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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第9期
收稿日期 ： 2014-04-29
基金项目 ：国家自然科学基金资助项目（31071507）
作者简介 ：于蕊，女，硕士研究生，研究方向 ：食品生物技术 ；E-mail ：hardheartyr@sina.com
通讯作者 ：陈尚武，男，博士，教授，研究方向 ：科学与生物技术 ；E-mail ：swchen@au.edu.cn
硫醇类化合物广泛分布在生物系统中，是参与
抵御胁迫的重要组分，重要的硫醇化合物有谷胱甘
肽（Glutathione，GSH）、γ-谷氨酰半胱氨酸等。GSH
是许多革兰氏阴性菌及少数没有线粒体的真核生物
体中主要的低分子量的巯基化合物［1，2］。在革兰氏
阴性菌中谷胱甘肽在氧胁迫、射线胁迫、渗透胁迫、
重金属胁迫中有重要保护作用［3-6］。放线菌中尚未
发现有能够合成谷胱甘肽的种属，革兰氏阳性菌中
也很少见，目前发现的能够合成 GSH 的革兰氏阳性
重组粪肠球菌 gshF 基因对副干酪乳杆菌（Lactobacillus
paracasei）L14 抗逆性能的影响
于蕊 左芳雷 陈喜玲 魏艳杰 陈尚武
（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083 ；北京市农业微生物工程技术研究中心，北京 101113）
摘 要 ： 乳酸菌作为重要的食品工业微生物，其在工业生产应用过程中会受到多种非生物胁迫。已有研究表明部分乳酸菌
可以吸收培养基中或是自身合成谷胱甘肽（Glutathione，GSH），提高对各种胁迫的抵抗作用。克隆了粪肠球菌（Enterococcus faecalis）
中的谷胱甘肽合成酶基因 gshF，通过构建乳杆菌重组表达质粒，实现了 gshF 在副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）L14 菌株中
的异源表达。通过对重组 gshF-副干酪乳杆菌阳性菌株的抗逆性性测定，结果表明在过氧化氢、酸、冻干脱水和渗透等胁迫条件下，
gshF 重组菌株的存活率与对照菌株相比均有显著提高。
关键词 ： 副干酪乳杆菌 粪肠球菌 谷胱甘肽合成酶 gshF 抗逆性
Introducing gshF into Lactobacillus paracasei L14 to Influence Its
Stress Risistance Ability
Yu Rui Zuo Fanglei Chen Xiling Wei Yanjie Chen Shangwu
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083）
Abstract: As one of the important groups of food industry microorganisms, lactic acid bacteria will confront to various abiotic stresses
when applied in industry. Previous studies suggested that some lactic acid bacteria can synthesize or absorb glutathione from the medium and
protect themselves from diverse stress. In this study, glutathione synthetase gshF from Enterococcus faecalis, which can catalyze the synthesis of
glutathione, was cloned and transformed into Lactobacillus paracasei L14 by Lactobacillus recombinant expression vector. The stresses resistance
ability of the gshF recombinant strain was evaluated under stress conditions of hydrogen peroxide, acid, freeze-dry dehydration and osmosis. The
results suggested that the survival rate of the gshF recombinant strain was greatly improved compare with the control strain.
