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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第5期
收稿日期 : 2011-10-02
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目（31071823, 30671714）
作者简介 : 唐杏姣 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 遗传育种 ; E-mail: tangxingjiao@163.com
通讯作者 : 戴思兰 , 教授 , 博士生导师 , E-mail: silandai@sina.com
菊花 CmDFR与 CmANS基因启动子序列克隆与
瞬时表达分析
唐杏姣 韩科厅 胡可 孟丽 戴思兰
（北京林业大学园林学院 国家花卉工程技术研究中心，北京 100083）
摘 要： DFR和 ANS是花青素合成途径下游两个关键的结构基因，其不仅决定花青素苷最终结构及其呈色，还在花器官
中特异性表达，研究其启动子区域对花色改良的分子育种具有重要参考价值。利用接头染色体步移法（genome walking），从菊花
的叶片基因组 DNA中克隆到了 2个 DFR基因同源序列 CmDFR的启动子片段，1个 ANS基因同源序列 CmANS的启动子片段。生
物信息学软件分析结果显示，这 3个启动子片段除了含有多个 TATA-box、CAAT-box 等基本的启动子元件，还含有很多与 MYB转
录因子相结合的元件，以及 G-box等参与光响应的顺式作用元件。利用双酶切方法，将克隆到的启动子片段替换载体 pBI121上的
35S启动子，将新构建的植物表达载体转入农杆菌中，采用叶盘法侵染菊花叶片和花瓣进行瞬时表达研究。结果表明，这 3个启
动子片段均具有驱动下游报告基因表达的功能。因此，可以开发成菊花分子育种的有效基因构件。
关键词： 菊花 花青素途径 启动子 染色体步移 瞬时表达
Cloning and Transient Expression Assay of CmDFR and CmANS
Promoters in Anthocyanin Pathway from Chrysanthemum×morifolium
Tang Xingjiao Han Keting Hu Ke Meng Li Dai Silan
（National Engineering Research Center for Floriculture, College of Landscape Architecture，Beijing Forestry University，Beijing 100083）
Abstract: Using Chromosome walking method（genome walking）, we cloned two promoter fragments of CmDFR and a promoter
fragment of CmANS from the chrysanthemum genomic DNA. The promoter software analysis showed that the three promoter fragments contain
a number of TATA-box, CAAT-box elements and also contain many other promoter elements, such as the MYB transcription factor combination
elements, and the G-box which is important cis-acting element involving in light response and light signal transduction pathway. Using double-
digested method, three promoter fragments replaced the 35S promoter, and were cloned into the vector pBI121, to build a new plant expression
