全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第5期
收稿日期 : 2012-03-01
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31160236）
作者简介 : 蔡倩，女，硕士研究生，研究方向 : 分子生物学 ; E-mail: caiqian1212@126.com
通讯作者 : 姚新灵，教授，研究方向 : 植物分子生物学 ; E-mail: chinanoahl@163.com
器官特异 EST随马铃薯不同基因型分化表达
蔡倩 崔雪琼 冯秀娟 黄琦 戴海霞 姚新灵
（宁夏大学 西部特色生物资源保护及利用教育部重点实验室，银川 750021）
摘 要： 匍匐茎是马铃薯的产量构成因素，匍匐茎形成早晚与成熟期早晚紧密关联，但关联的分子基础尚属未知。以两基
因型马铃薯匍匐茎及块茎为材料，构建了两基因型两器官消减 cDNA文库 4个，文库筛选识别了参与两器官形成 EST 21个，转录
水平检测显示，其中的 6个 EST呈现基因型及匍匐茎或块茎特异表达，随着块茎形成一些 EST表达水平显著降低；对 21个 EST
在 20个不同基因型中的表达分析表明，其中 9个 EST表现基因型特异表达，最低表达频率仅为 1/9；其中一些 EST仅在早熟或晚
熟基因型中表达；研究首次为匍匐茎形成早晚与成熟期早晚获得了分子证据，同时，也进一步明确了马铃薯各基因型间相对独立
而稳定的遗传基础。
关键词： 基因型 匍匐茎 表达序列标签 成熟期 马铃薯
ESTs Specific Expression in Stolon and Tuber Associates with Various
Genotypes in Potato
Cai Qian Cui Xueqiong Feng Xiujuan Huang Qi Dai Haixia Yao Xinling
（WBRPU Lab of National Education Ministry，Ningxia University，Yinchuan 750021）
Abstract: Stolon is one of the yield components in potato. Stolon initiation associates with mature period of tubers. A little is known on
how association appears on molecular level. In this study，4 subtractive libraries were constructed with stolon and tubers as materials from two
genotypes. 21 ESTs were identified by library screening. Test on transcriptomic level showed that 6 out of 21 ESTs expressed on the patterns of
stolon or tuber specific. Expression level of some ESTs went down along with tuberization. Expression of 21 ESTs in 20 genotypes was tested by
reverse transcription PCR. The result indicated that 9 out of 21 ESTs showed genotype-specific expression. The lowest expression frequency was
1/9. Some of those ESTs expressed only in genotypes of early mature，the others in late mature genotypes. The study provided the first evidence
for how stolon initiation associates with mature period of tubers. Meanwhile，relatively independent and stable genetic basis of potato genotypes
was further confirmed.