Key words: Lactobacillus paracasei Enterococcus faecalis Glutathione synthetase gshF Stress resistance
菌仅限于链球菌属、粪肠球菌属、乳球菌属及梭菌
属的某些种［7］。谷胱甘肽的合成有两种方式，一种
是通过谷氨酰半胱氨酸合成酶（gshA，EC∶6.3.2.2）
和谷胱甘肽合成酶（gshB，EC∶6.3.2.3）催化的两
步连续反应实现。这两个酶是由两个独立的基因，
gshA 和 gshB 分别调控合成的。然而，在某些乳酸链
球菌菌株中 GSH 的合成是由双功能酶（Bifunctional-
glutamate-cysteine ligase/glutathione synthetase，
EC∶6.3.2.2 6.3.2.3） 催 化 合 成 的［8］， 此 酶 由 基 因
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期150
gshF（gshAB）编码。研究人员发现，无乳链球菌
（Streptococcus agalactiae）无论是在胰酶解大豆酪蛋
白肉汤培养基［9］中还是在化学合成培养基［8］中都
可以合成 GSH。无乳链球菌是被首先证实的两种能
够在多功能域双功能蛋白（gshF/gshAB）的作用下
合成 GSH 生物之一。gshF 的 N 端具有 γ-谷氨酰半
胱氨酸合成酶活性（反应 1），C 端具有 GSH 合成
酶活性（反应 2）［8］。后续被证明含有 gshF 基因的
还有嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、猪链
球菌（S. suis）、血链球菌（S. sanguis）、变异链球菌
（S. mutans）、粪肠球菌（E. faecalis）、屎肠球菌（E.
faecium）等［8］。
反应 1：L-Glu+L-Cys+ATP γ-EC+ADP+Pi
Mg2+
反应 2 ：γ-EC+Gly+ATP GSH+ADP+Pi
Mg2+
本实验室保存的副干酪乳杆菌 L14 能够提高再
制干酪的硬度和咀嚼性并且可以促进再制干酪中蛋
白多肽的分解［10］，具有潜在的工业应用价值，但是
其对环境胁迫的耐受性不高［11］。前期研究将大肠
杆菌的 OtsBA 基因重组到副干酪乳杆菌中，发现重
组菌株对多种胁迫的耐受能力均有所提高［12］。鉴于
GSH 对生物的多重保护作用及已有的研究，本文将
粪肠球菌（E. faecalis）中的 gshF 基因重组到副干酪
乳杆菌（L. paracasei）L14 菌株中表达，并探究重组
菌在模拟胃肠道及工业加工过程等胁迫环境下的生
存活力变化。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试 验 材 料 副 干 酪 乳 杆 菌（Lactobacillus
paracasei）L14（分离自新疆牧民家庭自制酸牛奶，
本 实 验 室 保 存 ）、 粪 肠 球 菌（Enterococcus faecalis）
ML21（分离自新疆牧民家庭自制酸马奶，本实验室
保存）、表达载体 pMG76e（本实验室构建保藏）；大
肠杆菌（ Escherichia coli）DH5α 感受态细胞（全式
金生物技术公司，北京）；克隆载体 pMD19-T Simple
载体（TaKaRa 公司，大连）。
1.1.2 酶及其他试剂 T4 DNA 连接酶、限制性内切
酶、DL2000、DL15000 DNA marker（TaKaRa 公 司，
大连）；2×Taq PCR Master Mix、多功能 DNA 纯化回
收试剂盒（Biomed 公司，北京）；红霉素、氨苄青
霉素、X-gal、IPTG 等（Sigma，北京）；30% 聚乙二
醇 1500（0.22 μm 滤膜除菌，4℃保存）；感受态洗涤
缓 冲 液（0.3 mol/L 蔗 糖，1 mmol/L MgCl2）；PBS 缓
冲液（NaCl 8 g/L，KCl 0.2 g/L，磷酸氢二钠（Na2HPO4）