vector into Agrobacterium. After infection of chrysanthemum leaf disk and petals, transient expression results showed that the three cloned
promoter fragments could drive the downstream reporter gene expression with function.
Key words: Chrysanthemum×morifolium Anthocyanin pathway Promoter Genome walking Transient expression
菊花（Chrysanthemum×morifolium）是我国十大
传统名花之一，也是世界四大切花之一，其花色变
异丰富，品种繁多［1］。对其花色进行改良获得新异
花色品种是菊花现代育种中的重要内容［2］。花青素
苷是影响花色形成的主要色素种类［3］。迄今我们已
经获得了菊花花青素苷合成途径中的关键结构基因
和调节基因，并获得了这些基因表达模式的信息［4, 5］。
DFR 和 ANS 基因是花青素苷合成途径中的重要基
因，其表达量直接影响舌状花中花青素苷的积累
量［6, 7］。对比菊花粉色野生型和白花突变体，发现
白花突变体中 CmDFR 不表达，CmANS 表达明显下
调［8］。我们在以往的研究中发现，菊花中的 CmDFR
和 CmANS 属于器官特异性表达基因，只在舌状花中
表达，在根、茎、叶中不表达［5, 8］。在花卉的分子
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期82
育种中，获得驱动外源基因异源表达的启动子是非
常重要的。目前花卉基因工程中多使用 35S 启动子，
其为组成型表达，可能引起植物体其他性状的改变。
因此一些研究者将目光聚焦于能驱动基因在花器官
特异性表达的基因启动子，如 CHS、PAL、AP1 等
基因的启动子［9-11］。这为花卉基因工程发展提供了
思路，极大促进了花卉分子育种进展。
接头染色体步移方法（又称 genome walking 方
法）常用来分离基因的 5端序列和启动子序列。
Eapelund 和 Jakobse［12］最早在 1992 年利用此方法，
在大麦中克隆到两个胚胎发育晚期富集蛋白基因
B19.4 和 B19.3 启动子。国内很多研究者也利用接
头染色体步移方法在不同植物中分离得到了不同基
因的 5端序列或启动子，如三孢布拉氏霉乳清酸核
苷-5-单磷酸脱羧酶基因［13］和甘蓝型油菜 BnCOP1
基因全长［14］，花生病程诱导基因 AhPIP1 启动子［15］，
绿豆种子 8S 球蛋白基因启动子［16］。与其他启动子
分离方法相比，接头染色体步移法的试验操作比较
简单，较易获得目的片段。
研究者们在对不同植物的研究中均发现，DFR
和 ANS 基因的表达受 MYB 和 bHLH 等转录因子调
控，同时这两个基因的表达还受光的诱导。如在非
洲菊中，GMYB10 与 bHLH 型转录因子互作，激活
PGDFR2 基因表达。非洲菊和葡萄中 DFR 基因的启
动子序列都含有一个关键的与 MYB 转录因子结合的
顺式作用元件［17, 18］。对菊花的研究也表明，CmDFR
和 CmANS 基因是受光诱导的，同时可能受 MYB 转
录因子所调控［5］。为探索 DFR 和 ANS 基因在转录
水平上的表达调控机制，本研究克隆了菊花 CmDFR
和 CmANS 基因启动子序列并分析其调控元件，这
一研究对于通过基因工程手段培育具有新异奇花色
的菊花品种具有实际意义。
1 材料与方法
1.1 材料
菊花品种‘丽金’紫色系（C.×morifolium‘Rea-
gan Elite Splendid’）于 2005 年引种于荷兰 CBA 公司
（Chrysanthemum Breeders Association）。种植于北京
林业大学人工气候室，光照时间为 12 h，光照强度
为 4 000 lx，温度条件为 20-22℃，相对湿度为 40%。
DNA 限制性内切酶为 Promega 公司产品 ；T4 连接酶
和克隆载体 pMD18-T vector 为 TaKaRa 公司产品 ；
LongAmp Taq酶为 NEB 公司产品 ；Taq plus DNA 聚
合酶、大肠杆菌感受态细胞 TOP10、离心柱型琼脂
糖凝胶 DNA 回收试剂盒和质粒 DNA 小量提取试剂
