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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第12期
核桃属于胡桃科核桃属落叶乔木，学名胡桃
（Juglans regia L.）。我国核桃资源丰富，栽培历史长
达两千多年，山西、河北、河南、山东、陕西、甘肃、
青海及新疆南部多有栽培。目前，我国核桃种植面
积达到 3 175 万 hm2，产量近 50 万 t，种植总面积、
产量居世界第一位。然而，核桃果实采收后，如果
大量的青皮在田间、地头或沟边堆放，会严重污染
收稿日期 ： 2014-03-12
基金项目 ：山西省教育厅高校科技研究开发项目和高新技术产业化项目（201206），山西省高等学校大学生创新创业训练项目（2013380），
吕梁学院自然科学校内基金项目（ZRXN201311），吕梁学院校级大学生创新创业训练项目（CXCYZD201312）
作者简介 ：杨卫民，男，教授，研究方向 ：植物资源可持续开发与利用 ；E-mail ：yangweimin0318@sina.com
核桃青皮废弃物中木霉菌的分离及其适应性研究
杨卫民  冉翠香  高兴盛  师亚波  赵林芳
（吕梁学院生命科学系，吕梁 033001）
摘 要 ： 核桃果实采摘及加工过程中产生有毒有害物质的青皮遗弃物问题已经引起社会的关注。以核桃青皮为原料，湿热
灭菌（温度 121℃，时间 30 min）后让其自然霉变，从中分离出滋生菌株，结合反证试验获得优势菌种。并通过检测霉变前后青
皮中主要营养物质含量的变化对该菌种的适应性等进行研究。结果显示，从核桃青皮中分离出 4 株菌株，经鉴定分别为黄曲霉
（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、青霉（Penicillium）和木霉（Trichoderma spp.），其中木霉属菌株是优势菌种。霉变
前后青皮营养物质变化情况为可溶性糖、脂肪、蛋白质和纤维素含量分别减少了 6.03%、2.97%、7.68% 和 64.7%。木霉菌对核桃
青皮有良好的适应性和分解效果，可开发为生物肥料和新型生物杀菌剂。
关键词 ： 核桃青皮 优势菌种 木霉菌 生物杀菌剂
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.025
Research on Isolation of Trichoderma from Waste of Walnut Peel and
Adaptability
Yang Weimin Ran Cuixiang Gao Xingsheng Shi Yabo Zhao Linfang
（Department of Life Science，Lüliang University，Lüliang 033001）
Abstract: The peel derelict of hazardous substances from walnut fruit picking and processing has given a rise to the concern around the
world. Walnut peel was used as the raw material and was left to mildew after its moist heat sterilization（temperature 121℃, 30 min）treatment,
and then breeding strains were isolated from the walnut peel. The dominant species were to be gained through disproveal experiments, and
adaptability of the species through detection changes in the main nutrient content of the peel around the mildew was researched . The results
showed that the four walnut strains were isolated, which fall into Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Penicillium and Trichoderma. Trichoderma
strains is the most dominant strain among all the strains. The change of peel nutrients after mildew as follows ：soluble sugar content decreases
by 6.03%, fat content decreases by2.97% ；proteins decreases by 7.68%, cellulose content decreases by 64.7%. In a conclusion, Trichoderma is
adaptable to walnut peel and has decomposition effects, and can be developed as a new bio-fertilizers and biocides.