1.44 g/L， 磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.24 g/L，pH7.4）。
1.1.3 培养基 MRS 培养基（蛋白胨 10 g，牛肉膏
10 g，酵母膏 5 g，柠檬酸氢二铵 2.0 g，葡萄糖 20
g，磷酸氢二钾 2 g，硫酸铵 1.63 g，乙酸钠 5 g，硫
酸镁 0.58 g，硫酸锰 0.25 g，吐温 -80 1 mL，琼脂 15
g，加蒸馏水至 1 000 mL，pH6.8±0.2）；MRSS 培养
基（MRS，0.3 mol/L 蔗糖）；MRSSM 培养基（MRS，
0.3 mol/L 蔗糖，0.1 mmol/L MgCl2）；LB 培养基（蛋
白胨 10 g，酵母膏 5 g，氯化钠 10 g，加蒸馏水至
1 000 mL，pH 7.0）。
1.1.4 试验仪器和设备 超净工作台（Taisite，天津
市泰斯特仪器有限公司）；恒温培养箱（DHP-9082，
上海合恒仪器设备有限公司）；分光光度计（UV/VIS
2802PC，尤尼柯（上海）仪器有限公司）；pH 酸度
计（METTLER TOLEDO LE438，上海亦盛科学器材
有限公司）；电子天平（FA/JA，上海济成分析仪器
有限公司）；分析天平（FA2004B，郑州南北仪器设
备有限公司）；小型高速离心机（Sigma 1-14，郑州
南北仪器设备有限公司）；PCR 仪（EDC-810，北
京东胜创新生物科技有限公司）；电泳仪（DYY-6B，
郑州仪器设备有限公司）；真空冷冻干燥机（LGJ-12，
郑州南北仪器设备有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 菌株培养 副干酪乳杆菌 L14 和粪肠球菌
ML21 按 1%（V/V）接种于 MRS 培养基中，于 37℃
有氧条件下静置培养 16 h。用于载体构建的 E. coli
DH5α 接种于于 LB 培养基中，37℃ 200 r/min 振荡培
养过夜。对于乳酸菌，红霉素使用浓度为 5 μg/mL ；
对于大肠杆菌，红霉素使用浓度为 500 μg/mL，氨苄
霉素使用浓度为 100 μg/mL。
1.2.2 基因组提取与基因克隆 根据 GenBank 发布
的粪肠球菌中的 gshF 基因序列，利用 Primer Premier
5.0 软件设计引物。其引物序列为 ：
2014年第9期 151
于蕊等 ：重组粪肠球菌 gshF 基因对副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）
L14 抗逆性能的影响
Gsh-F ：5-CTCTAGAATGAATTATAGAGAATTA
ATGC-3，
Gsh-B ：5-CTCGAGTTATTGAACCACTTCTG
GG-3。
上下游引物分别引入了 Xba I 和 Xho I 限制性
酶切位点。根据文献［13］方法提取 Enterococcus
faecalis ML21 基因组，并以此为模版进行扩增 gshF
基因。反应条件为 ：预变性 94℃ 5 min，变性 94℃
30 s，退火 60℃ 30 s，延伸 72℃ 2 min，30 个循环，
72℃补充延伸 10 min。将 PCR 产物纯化后连接到
pMD19-T simple 克隆载体上，转化 E. coli DH5α，挑
选阳性克隆，对插入目标 DNA 片段测序。
1.2.3 表 达 载 体 pMG76e-gshF 的 构 建 pMG76e-
gshF 的构建步骤如图 1 所示。即将上一步测序正确
的 gshF 克隆片段与乳酸菌表达载体 pMG76e 分别用
Xba I 和 Xho I 双酶切，将 gshF 和 pMG76e 酶切片段
连接转化 E. coli DH5α，阳性转化子以菌落 PCR 方
法进行验证并提取阳性质粒、测序验证，即得到重
beta-gal alpha
RepA
ORF D
Terminator
pMG76e-GshF
5 804 bp
Ery
