.
［7］ Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, et al. 16S Ribosomal DNA
amplification for phylogenetic study［J］. J Bacteriol, 1991, 173（2）：
697-703.
［8］ van Berkum P, Beyene D, Eardly BD. Phylogenetic relationships
among Rhizobium species nodulating the common bean（Phaseolus
vulgaris L.）［J］. Int J Syst Evol Microbiol, 1996, 46（1）：240-
244.
［9］ Laguerre G, Allard M, Revory F, et al. Rapid identification of rhizo-
bia by restriction fragment length polymorphism analysis of PCR-
amplified 16S rRNA genes［J］. Appl Environ Microbiol, 1994, 60
（1）：56-63.
［10］ 李俊 , 樊蕙 , 李力 , 等 . 慢生根瘤菌交叉结瘤及其系统发育关
系的研究［J］. 应用与环境生物学报 , 2003, 9（1）：59-62.
［11］ 毕江涛 , 贺达汉 , 韦革宏 , 等 . 沙冬青根瘤菌遗传多样性和系
统发育分析［J］. 西北植物学报 , 2009, 29（4）：0695-0703.
［13］ Jukes TH, Cantor CR. Evolution of protein molecule［M］//Munro
HN. Mammalian protein metabolism. New York ：Academic Press,
1969 ：21-132.
［14］ 张红侠 , 冯瑞华 , 李俊 . 黄土高原地区大豆根瘤菌的遗传多样
性和系统发育［J］. 微生物学报 , 2010, 50（11）：1466 -1473.
［15］ Camacho C, Santanaria C, Temprano F, et al. Soils of the China
Hubei province show a very high diversity of S.fredii strains［J］.
Sys Apl Microbiol, 2002, 25 ：592-602.
［16］ 路敏琦 , 李俊 , 姜昕 , 等 . 我国蚕豆根瘤菌的多样性和系统发
育研究［J］. 应用与环境生物学报 , 2007, 13（1）：73-77.
［17］ Tian CF, Wang ET, Wu LJ, et al. Rhizobium fabae sp. nov., a bacte-
rium that nodulates Vicia faba［J］. Int J Syst Evol Microbiol, 2008,
58（12）：2871-2875.
［18］ 杨成运 , 杨江科 , 李友国 , 等 . 我国亚热带地区豌豆根瘤菌遗
传多样性的研究［J］. 中国科学 C 辑：生命科学 , 2008, 38（8）：
774 -782.
［19］ Mnasri B, Saidi S, Chihaoui S, et al. Sinorhizobium americanum
symbiovar mediterranense is a predominant symbiont that nodulates
and fixes nitrogen with common bean（Phaseolus vulgaris L.）in
a Northern Tunisian field［J］. Syst Appl Microbiol, 2012, 35 ：
263-269.
［20］ Aserse AA, Räsänen LA, Assefa F, et al. Phylogeny and genetic
diversity of native rhizobia nodulating common bean（Phaseolus
vulgaris L.）in Ethiopia［J］. Syst Appl Microbiol, 2012, 35 ：
120-131.
［21］ Philipson MN, Blair ID. Bacteria in clover root tissue［J］. Can J
Microbiol, 1957, 3（2）：125-129.
［22］ Muresu R, Polone E, Sulas L, et al. Coexistence of predominantly
nonculturable rhizobia with diverse, endophytic bacterial taxa
within nodules of wild legumes［J］. FEMS Microbiology Ecology
Ecology, 2008, 63（3）：383-400.
［23］ Mhamdi R, Mrabet M, Laguerre G, et al. Colonization of Phaseolus
vulgaris nodules by Agrobacterium-like strains［J］. Can J Micro-
biol, 2005, 51（2）：105-111.
［24］ Mrabet M, Mnasri B, Romdhane S, et al. Agrobacterium strains isola-
ted from root nodules of common bean specifically reduce nodulation
by Rhizobium gallicum［J］. FEMS Microbiol Ecol, 2006, 56（2）：
304-309.
［25］ 邓振山 , 李军 . 豆科植物根瘤中非共生的内生菌遗传多样性
研究进展［J］. 微生物学杂志 , 2012, 32（4）：63-68.
（责任编辑 李楠）