盒为天根公司产品 ；表达载体 pBI121 和根癌农杆菌
菌株 EHA105 为本课题组保存。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 查阅 NCBI 中登录的菊花
DFR 同源基因信息，发现共有 3 个 DFR 基因同源
序 列 信 息。GenBank 登 录 号 DQ471439 的 DFR 同
源序列为长 453 bp 的中间片段 ；GenBank 登录号
EF094935 的 DgDFR1 全长 1 143 bp。从切花菊品
种‘日切桃红’中分离到的 CmDFR 全长为 1 324 bp
（GenBank 登录号 GU324979），与 DgDFR1 相似性
达 84.67%，但 5端比 DgDFR1 多 34 bp， 3端多 148
bp。前期研究发现 GenBank 登录号为 GU324979 的
CmDFR 基因与菊花花青素苷含量密切相关。
为了能更好地分离到 5端的调控序列，使用该
序列设计两个下游引物 ：CDP1 ：5-CGCTAAATCCG-
CCTTCCATAATGTCAA-3；CDP2 ：5-AGGGTCACG-
AACAGTAGCACGAACAAT-3。根据本课题组已经获
得的菊花 CmANS 基因的 cDNA 序列（GenBank 登录
号为 EU810810）设计两个下游引物：CAP1：5-AGA-
AACGCTCCCCTGCATCCTTAACA -3 ；CAP2 ：
5 -CTTGCGTGTTTTTGGGTCGTTTGAGTTC-3 。
按照 Genome Walker 说明书合成上游引物 ：AP1 ： 5-
GTAATACGACTCACTATAGGGC-3；AP2 ： 5-ACT-
ATAGGGCACGCGTGGT-3。以上引物均由上海生物
工程有限公司合成。
1.2.2 菊花总 DNA 的提取与消化 取新鲜叶片，采
用 CTAB 法提取总 DNA，分别用限制性内切酶 Dra I、
EcoR Ⅴ、PvuⅡ和 Stu I 对基因组 DNA 进行限制性
酶切，构建基因组酶切文库。
1.2.3 基因组酶切文库纯化与添加 5接头 按照
Genome Walker 说明书纯化酶切产物，采用 T4 DNA
连接酶将接头序列添加至基因组 DNA 限制性酶切片
段的 5- 末端。接头序列按照说明书合成。
1.2.4 巢式 PCR 用已添加过接头的 DNA 片段做
2012年第5期 83唐杏姣等 ：菊花 CmDFR 与 CmANS 基因启动子序列克隆与瞬时表达分析
模板，使用接头引物 AP1 分别与下游基因特异性引
物 CDP1 和 CAP1 配对进行第一轮 PCR。反应体系 ：
模板 1 μL，接头引物 AP1（10 μmol/L）1 μL，基因
特 异 引 物 CDP1 和 CAP1（10 μmol/L）1 μL，dNTP
（10 mmol/L）0.4 μL，LongAmp Buffer（5×）4 μL，
LongAmp Taq酶 0.4 μL，ddH2O 12.2 μL。反应程序 ：
94℃ 25 s，70℃ 3 min，7 个循环 ；94℃ 25 s，67℃
3 min，32 个循环 ；67℃ 7 min，10℃停止。将第一
轮 PCR 的产物稀释 50 倍作为模板，使用接头引物
AP2 分别于 CDP2 和 CAP2 配对进行第二轮 PCR。
反应体系 ：模板 1 μL，接头引物 AP2（10 μmol/L）
1 μL，基因特异引物 CDP2 和 CAP2（10 μmol/L）1
μL， dNTP（10 mmol/L）0.4 μL， LongAmp Buffer（5×）
4 μL，LongAmp Taq酶 0.4 μL，ddH2O 12.2 μL。反应
程序 ：94℃ 25 s，72℃ 3 min，9 个循环 ；94℃ 25 s，
67℃ 3 min，26 个循环 ；67℃ 7min ；10℃停止。
1.2.5 PCR 产物的回收、连接、转化与鉴定及 DNA
序列测定与分析 PCR 产物的回收按天根公司琼
脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒说明书进行 ；连接反应
按 TaKaRa 公司 pMD18-T 载体说明书进行 ；重组质
粒由抗生素及 α-互补筛选，并用 PCR 方法进行检
测。DNA 序列测定由生工生物技术有限公司完成。