Promoter-tranc
emrC leader peptide
Pro
promoter 32
gshF
RBS
Ligation
emrC leader peptide
Promoter-tranc
Ery
Pro
Promoter 32
RBS
pMG76e
3 550 bp
P-LacZ
Terminator
beta-gal alpha
RepA
ORF D
Terminator
gshF
P-LacZ
Terminator
Xho I 2273
Xba I 3546 Xho I 2330 Xba I 53
XbaI 5800 XhoI 19
图 1 乳杆菌表达载体 pMG76e-gshF 的构建示意图
组表达载体 pMG76e-gshF。
1.2.4 乳酸菌电转化 乳酸菌电转化参考文献［14，
15］方法并进行适当改进。过程如下 ：过夜培养的
副干酪乳杆菌 L14 菌液按 1%（V/V）接种于含有 1%
甘氨酸 的 MRSS 培养基中，于 37℃下静置培养。当
生长至 OD600 NM 为 0.4-0.6 时，离心（6 000 r/min、
4℃、5 min）收集菌体，用感受态洗涤缓冲液洗涤
沉淀两次，再用 30%PEG1500 洗涤 1 次。细胞沉淀
用 1/100 菌液体积的 30%PEG1500 重悬，分装为 40
μL 每管，即得到感受态细胞，液氮速冻并 -80℃保
存。取 2 μL 重组质粒与 40 μL 乳酸菌感受态细胞混
合，转移到 1 mm 的电转杯中，冰浴 5 min。利用
Bio-Rad Gene Pulsor 电穿孔法将重组质粒转入副干酪
乳杆菌 L14 中，设定电击程序为 ：1.25 kV，25 μF，
400 Ω，以空载体 pMG76e 作为对照。电击后的细胞
加入 1 mL 的 MRSSM 复苏培养基，于 37℃培养 3 h。
将复苏的菌液涂布于含 5 μg/mL 红霉素的 MRS 固体
培养基上，37℃培养 2-3 d。阳性转化子通过菌落
PCR 鉴定。利用 Primer Premier 5.0 软件设计引物，
扩增 gshF 内部部分序列，其引物序列为 ：
Gsh-F1 ：5-ACCAACCGCAAGAACCCA-3，
Gsh-B1 ：5-AGCGCACAGGCGCATAAA-3。
1.2.5 重 组 菌 株 表 达 蛋 白 的 SDS-PAGE 检 测 重
组 菌 株 L14-pMG76e-gshF 以 及 转 空 载 体 菌 株 L14-
pMG76e 活化培养两代，按 1% 接种于 50 mL MRS
培养基中，37℃培养至对数中期（OD600nm=1.5-2.0），
收集菌体。
用 2 mL PBS 缓冲液洗涤菌体两次后将菌体重悬
于 1 mL PBS 缓冲液中，超声破碎菌体细胞，超声结
束后离心（12 000 r/min，5 min），转移上清液至新管，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期152
用紫外分光光度计测定蛋白浓度并调为一致，做蛋
白质表达水平的 SDS-PAGE 电泳检查。
1.2.6 抗逆性评价
1.2.6.1 过氧化氢、酸、渗透胁迫活菌计数 将过
夜 培 养 的 重 组 菌 株 L14-pMG76e-gshF 以 及 对 照 菌
株 L14-pMG76e 按 1% 接种于含有 5 μg/mL 红霉素
的 MRS 液 体 培 养 基 中，37℃ 培 养 至 其 OD600nm 为
1.5-2.0 时进行胁迫。分别取 1 mL 的菌液离心收集
菌体，后分别加入 37℃预热的含 8 mmol/L H2O2 的
MRS 液体培养基、pH2.0 的 MRS 液体培养基或含 5
mol/L NaCl 的 MRS 液体培养基进行重悬，于 37℃下
分别处理不同时间。然后立即离心（12 000 r/min，1
min）收集菌体，用 0.85% 的生理盐水洗涤菌体两
次。菌体重悬于 1 mL 生理盐水并梯度稀释，利用倾
注平板法进行活菌计数，计算存活率。以未胁迫菌
体作为对照。