Key words: Walnut peel Dominant strain Trichoderma Biological fungicide
生态环境，危及动植物的生存［1］。如果对其加以利用，
不仅可以防止环境污染，还可以增加果农的经济
收入。
核桃青皮为核桃外部的一层厚厚的绿色果皮，
俗称“青龙衣”。青龙衣苦、涩、平，古代诸家多以
其清热解毒、祛风疗癣、止痛止痢功效入药［2］。现
代研究表明，核桃青皮中每种有机化合物成分的作
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期154
用各有不同，经过溶剂浸提所得混合物可直接用于
制作药物、提取色素及制做农药等方面［3］。自 1985
年许绍惠等［4］首次从胡桃青皮废弃物中分离提纯出
胡桃醌以来，国内外对胡桃青皮的化学成分研究取
得了一定的进展。研究显示，胡桃果皮中化学成分
有 39 种挥发油和 7 种脂肪酸，结果显示挥发油占
79.09%、脂肪酸占 19.02%，其中的挥发油有烃类（26
种、71.80%）、酮类（3 种、10.83%）、醇类（6 种、
7.96%）、呋喃类（1 种、5.79%）、酚类（1 种、1.99%）、
肟类（1 种、0.95%）、酯类（1 种、0.71%）七大类
化合物。目前，国内外对胡桃青皮成分以及在医学、
农业等方面的研究已经有较多的报道。但在自然条
件下，核桃青皮是如何被土壤微生物分解、转化的
研究未曾见报道。本研究以核桃青皮为原料，高温
处理后让其自然霉变，从中分离出滋生菌株，结合
反证试验获得优势菌种，并通过检测霉变前后青皮
中主要营养物质含量的变化对该菌种的适应性等进
行研究，旨在为利用木霉菌开发为生物肥料和新型
生物杀菌剂提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 核桃青皮取于吕梁本地。
1.1.2 试剂 浓硫酸、无水乙醇、乙酸、乙酸乙酯、
葡萄糖、纤维素、氢氧化钠、石油醚（以上均为分
析纯）、浓磷酸、95% 乙醇、考马斯亮蓝 G250、蒽酮、
牛血清蛋白、30% 过氧化氢、琼脂粉、马铃薯。真
菌 DNA 提取试剂盒、UNIQ-10 柱式 PCR 产物纯化
试剂盒、100 bp plus DNA ladder buffer、2×Taq PCR
MasterMix、MgCl2、ITS1、ITS4、pMD18-T vector、
10×Ligation Buffer、50% PEG4000、T4 DNA ligase、
质粒 DNA 提取试剂盒，均购于上海生物工程有限
公司。
1.1.3 仪器 恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限
公司）、SHB-III A 循环水式多用真空泵（郑州长城
科工贸有限公司）、RE-52A 型旋转蒸发器（巩义市
予华仪器有限责任公司）、DZF-3 型真空干燥箱（上
海福玛实验设备有限公司）、KA-1000 型离心机（北
京谱析通用仪器有限公司）、VIS-723N 可见分光光
度计（北京瑞利分析仪器公司）、SZF-06A 粗脂肪测
定仪（上海新嘉电子有限公司）、DFY-5/40 低温恒
温反应浴（巩义市予华仪器有限责任公司）、SPX-80
生化培养箱（上海跃进医疗器械厂）、FM-智能生化
培养箱（上海福玛实验设备有限公司）、XH300B-微
波超声波组合合成 / 萃取仪（北京祥鹄科技发展有
限公司）、LDZX-40 Ⅱ -立式自动电热压力蒸汽灭菌
器（上海申安医疗器械厂）、SMART-生物显微镜（重
庆奥特光学仪器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 菌种分离纯化、鉴定和染菌 青皮处理 ：取
核桃青皮于通风处阴干至材料发脆，放入恒温箱内
（40-45℃）烘干，磨碎，过 100 目筛，装入玻璃容
器中备用。
1.2.1.1 菌种自然培养 取 5 g 核桃青皮粉于 5 个培
养皿中，分别加入一定量的超纯水，振荡，至膏状。
于 28℃恒温培养 1-4 周，直至有菌发生为止。
1.2.1.2 菌种分离纯化 取马铃薯 200 g，葡萄糖 20
g，琼脂粉 15 g，纯净水 1 000 mL，pH 自然。培养