Key words: Genotype Stolon EST Mature period Potato
基因随时空表达决定了植物器官的发生，而基
因的表达受到环境制约。研究发现，拟南芥茎顶端
的形态发生依赖于微管细胞骨架，包括组织形态、
胁迫等的反馈回路，决定着表皮细胞中微管的协调
排列［1］。然而，协调排列发生的基因表达调控模式
尚不明确。基因的识别方法、活体成像工具、调控
形态发生的细胞和分子网络等的研究，将重新定义
植物器官形成和再生［2］。
茎顶端分生组织一侧细胞壁松弛，细胞内膨压
产生的静水压力使其凸起出现幼叶，用定量活体成
像研究发现，茎顶端中慢生长区域由于周围快速生
长细胞的包围而逐渐被牵制变硬，这导致其生长受
限，因此，细胞凸起形成幼叶不仅有基因表达参与，
而且也有形态发生的反馈调控［3］。
发掘器官发生的决定和参与基因无疑是揭示其
形成的前提，较早识别这些基因的思路是建立一个
2012年第5期 77蔡倩等 ：器官特异 EST 随马铃薯不同基因型分化表达
器官的表达基因的文库，以便获得其发生的途径。
以不同方式诱导茄子（Solanum melongena）基
因表达，并建立了不同诱导下的 cDNA 文库，测
定了 6 万个茄子的 cDNA 克隆，整理及分析获得
了 16 245 个 ESTs，与数据库中已知基因序列进行
比较解读功能，发现其功能类型分布与番茄极为相
似，其中的 1 316 个 ESTs 是茄子特异的，但获得
的 ESTs 数量远远低于预期［4］。另有研究构建并筛
选 21 个辣椒（Capsicum annuum）cDNA 文库，获得
了 116 412 个 ESTs，并据此建立了辣椒 EST 数据库，
为 unigene 识别、时空表达谱分析和茄科基因组解读
奠定基础［5］。以上研究表明，尽管强大的计算机足
以处理这些庞大的序列信息，但由此揭示器官发生
的代谢途径却有很长的路要走。同时，研究结果也
暗示着选择合适的模式器官、用适宜的方法是揭示
植物器官发生机制必须考虑的问题。马铃薯的匍匐
茎不进行光合作用、且只是简单的营养器官，其顶
端膨大形成块茎只是简单形态的变化，但其发生机
理不清。
块茎形成早晚随基因型不同，受光周期调控 ；
表达水稻成花位点（FT）编码的移动蛋白 Hd3a 基
因于马铃薯，可诱导短日照马铃薯在长日照条件下
结薯，嫁接植株的匍匐茎中可检测到 Hd3a-GFP 融
合蛋白，这表明结薯诱导可嫁接转移。StSP3D 和
StSP6A 响应彼此不同环境因素控制马铃薯开花和结
薯间的转换［6］。
尽管移动蛋白 Hd3a 基因可调控马铃薯结薯，
但其调控结薯是在匍匐茎形成后发生，而匍匐茎形
成和结薯是两个不同的分化阶段，匍匐茎形成早晚
与成熟期早晚紧密关联，不同马铃薯基因型成熟期
不同，识别匍匐茎形成、结薯与成熟期关联基因是
调控不同马铃薯基因型结薯所必需的。
转录子消减杂交是克服庞大的序列信息干扰关
键基因识别的有效途径［7］，本研究采用不同成熟期
马铃薯的匍匐茎和块茎为材料，建立了匍匐茎及块
茎的消减 cDNA 文库，文库筛选和 EST 表达分析，
获得了匍匐茎及块茎特异 EST，对其在不同成熟期
基因型表达测定显示，特异 EST 呈现与各成熟期基
因型对应的特异表达，旨在为揭示匍匐茎及块茎发
生机理奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
不同马铃薯基因型由本实验室保存，RNA 提取
用 Invitrogen 公司的 Trizol 试剂盒，引物合成及测序
由上海生工生物工程有限公司完成， PCR 扩增用基
因有限公司 mastercycler，Dnase I 等用 TaKaRa 公司
产品。
1.2 方法
在出苗后匍匐茎形成初期和块茎形成初期，分别
采集马铃薯基因型 N4 和 M5 匍匐茎和块茎各 200 g，
洗净后存入液氮，带回实验室 -80℃保存备用 ；用
Trizol 试剂盒提取中熟和晚熟总 RNA，以 DNase I
（RNase Free）消化基因组污染。在紫外分光光度
计上测定其纯度和含量，并用 1% 琼脂糖凝胶电泳
检测 RNA 的质量 ；分别以 N4 匍匐茎和块茎互为
Tester 和 Driver，及 M5 匍匐茎和块茎互为 Tester 和
Driver，按照 Ma 等［6］描述的方法，构建消极文库
N4S、N4T、M5S 和 M5T。
从文库平板上随机挑取白色菌落，用 MYF 和
MYR 引物进行菌落 PCR 筛选阳性克隆，PCR 反应
程序为：95℃变性 30 s，55℃退火 45 s，72℃延伸 2.5
min，每个退火温度循环 4 次，每 4 次上升 1℃，退