序列分析采用 DNAMAN 软件进行。启动子序列分
析 采 用 PLACE（http ：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）
和 PlantCARE（http ：//bioinformatics.psb.ugent.be/
webtools/plantcare/html/）分析软件进行分析。
1.2.6 表达载体的构建和瞬时表达分析 根据上述
研究获得的菊花 CmDFR 和 CmANS 基因启动子序列
进行设计，分别添加 Hind Ⅲ和 XbaⅠ酶切位点的上、
下游引物。
CmDFR 启动子片段的上下游引物 ：上游 ：5-
AAGCTTTACCCAGACTGTGGTGTGT-3；下游 ：5-T-
CTAGAAGGGTCACGAACAGTAGCAAC-3。
CmANS 启动子片段的上下游引物 ：上游 ：5-
AAGCTTATCGCCGTTATAAATAAT-3；下游 ：5-TC-
TAGATTTGTAAGTGTTGGATTTTGTGG-3。
以测序后获得的阳性菌液为模板进行 PCR 扩
增，将回收的PCR产物再次与克隆载体pBI121连接，
构建中间载体。将中间载体和表达载体 pBI121 分别
转入大肠杆菌 TOP10 中，摇菌后采用质粒 DNA 小
量提取试剂盒进行。将中间载体质粒和 pBI121 分别
用 Hind Ⅲ和 XbaⅠ进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳分
离酶切片段，回收目的片段连接至 BI1211。将连接
产物转化大肠杆菌 TOP10 感受态细胞，挑取白色单
菌落进行 PCR 检测，选择 PCR 反应呈阳性的菌株摇
菌培养过夜，提取质粒后进行酶切鉴定，同时进行
测序鉴定。将重组表达载体质粒导入农杆菌感受态，
侵染菊花叶片与花瓣，采用化学染色法进行 Gus 活
性检测［19］，染色结果用佳能 A720 数码相机拍照。
2 结果
2.1 启动子克隆结果
巢式 PCR 的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩
增得到CmANS启动子片段约600 bp （图1泳道1-4）。
测序拼接后的序列在 3端与 CmANS cDNA 的 5端
的 240 bp 的序列完全一致，因此认为所获得的序列
为 CmANS 基因的 5端调控序列，即 CmANS 基因上
游的启动子片段。测序后序列去除上游引物和 3端
与 CmANS cDNA 的 5端重叠的 240 bp 序列后，获
得 361 bp 的启动子片段，命名为 CAP。PCR 扩增得
到的CmDFR启动子片段约1 000 bp （图1泳道5-8），
CmDFR 启动子片段测序后出现两个不同序列。将
两个序列分别测序 3 次，得到同样的序列信息。其
中一个片段的 3端与 CmDFR cDNA 的 5端 UTR 区
有 15 bp 的差异，另外一个片段的 3端 162 bp 与
CmDFR cDNA 的 5端序列完全一致。将这两个启动
子片段分别命名为 CDP1 和 CDP2（长度分别为 819
bp 和 904 bp），两个序列的相似性为 56.69%。
M. DL2000 DNA Marker ；1-4. CmANS 启动子扩增结果 ； 5-8. CmDFR 启动
子扩增结果
图 1 巢式 PCR扩增 CmANS与 CmDFR启动子片段
电泳结果
2.2 启动子序列分析
采 用 PLACE 和 PlantCARE 软 件 对 所 得 到 的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期84
启动子序列进行分析发现，CmANS 基因启动子片
段 CAP 序列上除含有启动子所必需的 TATA 框和
CAAT 框外，还含有许多其他功能的顺式作用元
件（表 1），如 G-box、I-box 是光响应必需的元件，
MYB2CONSENSUSAT 为 MYB 结合所必需的元件。
CmDFR 基因启动子片段 CDP1 和 CDP2 除含
表 1 361 bp CmANS 启动子片段的顺式作用元件
顺式作用元件 核心序列（5-3）a 在 CAP 上的位置 b 功能
CAAT-box
GAREAT
G-box
I-box
MYB2CONSENSUSAT
WUN-motif
CAAT
TAACAAR
GATA
GTATAAGGCC