基经 121℃、30 min 灭菌。冷却后置于 37℃恒温箱
内培养 24 h。挑取的微生物单菌落，移到 PDA 培
养基上，于 28℃生化培养箱中恒温倒置培养 5-7 d，
期间不断进行菌落、菌体形态镜检观察。若菌落菌
体不纯，混有杂菌时可将平板上长出的菌落上的孢
子，用接种针挑取少许再转接于 PDA 培养基上培养，
直至菌体纯化为止，以便于观察菌落、菌体形态，
进行分类鉴定［5］。已纯化的菌种 4℃冰箱中保存
备用。
1.2.1.3 菌种形态观察 分别用于肉眼和显微镜直
接观察平板上所占的菌落大小、颜色、质地疏松程度、
外观生长状况等。取载玻片加纯水一滴（若所观察
菌体无色，则滴加染液），用接种针挑取一小块微生
物培养物，置于纯水中，用两支接种针将培养物撕
成小块，然后加盖玻片。如有气泡，可在酒精灯上
加热排除。此操作应在接种箱内进行，以免孢子飞扬。
显微镜下观察菌体的菌丝形态、孢子形态、孢子产
生方式和排列特征等。根据菌落菌体形态观察结果，
以《真菌鉴定手册》［6］和《常见与常用真菌》［7］中
的描述对分离纯化出的微生物进行初步鉴定。
1.2.1.4 菌 种 ITS 序 列 测 定 菌 种 总 DNA 提 取 ：
2014年第12期 155杨卫民等：核桃青皮废弃物中木霉菌的分离及其适应性研究
取培养 5 d 后的菌丝，用 CTAB 法提取和纯化基因
组 DNA。rDNA ITS 的扩增与序列测定 ：采用引物
ITS1/ITS4 进行扩增，PCR 反应体系总体积 25 μL，
反 应 液 为 ：BSA 2.5 μL ；10×PCR buffer 2.5 μL，25
mmol/L MgCl2 25 μL，2.5 mmol/L
dNTP 1.8 μL，5 U/μL
Taq 酶 0.15 μL，模板 DNA 3 ng，引物 ITS1 和 ITS4
各 1 μL（25 μmol/L），加 ddH2O 总体积达到 12.05 μL
后进行扩增。扩增条件 ：94℃预变性 3 min ；94℃
变 性 1 min，55℃ 退 火 1 min，72℃ 延 伸 1 min， 共
35 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。序列测定委托
生工生物工程（上海）股份有限公司测序。rDNA-
ITS 序 列 在 NCBI 网 站（http ：//blast. ncbi. nlm. nih.
gov/Blast. cgi）中的相关序列的 ITS 区进行同源性
比较。
1.2.1.5 核桃青皮培养基的制备［8］ 将已经过表面
灭菌的培养皿中分别加入 5 g 备用的核桃青皮，加
一定量的超纯水，将之制成膏状。以 25 g 为一组放
入高压蒸汽灭菌器中，121℃、30 min 灭菌。将已灭
菌培养基冷却后置于 37℃恒温箱内培养 24 h，若无
菌生长，则放入冰箱保存备用。
1.2.1.6 菌悬液制备 将分离纯化得到的各菌株编
号，然后分别接种在液体培养基中，28℃恒温培养
24 h。
1.2.1.7 核桃青皮培养基染菌 将制备的菌悬液污
染无菌核桃青皮培养基，每菌株制作 6 组，并设一
对照组，之后，置于 28℃生化培养箱中培养。每日
观察培养皿中是否出现原接种的菌株。
1.2.2 青皮培养基化学成分的测定
1.2.2.1 可溶性糖含量的测定（蒽酮比色定糖法）
标准曲线的配制 ：蒽酮试剂（2 g 蒽酮溶于 1 000 mL
体积分数为 80% 的硫酸中，当日配制使用），标准
葡萄糖溶液（0.1 mg/mL）（表 1），沸水浴中煮沸 10
min，取出，自来水冷却，室温放置 10 min，620 nm
处比色。
表 1 蒽酮比色定糖法标准曲线的试剂的制备
试剂
编号
0 1 2 3 4 5 6 7 8
标准葡萄糖溶液（mL） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
蒸馏水（mL） 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2
蒽酮试剂（mL） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
样液的制备 ：称取备用核桃青皮 2 g 加入蒸馏