火温度从 55℃升至 60℃，反应共 24 个循环 ；72℃
延伸 10 min，4℃保存。阳性克隆用通用引物 T7 进
行测序，测序结果去除载体测序，序列比对排除重
复序列，获得非重复 EST 序列，在 NCBI 和 DFCI 等
数据库检索，依据同源性推测 EST 功能。
根据非重复 EST 序列，用 primer 软件辅助设计
并合成 EST 特异引物，RT-PCR 检测 EST 在 N4 和
M5 匍匐茎或块茎器官中特异表达，获得器官特异
EST，并明确匍匐茎特异 EST 随匍匐茎不同生长时
期的表达。按照上述方法，提取的 20 个不同成熟
期马铃薯基因型苗期叶子总 RNA，以其为模板，用
EST 特异引物，反转录 PCR 检测 EST 在 20 个其它
基因型中的表达分布，明确所识别 EST 与不同成熟
期基因型中的表达及分布。
2 结果
2.1 cDNA消减文库构建及筛选
分离获得的 RNA 纯度 R 值在 1.8-2.1 之间，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期78
28S 和 18S rRNA 条带清晰可见且无扩散，琼脂糖凝
胶电泳显示 28S 带亮度是 18S 带亮度的 2 倍左右，
表明所分离获得的 RNA 纯度足够高，可用于消减建
库 ；消减后的目的 cDNA 进行 PCR，在 0.2-2.0 kb
间呈弥散状条带，表明目的 cDNA 得到了有效的富
集 ；3 次重复的消减及 PCR 富集 cDNA 产物建库，
每个文库均有白色菌落和蓝色菌落生长，约有白色
菌落 80-90 个，菌落饱满清晰，蓝白斑检测显示文
库的重组率为 95% 左右。挑取平板上的白色克隆进
行菌落 PCR 筛选，部分电泳鉴定结果如图 1 所示，
插入片段大小集中在 100-700 bp 之间。
匍匐茎中表达 ；NS7 则只出现在 M5 基因型匍匐茎
中文库中，而在基因型 N4 的两文库中未见 ；N4 块
茎中未检出 NS8，但表达在 M5 基因型的匍匐茎和
块茎中。部分特异 EST 在两基因型各器官中的表达
分布如表 2 所示。
A. N4 匍匐茎 cDNA 消减文库克隆插入片段 ；B. M5 匍匐茎 cDNA
消减文库克隆插入片段
+. 表达 ；-. 未表达
图 1 菌落 PCR筛选部分结果
表 1 N4及M5匍匐茎及块茎消减 cDNA文库筛选数据统计
cDNA 消减文库 挑白色菌落（个）
PCR 阳性克
隆（个）
测序样品
数量（个） EST（个）
N4S 42 33 16 9
N4T 30 27 11 3
M5S 40 31 14 6
M5T 30 26 5 3
经菌落 PCR 呈阳性的克隆进行测序，经过序列
比对去除载体序列、舍弃重复序列，得到的 EST 21
个，21 个 EST BLAST 结果显示，有 12 个 EST 可在
数据库检索到相同或 90% 以上同源序列，另有 9 个
未在数据库检出同源或相似序列。4 个文库筛选数
据统计如表 1 所示。
2.2 匍匐茎特异EST的分化表达
依据 15 个匍匐茎特异 EST 序列设计引物，以
两基因型 N4 和 M5 匍匐茎或块茎器官 RNA 为模板，
用 15 对引物进行反转录 PCR，检测 15 个 EST 各基
因型各器官表达。结果发现，3 个 EST 表现明显的
器官特异表达，其中 MS36 只在 N4 和 M5 基因型的
表 2 器官特异 EST的表达分布
器官基因型
N4 M5
匍匐茎 块茎 匍匐茎 块茎
NS7 - - + -
NS8 + - + +
MS36 + - + -
NT4 - + - +
NT15 - + - -
MT11 - + - -
A、B、C、D 分别以幼苗期，花蕾期，开花期，块茎膨大期的
匍匐茎 cDNA 为模板，E 以块茎为对照
图 2 RT-PCR检测 NS7、NS8和MS36在匍匐茎
不同生长时期表达
分别提取幼苗期、花蕾期、开花期、块茎膨大
期的匍匐茎，用 NS7，NS8 和 MS36 特异引物进行
RT-PCR 检测，结果如图 2 所示，NS7 在幼苗期表达，
花蕾期、开花期、膨大期均不表达，在块茎中不表达。
NS8 在幼苗期、花蕾期、开花期、块茎膨大期表达
量递减，在块茎中不表达。MS36 在块茎中不表达，
在匍匐茎各时期表达无明显变化。再一次验证 NS7，
NS8，MS36 为马铃薯匍匐茎特异表达的 EST。
2.3 特异EST器官表达分布
依据 6 个块茎特异 EST 序列设计引物，以两基
因型 N4 和 M5 匍匐茎或块茎器官 RNA 为模板，用