YAACKG/
CNGTTR/GGATA
TCATTACGAA
245（-）、251（-）
161（+）、180（+）、272（+）、
17（-）、74（-）、125（-）、
200（-）
123（-）、92（-）
180（+）、272（+）、124（-）、
22（-）、22（+）、125（-）
84（+）
组织特异表达元件
赤霉素响应元件
光响应与组织特异性表达相关元件
光响应元件
MYB 结合位点
伤害响应元件
a. 保守序列，R=A/G ； Y=T/C ； N=A/T/G/C ； K=T/C/G ； b. 顺势元件的同源序列相对于 5端的位置 ；链方向为 . + 示正向，- 互补序列
有众多 TATA 框和 CAAT 框，还含有许多相同的
顺 式 作 用 元 件（ 表 2）。 其 中，G box （CACGTG）
是与光响应和组织特异性表达相关的顺式元件 ；
MBS（CGGTCA）与 MYB 转录因子相结合的元件 ；
circadian（CAANNNNATC）是昼夜节律调控元件。
同时该序列上还含有热激信号响应相关的顺式作用
元件。通过以上分析，菊花 CmDFR 基因启动子序
列中含有众多与 MYB 和光诱导相关的顺式作用元件
的同源序列，表明该基因可能是通过上述作用元件
（或其中的一部分）调控其表达的。
表 2 819 bp和 904 bp CmDFR 启动子片段共有的顺式作用元件
顺式作用元件 核心序列（5-3）a 在 CDP1 上的位置 b 在 CDP2 上的位置 b 功能
Box 4 ATTAAT 447（+）、684（+）、660（+） 709（+）、847（+） 光响应的保守元件
CCAAT-box CAACGG 580（+） 635（+） MYBHv1 结合位点
CGTCA-motif CGTCA 524（-） 548（-） 茉莉酸甲酯响应顺式作用元件
circadian CAANNNNATC 628（-） 516（-）、679（-） 昼夜节律调控元件
HSE AAAAAATTTC 174（-） 726（-） 热激信号响应元件
G-box CACGTG 42（+）、434（+）、498（+）、39（-） 251（+）、490（+）、525（+）、855（+） 光响应与组织特异性表达元件
MBS CGGTCA 583（+） 638（+） MYB 结合元件
MSA-like TCAAACGGT 578（+） 633（+）、309（+） 细胞周期调控元件
Skn-1 motif GTCAT 523（-）、308（-） 777（-） 胚乳表达元件
CDP1 和 CDP2 序列上同时含有许多各自特有的
顺式作用元件（表 3）。CDP1 和 CDP2 序列上均含有
众多不同类型的光响应元件，如 CDP1 序列上含有
Box I（TTTCAAA）和 AT1-motif（AATTATTTTTTATT）
元件，而 CDP2 序列上含有 Sp1（CC（G/A）CCC）、
chs-CMA1a（TTACTTAA）、ATCT-motif（AATCTAAT-
CC）和 I-box（GTATAAGGCC）元件。二者也含有不
同的赤霉素响应元件，CDP1 含有 P-box（CCTTTTG），
CDP2 则含有 GARE-motif（AAACAGA）。这说明这
两个启动子都能响应光和赤霉素。CDP1 含有 ABRE
元件（MACGYGB）是基因响应 ABA 的一个关键顺
式作用元件，CDP2 序列上不含有。
2.3 植物表达载体构建与瞬时表达结果
以启动子序列 CAP 植物表达载体的构建为例
进行说明，其余序列表达载体的构建与之相似。对
照载体（原载体）pBI121 和本试验构建的以菊花
a. 保守序列，N=A/T/G/C ；b. 顺势元件的同源序列相对于 5端的位置，链方向为 ：+ 示正向，- 互补序列
2012年第5期 85唐杏姣等 ：菊花 CmDFR 与 CmANS 基因启动子序列克隆与瞬时表达分析
CmANS 基因启动子 CAP 驱动报告基因的重组载体
分别如图 2 和图 3 所示。重组的植物表达载体命名
及相关信息见表 4。
重组载体转入农杆菌后，以 EHA105 空菌株为
阴性对照，以含 pBI121 载体菌株为阳性对照，对已
构建的含菊花 CmANS 和 CmDFR 基因 3 个启动子的
重组载体进行瞬时表达分析，试验结果见图 4。从
图 4 可以看出，在农杆菌侵染后的菊花花瓣和叶
片中均检测到 GUSplus 基因的产物，说明所克隆的