水 50 mL 超声波微波辅助提取，温度 80℃，微波功
率 400 W，提取时间 9 min（间歇处理 ：处理 3 min，
冷 却 3 min）， 然 后， 将 样 液 经 4 000 r/min 转 速 离
心 10 min，取上清液抽滤，将滤液定容至 100 mL，
备用［9］。
样品含量的测定 ：精密量取 4 mL 供试溶液 5
份，分别置于 25 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀。
分别精密量取上述溶液 1 mL 于具塞试管中，置于冰
水浴中 5 min，并分别加入蒽酮试剂 4 mL，然后在
沸水浴中加热 10 min，之后用自来水冷却。以蒸馏
水加蒽酮试剂为对照，在波长 620 nm 处测定吸光度。
按标准曲线方程计算样品中糖的含量。
1.2.2.2 青皮培养基脂肪含量的测定（Soxhlet 抽提
法） 将洗净的抽提瓶用铅笔在磨口处编号，103-
105℃烘 2 h，取出后置于干燥器内冷却、称重，并
记为 A。取 1 kg 核桃青皮 103-105℃烘 2 h，取出后
置于干燥器内冷却备用。称取干样 1 g，装入事先准
备的滤纸包中，脱脂棉线包好，置于抽提器底部。
在抽提瓶内加入石油醚，恒温水浴加热回流 8 h。水
浴温度控制在 70-80℃（以 120-150 滴/min 为宜）。
提取完毕，收集石油醚，置 103-105℃烘箱中烘 30
min，冷却至室温，称重，并记为 B。由抽提瓶增加
之重量计算样品的脂肪含量。
1.2.2.3 青皮培养基蛋白质含量的测定 标准曲线
的绘制 ：0.9% NaCl 溶液，标准蛋白液（0.1 mg/mL
牛血清蛋白），考马斯亮蓝 G250（0.01%）（表 2），
摇匀，室温静置 3 min，于波长 595 nm 处比色。样
液的制备 ：称取备用核桃青皮干燥样品 0.5 g 加少量
石英砂用 0.9% NaCl 溶液研磨成匀浆定容至 100 mL，
静置 10-30 min（3-5 min 摇动 1 次）后过滤（加活
性炭脱色），滤液定容至 100 mL 备用［10］。样品含
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量的测定 ：分别精密量取 1 mL 供试溶液及 4.0 mL
考马斯亮蓝染液于 5 支试管中，摇匀，室温静置 3
min，于波长 595 nm 处测定吸光度。按标准曲线方
程计算样品中蛋白质的含量。
1.2.2.4 青皮培养基纤维素含量的测定 标准曲线
的绘制 ：0.1 mg/mL 纤维素标准液，2% 蒽酮，浓硫
酸（表 3），摇匀，静置 12 min，620 nm 处比色。核
桃青皮纤维素获取 ：精确称取 5 g 核桃青皮粉于磨
口锥形瓶中，按料液比 120（m/V）加入已调至
pH1.5 的蒸馏水，置 85℃的水浴锅中不断搅拌，提
取 2.5 h，2 层纱布抽滤，滤渣用 pH1.5 的蒸馏水洗
涤 3 次， 保 留 滤 渣。 将 滤 渣 按 料 液 比 120 浸 于
6% 的氢氧化钠中，室温条件下放置 20 h，适当搅
拌。将浸泡过的物料过滤，滤渣洗至中性。然后加
等量 10% 过氧化氢溶液并用 50% 乙酸溶液调节 pH
至 4.5-5.0，30℃恒温放置 30 min，冷却至室温过滤。
将所得滤渣水洗至中性，再用 50% 酒精洗涤，60℃
干燥，得纤维素［11］。
样液的制备 ：准确称取纤维素 0.2 g 于烧杯中，
置于冷水浴中，加入 60% H2SO4 溶 60 mL，并消化
30 min，然后将消化好的纤维素溶液转入 100 mL 容
量瓶，用 60% H2SO4 定容至刻度，摇匀后用布氏漏
斗过滤。
样液的测定 ：取上述滤液 5 mL 放入 100 mL 容
量瓶中，在冷水浴上加蒸馏水稀释至刻度，摇匀后
使用。分别精确量取溶液 2 mL 于 5 支具塞试管中，
再分别加 0.5 mL 2%蒽酮试剂，并沿试管壁加 5 mL
浓 H2SO4，塞上塞子，摇匀静置 12 min，然后在 620
nm 波长下测吸光度，按标准曲线方程计算样品中纤
维素的含量。
2 结果
2.1 青皮中微生物种类特征
从核桃青皮中分离纯化得到 4 株菌株，分别编
号 为 HTQP-1、HTQP-2、HTQP-3、HTQP-4。4 株 菌