6 对引物进行反转录 PCR，检测 6 个 EST 各基因型
各器官表达。结果（图 3）发现，3 个 EST 表现明
显的特异表达，3 个 EST 分别只在 N4 和 M5 基因型
的块茎中表达。6 个特异 EST 在两基因型各器官中
的表达分布如表 2 所示， NT4、MT11 则只出现在 N4
基因型块茎中文库中，M5 的两文库中未见。
2012年第5期 79蔡倩等 ：器官特异 EST 随马铃薯不同基因型分化表达
2.4 特异EST基因型表达分布
明确所识别EST与马铃薯基因型中的表达分布，
及其与其它形状的对应关系，以确定其表达基因型
特异性，用 21 对 EST 特异引物，RT-PCR 检测这些
EST 在 20 个基因型的表达分布。结果显示，21 个
EST 中的 9 个在 20 个基因型均有表达，但其表达量
表现区别，3 个在 20 个基因型均不表达，9 个 EST
表现基因型特异表达。9 个基因型特异 EST 在 20 个
基因中的统计分布频率如表 3 所示。
陇薯 3 号等中不表达 ；而 NS8 在早熟基因型如克新
1 号，铃田 99 中不表达，在大多数晚熟基因型如陇
薯 3 号，夏波蒂，冀张薯 8 号中表达。其中，NS7
呈现与早熟基因型对应的特异表达，NS8 呈现与晚
熟基因型对应的特异表达，如图 4 所示。
3 讨论
对于以无性繁殖为主的植物，如马铃薯，其个
体间的基因交换极为有限，各基因型间保留了相对
稳定的遗传组成，其中，生育期随不同基因型变化
于 70-120 d 之间，与之相关的块茎成熟期早晚的研
究非常有限，但成熟期早晚在很大程度上决定了块
茎产量和品质。
本研究用较早成熟的基因型 N4 和较晚成熟的
基因型 M5 为研究对象，目的在于探索不同基因型
在两器官发育过程中表达基因的区别，文库筛选结
果显示，两者在其产量性状形成中表达了不同的基
因，结果意味着相对稳定的遗传组成维系了基因型
特有的特性，如成熟期。
研究显示，在木质部导管和周围的内皮层间，
转录因子和 microRNAs 可在细胞间反向移动交流 ；
导管产生的 SHORT ROOT 移动到内皮层，激活
SCARECROW，这些转录因子共同激活 MIR165a 和
MIR166b，内皮层产生 microRNA165/6，后者失活编
码亮氨酸拉链转录因子的 mRNA，这些 mRNA 分布
S. 匍匐茎 ; T. 块茎
图 3 RT-PCR检测 EST在匍匐茎及块茎中特异表达
表 3 九个基因型特异表达 EST频率统计
基因型 表达 非表达 EST 表达频率
NS7 5 15 1/3
NS8 17 3 17/20
N4S31 18 2 9/10
S9 3 17 3/20
S17 5 15 1/4
S31 19 1 19/20
S36 18 2 9/10
NT4 6 14 3/7
NT15 2 18 1/9
9 个表现基因型特异表达 EST 中，NS7 只在早
熟基因型，如大西洋和克新 1 号、中熟基因型如
N4，庄薯 3 号中表达，而在大多数晚熟基因型、如
M. DNA 分子量标准 DL 2000; A. Actin ；1-20. 20 种基因型
图 4 RT-PCR检测 EST NS8和 NS7在 20种基因型幼苗期叶中表达分布
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期80
的差别以剂量依赖方式决定了其木质部细胞类型［8］。
在植物生长和发育过程中，表达了极为多样的
非蛋白质编码 RNA（npcRNAs）及短开放图阅读框
基因，这些基因调控着其它基因的表达。ENOD40
基因编码双重 RNA，在共生互作中被激活，导致根
瘤形成 ；ENOD40 编码的寡聚肽和 ENOD40 RNA 结
构区域可与不同的蛋白质相互作用调控酶的活性，
因此，ENOD40 RNA 充当着双重 RNA［9］。这些研究
表明，有 microRNAs 和双重 RNA 参与器官发生代谢
途径，这些 RNA 以剂量依赖方式或非蛋白质编码方
式行使调控细胞分化或器官发生，因此，细胞分化
或器官发生在转录组水平的代谢比大分子合成等代
谢更为复杂，需更为精细准确的方法识别转录产物。
本研究识别的特异 EST 序列通过 BLAST 检索到
了同源性 90% 的注册序列，但均为功能未注释和未
证实的序列，因此无法推测特异 EST 所在基因的功
能 ；这主要是由于数据库记载的大多数是蛋白编码
RNA，非蛋白编码 RNA 是近年才逐渐被发现，数据
库记载有限。
近年来，深度测序识别了大量植物非蛋白编码
RNA，这些 RNA 中许多有双重 RNA 功能 ；同时也