表 3 819 bp和 904 bp CmDFR 启动子片段各自特有的顺式作用元件
启动子 顺式作用元件 核心序列（5-3） 位置 a 功能
CDP1 as-2-box
ABRE
AT1-motif
Box I
P-box
TGACG-motif
GATAATGATG
CACGTG
AATTATTTTTTATT
TTTCAAA
CCTTTTG
TGACG
316（-）
42（+）
267（-）
791（-）
788（+）
524（+）
茎特异性表达和光响应元件
脱落酸响应元件
光响应元件部分
光响应元件
赤霉素响应元件
茉莉酸甲酯响应顺式作用元件
CDP2 ARE
ATCT-motif
Box III
GARE-motif
LTR
MBS
Sp1
chs-CMA1a
I-box
TGGTTT
AATCTAATCC
CATTTACACT
AAACAGA
CCGAAA
CAACTG
CC（G/A）CCC
TTACTTAA
GTATAAGGCC
466（+）
467（-）
189（-）、449（-）
68（+）
804（-）
411（+）
580（-）
894（-）
295（+）
厌氧反应元件
光响应的保守元件
蛋白结合位点
赤霉素响应元件
低温响应元件
干旱响应与 MYB 结合的元件
光响应元件
光响应元件
光响应元件
图 2 对照载体 pBI121
图 3 重组载体 pBI121-CAP
表 4 菊花 CmANS和 CmDFR基因 3个启动子的
植物表达载体信息
启动子序列
名称
重组质粒
名称
启动子序列
长度（bp）
重组质粒分子
长度（bp）
CAP pBI121-CAP 361 14 285
CDP1 pBI121- CDP1 819 14 743
CDP2 pBI121- CDP2 904 14 828
a. 顺势元件的同源序列相对于 5端的位置，链方向为 ：+ 示正向，- 互补序列
阴性对照 .EHA105 空菌株 ；阳性对照 . pBI121 ；CAP. pBI121-CAP重组
质粒 ； CDP1. pBI121- CDP1 重组质粒 ；CDP2. pBI121-CDP2 重组质粒
图 4 重组质粒在菊花花瓣片（A）和叶片（B）
上瞬时表达结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期86
CmANS 和 CmDFR 基因的启动子序列均具有启动下
游 GUS 表达的功能，可以用于未来菊花的转基因
研究。从染色的结果来看，3 个启动子驱动报告基
因在菊花叶片中也有表达，但是报告基因在菊花花
瓣中的表达比在叶片中的表达部位广泛，表达的程
度高。
3 讨论
3.1 菊花基因工程中花瓣特异性启动子
目前利用基因工程获得新奇花色的菊花新品种
是研究热点，在菊花中转入异源的调节基因或结构
基因，会增加或减少花青素苷含量，从而加深或抑
制花色［8］。但是目前植物基因工程中所用的启动子
仍以 35S 启动子为主，此启动子为组成型表达，可
能引起其他性状的改变，且在转基因菊花中表达效
率低下［20］。李刚等［21］从拟南芥基因组中克隆得
到 CHS 基因的启动子约 500 bp，并初步证明该启
动子具有花部特异性的表达特性。Faktor 等［9］发现
CHS15 基因的启动子启动 GUS 基因在花中的表达主
要限定在花瓣的色素部分，说明 CHS15 基因的启动
子具有较强的花瓣特异表达性。并且 CHS 在花卉和
根特定的表达需要序列 G-box（CACGTG）和 H-box
（CCTACC（N）7CT）。Sasaki 等［11］利用拟南芥的花
部特异性启动子 APETALA1 与 MYB24-SRDX 基因
融合构建重组载体转化夏堇，获得了理想的花色表
型且花部具有波状边缘。这是一个很好的利用花器
官特异性启动子来创建新异花色表型的例子，且不
会引起其他器官和生理变化。
菊花中的 CmDFR 和 CmANS 同源基因是花瓣
特异性表达的基因［4, 5, 8］，因此本试验从菊花基因组
中分离了 CmDFR 和 CmANS 基因的启动子片段。对
这 3 个启动子片段进行初步的序列分析尚未发现他
们具有花部特异性表达的元件。这可能有两种解释，
一是分离到的基因 5端序列只是 CmDFR 和 CmANS
基因启动子的一部分，尚需进一步研究远端调控元
件 ；二是分离的启动子片段中可能存在一些新的尚
未被发现的花瓣特异性表达的元件，对此还需要展
开进一步研究。由于植物体基因表达调控是非常复