株的共同特征是菌落干燥、大而疏松或大而致密、
不透明，菌落颜色各不相同，在 PDA 培养基上菌落
正反面颜色不同，细胞生长速度较快。
2.1.1 核桃青皮微生物的形态学特征 核桃青皮
微生物的分离纯化后，将其菌种保存于 PDA 培养
基，并对菌株的菌落形态和显微结构的观察和记录
（表 4，图 1）。
2.1.2 菌种鉴定 根据菌株培养特性、形态特征
及 ITS 基因序列同源性对比等进行综合分析，参考
有关资料认为 HTQP-1 为黄曲霉，HTQP-2 为青霉，
HTQP-3 为 黑 曲 霉，HTQP-4 为 木 霉。 具 体 情 况 见
表 5。
2.1.3 青皮微生物反证试验结果及分析 将上述
4 株 菌 株 进 行 微 生 物 反 证 试 验， 结 果（ 表 6） 显
示。黄曲霉（HTQP-1）、青梅（HTQP-2）、黑曲霉
（HTQP-3）和木霉（HTQP-4）菌株均在青皮培养基
上出现，说明这 4 株菌株不是污染性的杂菌，但每
种菌株出现时间和生长速度差异明显。结合它们在
青皮培养基上的生长状况，可判断木霉（HTQP-4）
是核桃青皮微生物中的优势菌种（图 2）。
2.1.4 基于核桃青皮培养基的木霉菌培养 木霉菌
在核桃青皮培养基上生长迅速，4 d 后有一般菌丝转
绿，6 d 后全部菌丝转绿，布满培养皿，菌丝末端产
生大量的绿色孢子（图 3）。本次培养的木霉菌纯度，
长势都较好，便于常规方法进行扩繁及保存。
表 2 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度标准曲线试剂的制备
试剂
编号
1 2 3 4 5 6 7
标准蛋白液（mL） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8
0.9%NaCl（mL） 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2
考马斯亮蓝染液（mL） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
表 3 纤维素测定标准曲线试剂的制备
试剂
编号
1 2 3 4 5 6
纤维素标准液（mL） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
蒸馏水（mL） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
2% 蒽酮（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
浓硫酸（mL） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
2014年第12期 157杨卫民等：核桃青皮废弃物中木霉菌的分离及其适应性研究
2.2 优势菌种青皮培养基营养成分的测定
2.2.1 可溶性糖含量测定结果及分析 葡萄糖标准
曲线如图 4 所示 ；样品可溶性总糖含量测定结果见
表 7 ；试验前后核桃青皮培养基总糖浓度的差值平
A B C D
A B C D
图 1 HTQP-1（A）、HTQP-2（B）、HTQP-3（C）和
HTQP-4（D）的菌落及菌体
表 6 核桃青皮微生物反证试验结果
菌株编号 28℃下核桃青皮培养基上菌落出现时间（d） 1 周后生长情况
HTQP-1 7-8
生长缓慢。在幼小而活力旺盛时，菌丝体产生大量的分生孢子梗。孢子呈绿、黄、橙、
褐、黑等颜色。
HTQP-2 5-6
生长状况良好。菌丝呈黑褐色，顶囊大球形，小梗双层，分生孢子为球形，呈黑、
黑褐色，平滑或粗糙。菌丝发达，多分枝。
HTQP-3 7-8
生长缓慢。营养菌丝体无色、淡色或具鲜明颜色。菌丝有横隔，分生孢子梗有横隔，
光滑或粗糙。其分生孢子梗经过多次分枝，形如扫帚，称为帚状体。
HTQP-4 2-3
布满整个培养基，生长状况最好。呈不定型棉絮状或致密丛束状，其表面的颜色多
呈绿色。分生孢子多为卵圆形，无色或绿色，簇生于小梗顶端（图 2）。
A B
C D
图 2 核桃青皮培养基上的 HTQP-4
表 4 PDA 培养基上菌落及菌体形态
菌株编号 28℃下 PDA 培养基上菌落出现时间（d） 主要特征