发现了植物中存在天然反义 RNA，这些 RNA 具有
编码和调控 RNA 活性的功能，通过其调控 RNA 活
性对非生物胁迫产生响应［9］。尽管在不同成熟期基
因型中表达的基因功能尚需进一步研究，以确定其
功能，尤其是在决定匍匐茎形成、结薯和成熟期中
怎样行使功能，但本研究的贡献在于首次识别了联
系器官形成和成熟特征之间的 EST，为先前的匍匐
茎早形成早成熟生理现象的解释找到了线索。
本研究识别了在不同基因型中表达频率仅为 1/9
的 EST，恰好证明了研究思路和所用方法的价值，
但同时也表明，目前的以马铃薯单个基因型为对象
的类似研究得出的结论，可能仅对所用基因型适用，
对其所具有的广泛代表性需持以谨慎的态度。
4 结论
本研究以马铃薯的产量构成因素匍匐茎和块
茎器官为研究对象，识别了参与其形成的特异表达
EST 21 个，其中的 6 个 EST 呈现基因型及匍匐茎或
块茎特异表达，随着块茎形成一些 EST 表达水平显
著降低 ；对 21 个 EST 在 20 个不同基因型中的表达
分析表明，其中 9 个 EST 表现基因型特异表达，最
低表达频率仅为 1/9 ；其中一些 EST 仅在早熟或晚
熟基因型中表达 ；研究首次为匍匐茎形成早晚与成
熟期早晚获得了分子证据。
参 考 文 献
［1］ Hamant O, Heisler MG, Jönsson H, et al. Developmental patterning
by me chanical signals in Arabidopsis. Science, 2008, 322（5908）:
1650-1655.
［2］ Duclercq J, Sangwan-Norreel B, Catterou M, Sangwan RS. De novo
shoot organogenesis: from art to science. Trends Plant Sci, 2001, 16
（11）:597-606.
［3］ Kierzkowski D, Nakayama N, Routier-Kierzkowska AL, et al. Elastic
domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical
meristem. Science, 2012, 335（6072）:1096-1099.
［4］ Nunzio DA, Alessandra T, Luigi F, Maria C. SolEST database: a
"one-stop shop" approach to the study of Solanaceae transcriptomes.
BMC Plant Biol, 2009, 9（1）: 142.
［5］ Hyun JK, Kwang HB, Seung WL, et al. Pepper EST database:
comprehensive in silico tool for analyzing the chili pepper （Capsicum
annuum） transcriptome. BMC Plant Biology, 2008, 8:101.
［6］ Navarro C, Abelenda J, Cruz-Oró E, et al. Control of flowering
and storage organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T.
Nature, 2011, 478:119-122.
［7］ Ma YJ, Hong ZP, Wu Q, Yao XL. Transcriptome subtractive
hybridization and its reliability validated by an E. coli model.
Bioscience Methods, 2011, 2:6.
［8］ Carlsbecker A, Lee JY, Roberts CJ, et al. Cell signalling by
microRNA165/6 directs gene dose-dependent root cell fate. Nature,
2010, 465（7296）:316-321.
［9］ Bardou F, Merchan F, Ariel F, Crespi M. Dual RNAs in plants.
Biochimie, 2011, 93（11）:1950-1954.
（责任编辑 李楠）