杂的，预测的顺式作用元件是否与实际的功能一致，
尚不能明确。未来可以尝试利用 CmDFR 和 CmANS
基因的启动子片段的重组载体转化模式植物，以进
一步鉴定 CmDFR 和 CmANS 启动子定位表达、发育
阶段特异性表达等表达特性。
3.2 菊花花青素苷合成途径响应光诱导的机理
研究
许多研究表明，植物的花瓣和果实中的花青素
苷合成是受光调控的［22, 23］。植物感受光信号，通
过光信号传导途径促使体内合成花青素苷合成相关
的酶，最终引起花青素苷合成与积累［24］。花青素
苷合成途径中的关键基因 DFR 和 ANS 的表达都受
到光强和光质的影响。研究发现，黑暗条件下 DFR
和 ANS 表达量下调或不表达，如非洲菊（Gerbera
hybrid）舌状花中的 DFR 和角堇中 DFR 和 ANS 的表
达量都下调［25, 26］，菊花舌状花中 CmDFR、CmANS
的表达则完全受到抑制［5］。UV-B 处理则会增强
DFR 和 ANS 的表达，如用 UV-B 照射莴苣叶片和苹
果，则莴苣叶片中 DFR 表达水平和苹果表皮中 ANS
表达水平均上调［27, 28］。在这些受光影响的结构基
因的启动子区域中，都含有许多光响应元件，以及
与 MYB 等转录因子相结合的基序。如欧芹的 CHS
基因启动子上发现有 1 个光响应元件 G-box 和 1 个
MYB 识别元件［29, 30］，拟南芥中 CHS、CHI、F3H 和
FLS 表达受光的诱导，它们的启动子区域含有共同
的光响应元件 ACE 和 MRE 单元［24, 31］，苹果 DFR、
ANS 基因的启动子序列也发现了类似的光响应元
件［32］。这些光响应元件能够在光诱导下，通过与
反式作用因子的相互作用来激活基因的表达［24, 31］。
对菊花进行黑暗处理，舌状花中 MYB 表达受抑制，
而 CmDFR、CmANS 基因表达完全受到抑制，推测
MYB 表达受光调控，其编码的转录因子通过与结构
基因 CmDFR、CmANS 的启动子结合，共同响应光
信号，并调节结构基因的表达量［5］。非洲菊的 DFR
启动子区具有 MYB 识别元件，且能被 MYB 转录因
子所激活［17］；在苹果中，MdMYB1 能够激活结构基
因 MdDFR 的表达［33］。
本研究使用分析软件进行预测克隆得到的
CmDFR 和 CmANS 的启动子片段，也发现大量与光
信号传导途径有关的顺式作用元件，如 G-box 和 I-box
等。这些与光诱导相关的顺式作用元件同时也是与
2012年第5期 87唐杏姣等 ：菊花 CmDFR 与 CmANS 基因启动子序列克隆与瞬时表达分析
MYB 相结合的位点。这些结果暗示，菊花花瓣的花
青素苷合成途径中，CmDFR 和 CmANS 基因是光诱
导且受 MYB 转录因子调节的。菊花叶片或花瓣中的
光敏色素感受光信号，通过光信号传导途径可能激
活或上调 MYB 基因的表达，而转录因子 MYB 则通
过与 CmDFR 和 CmANS 启动子上的顺式作用元件相
互作用，激活这两个结构基因的表达。这与其他植
物中的相关研究提出的模型是一致的［34］。在对 3 个
启动子片段的序列分析中发现了一些预测的应答激
素和胁迫的顺式调控元件，如赤霉素响应元件，茉
莉酸响应元件，脱落酸响应元件，低温和干旱响应
元件，昼夜节律调控元件等。这说明花青素苷合成
途径在植物体内的作用比较广泛，参与的植物调控
过程也比较复杂。因此，分离 CmDFR 和 CmANS 启
动子片段并分析片段序列上含有的顺式作用元件，
将为深入了解 CmDFR 和 CmANS 的表达调控模式和
理解菊花中花青素苷合成途径对光信号响应的分子
途径奠定基础。
4 结论
本研究利用染色体步移法（genome walking）
从菊花叶片基因组中获得了 2 个 CmDFR 和 1 个
CmANS 基因的 5 调控区序列。序列分析表明，这
3 个序列不仅含有 TATA-box 和 CAAT-box 等真核生
物典型的核心启动子区域，还含有一些预测的响应
光诱导并与 MYB 转录因子结合的顺式调控元件，如
G-box 和 I-box。将克隆到的 3 个启动子片段替换载
体 pBI121 上的 35S 启动子进行瞬时表达分析发现，
所克隆的 3 个启动子片段具有驱动下游报告基因表
达的功能。
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（责任编辑 李楠）