HTQP-1 1-2 菌落疏松，初为白色，后中间呈鲜明的黄绿色，边缘白色 ；菌丝体由无横隔的分枝菌丝
构成，无色 ；PDA 培养基上菌座分生孢子梗顶端膨大成顶囊，顶囊球形或半球形，顶
囊表面生辐射状小梗，小梗顶端分生孢子串生，分生孢子球形或椭圆形（图 1-A）。
HTQP-2 1-2 菌落致密，初为白色，后深灰泛绿色，年轮样生长，扁平，较薄 ；菌落背面浅黄色，无
液体渗出，有霉味 ；营养菌丝体无色，有横隔，分生孢子梗顶端形成帚状枝，分生孢子
球形，呈蓝绿色（图 1-B）。
HTQP-3 1-2 菌落疏松，初为白色，后为黑色 ；菌丝体由无横隔的分枝菌丝构成，无色 ；分生孢子头
呈黑色，分生孢子梗顶端膨大成顶囊，顶囊球形或半球形，顶囊表面生辐射状小梗，小
梗顶端分生孢子串生，分生孢子球形或椭圆形（图 1-C）。
HTQP-4 1-2 菌落较疏松，菌丝发达，菌丝初期白色致密，菌落初为白色，后中心初为浅绿色，之
后依次为灰黄色、灰绿色、深灰绿色，最终白色边缘消失，整个菌落呈深灰绿色 ；PDA
培养基上菌座依次为无色、乳黄色、棕黄色 ；菌丝体无色，分支多似树枝状，有隔膜 ；
分生孢子无色或浅绿色，椭圆形、卵形或圆形（图 1-D）。
表 5 核桃青皮微生物的初步鉴定
分类单元
纲 目 科 属 种
丝孢纲 丛梗孢目 丛梗孢科 曲霉属 （HTQP-1）黄曲霉
（HTQP-3）黑曲霉
木霉属 （HTQI-4）木霉
散囊菌纲 散囊菌目 发菌科 青霉属 （HTQP-2）青霉
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图 3 木霉菌在核桃青皮培养基生长情况
图 4 葡萄糖标准曲线
0.10
0
-0.1
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
O
D
y=1.0293x-0.0224
R2=0.9941
0.8
0.9
0.2 0.3 0.4㪑㨴㌆⎃ᓖmg/mL0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
表 7 样品可溶性总糖含量
编号 1 2 3 4 5 平均值 总糖含量（mg/mL）
试验前（OD） 0.732 0.736 0.731 0.740 0.735 0.7348 0.7356
试验后（OD） 0.530 0.526 0.532 0.531 0.528 0.5294 0.5426
表 8 样品脂肪含量
编号 1 2 3 差值平均值 百分含量（%）
试验前
106.8656 117.2807 119.2407
106.9173 117.3321 119.2928 0.0517 5.17
差值 0.0517 0.0514 0.0521
试验后
128.9441 112.2395 108.3818
128.9665 112.2612 108.4037 0.0220 2.20
差值 0.0224 0.0217 0.0219
表 9 样品蛋白质含量
编号 1 2 3 4 5 平均值 蛋白质含量（mg/mL）
试验前（OD） 0.732 0.736 0.729 0.733 0.732 0.7324 1.3864
试验后（OD） 0.536 0.530 0.526 0.533 0.529 0.5308 1.0024
表 10 样品纤维素含量测定结果
编号 1 2 3 4 5 平均值 纤维素含量（mg/mL）
试验前（OD） 0.077 0.073 0.069 0.0801 0.075 0.07482 0.1349
试验后（OD） 0.032 0.038 0.033 0.035 0.029 0.03340 0.0702
均值为 0.193 0 mg/mL，试验前后核桃青皮培养基总
糖含量差值（H）为 6.03%。
2.2.2 脂肪含量测定结果及分析 样品脂肪含量测
定结果（表 8）显示，试验前后核桃青皮培养基脂
肪含量差值平均值为 0.029 7 mg/mL，试验前后核桃
青皮培养基脂肪含量差值（H）为 2.97%。
2.2.3 可溶性蛋白质含量测定 蛋白质标准曲线如
图 5 所示 ；样品蛋白质含量测定结果（表 9）表明，
试验前后核桃青皮培养基蛋白质含量差值平均值为
0.384 0 mg/mL，试验前后核桃青皮培养基蛋白质含
量差值（H）为 7.68%。
2.2.4 纤维素含量测定 纤维素标准曲线如图 6 所
示 ；样品纤维素含量测定结果（表 10）表明，试
验前后核桃青皮培养基纤维素浓度差值平均值为
0.0647 mg/mL，所以试验前后核桃青皮培养基纤维
素含量差值（H）为 64.7%。
3 讨论
根据菌株培养特性、形态特征及 ITS 基因序列
2014年第12期 159杨卫民等：核桃青皮废弃物中木霉菌的分离及其适应性研究
同源性对比等进行综合分析，参考有关资料认为，
HTQP-1 为 黄 曲 霉、HTQP-2 为 青 霉、HTQP-3 为 黑
曲霉和 HTQP-4 为木霉，利用反证试验法证实木霉
（HTQP-4）是核桃青皮微生物中的优势菌种。目前
对微生物的生物学鉴定主要依据各分类单位在分化
特征和形态特征上的异同点［12］。但同一属不同种的
形态往往又极其相似，难以区分。不同的用途要求
对菌种需要精确的分类和鉴定，传统的形态学分类
方法很难适用于此。近年来研究工作者广泛运用包
括等位酶技术、RAPD、AFLP、UP-PCR、DNA 指纹
和序列分析技术在内的分子生物学方法，通过比较
菌株间 DNA 序列的相似性程度，可对微生物的种进
行精确归类和分析［13］。
培养前后核桃青皮可溶性糖、脂肪、蛋白质
和 纤 维 素 含 量 分 别 减 少 6.03%、2.97%、7.68% 和
64.7%，与 4 种菌种存在密切的关系。根据培养前后
核桃青皮有机物质变化情况来看，变化依大小排列
为纤维素＞蛋白质＞可溶性糖＞脂肪，比较 4 种菌
种对纤维素的分解能力可作为选择优势菌种的一个
重要依据。4 个菌种中黄曲霉和青霉不具备对纤维
素的分解能力，可直接排除。黑曲霉和木霉具有分
解纤维素的能力，在对比黑曲霉和木霉培养特点和
形态特征时发现，整个核桃青皮培养基中主要是木
霉，因此可初步确定木霉为优势菌种。文献记载木
霉具有较强分解纤维素能力，其中绿色木霉通常能
够产生高度活性的纤维素酶，对纤维素的分解能力
很强。在木质素、纤维素丰富的基质上生长快，传
播蔓延迅速，这与本研究结果也相一致。
木霉菌广泛存在于土壤、空气、和植物体表面
等生态环境中，是一种重要的生防菌。据报道，目
前国际上已有 50 多种木霉菌的不同制剂作为生物农
药或生物肥料进行了登记［14］。其中木霉菌以生物肥
料的形式注册相对容易［15］，可同时应用于多种病害
的生物防治，还能兼顾对作物生长的促进和土壤环
境的修复。如果以木霉菌作菌种，可将核桃青皮开
发为生物肥料，不仅可以解决大量核桃青皮造成的
环境污染，而且可以带来一定的经济利益。
4 结论
引起核桃青皮自然霉变的菌种分别是黄曲霉
（Aspergillus flavus）、 黑 曲 霉（Aspergillus niger）、 青
霉（Penicillium） 和 木 霉（Trichoderma spp.）， 其 中
木霉（Trichoderma spp）是优势菌种。
核桃青皮霉变前后营养物质变化情况为 ；纤
维素、蛋白质、可溶性糖和脂肪含量分别减少了
64.7%、7.68%、6.03% 和 2.97%。
参 考 文 献
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图 5 蛋白质标准曲线
0.45
0.35
0.25
0.15
0.05
-0.05
0
0
0.10
0.20
0.30
0.40
O
D
y=0.5323x-0.0028
R2=0.9832
0.1 0.2 0.3 0.4㳻ⲭ䍘⎃ᓖmg/mL0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
0
0
-0.1
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
O
D
y=06406x-0.0116
R2=0.9811
0.2 0.4㓔㔤㍐⎃ᓖmg/mL0.6 0.8 1.0 1.2
图 6 纤维素标准曲线
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期160
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（责任编辑 李楠）