1.2.6.2 冷冻干燥活菌计数 将过夜培养的重组菌
株 L14-pMG76e-gshF 以及对照菌株 L14-pMG76e 按
1% 接种于含有 5 μg/mL 红霉素的 MRS 液体培养基
中，37℃ 分 别 培 养 至 对 数 期（8 h，OD600=1.5-2.0）
和稳定期（16 h，OD600=3.0-4.0），将菌液分装到青
霉素小瓶中迅速用液氮速冻后于 -20℃预冻 3 h，然
后冷冻干燥 24 h。将冷冻干燥后的菌株用生理盐水
溶解并进行梯度稀释，利用倾注平板法进行活菌计
数，计算存活率。以未胁迫菌体作为对照。
2 结果
2.1 基因克隆、测序和表达载体构建
以 粪 肠 球 菌 基 因 组 DNA 为 模 板 获 得 gshF 的
PCR 扩增片段，对产物进行凝胶电泳分析，发现与
目标基因大小相符的 PCR 片段（图 2-A）。对其进行
测定可知序列编码一个完整的阅读框。经 NCBI 核
酸序列数据库比对，与粪肠球菌的 gshF 基因序列匹
配达 98.9%，可以用于后续表达研究。
将 pMD19-gshF 和表达载体 pMG76e 以 Xba I 和
Xho I 双酶切，回收目标片段进行连接，得到重组质
粒 pMG76e-gshF（图 2-B），质粒进行测序以确定基
因插入的正确性。
2.2 重组载体转化与验证
采用菌落 PCR 对电转化后的重组菌株进行鉴
2500
pMG76e-GshF
A
B
5026
bp
1 2 M2
3049pMG76e
M1 CK gshF
M1 ：DL15000 marker ；M2 ：supercoiled DNA marker ；1 ：pMG76e-GshF ；2 ：
pMG76e
图 2 粪肠球菌（E. faecalis）gshF 的 PCR 扩增（A）和
乳杆菌表达质粒构建的验证（B）
定，由图 3 可以看出，重组质粒已成功转入到副干
酪乳杆菌 L14 中。pMG76e-gshF 成功转化的副干酪
乳杆菌 L14 转化子命名为 L14-pMG76e-gshF，而相
应的空载体转化子命名为 L14-pMG76e。
gshF
1 2 3 + CK M
250
bp
100
1-3 ：L14 的 pMG76e-gshF 转化子（L14-pMG76e-gshF）PCR 产物 ；+ ：阳性
对照（pMG76e-gshF）PCR 产物 ；CK ：对照菌株（L14-pMG76e）PCR 产物 ；
M ：DNA marker DL2000
图 3 重组质粒在副干酪乳杆菌 L14 中转化所得转化子质
粒中 gshF 基因部分片段 PCR 扩增的电泳图
2.3 基因表达的蛋白质水平检测
对 pMG76e-gshF 转化菌株进行异源蛋白质表达
的 SDS-PAGE 检测，由图 4 所示结果可见，与对照
菌株相比，L14-pMG76e-gshF 转化菌株在 87 kD 处有
与预期大小一致的差异表达蛋白，说明 gshF 基因在
副干酪乳杆菌 L14 中成功表达，其表达量达中等以
上丰度。
2014年第9期 153
于蕊等 ：重组粪肠球菌 gshF 基因对副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）
L14 抗逆性能的影响
对照菌株 L14-pMG76e 存活率没有显著差异。但是
胁迫 20 min 后，重组菌株的存活率与对照菌株相比
提高了 3 倍。说明表达 gshF 基因可以提高副干酪乳
杆菌 L14 抗酸胁迫的能力。
100
M 1 2
80 GshF
M ：Protein marker（12-100 kD）；1 ：L14-pMG76e 全 细 胞 蛋 白 ；2 ：L14-
pMG76e-gshF 全细胞蛋白
图 4 副干酪乳杆菌 L-14 对异源 GshF 表达的 SDS-PAGE
分析
2.4 gshF表达对菌株抗逆性的影响
谷胱甘肽是细胞重要的氧-还体系组分。以下结
果已经确认异源谷胱甘肽合成酶 GshF 在副干酪乳杆
菌 L14 中成功表达，但尚未能判定这一外源导入的
自主 GSH 合成体系，是否能对该菌细胞生理和相应
的胁迫响应功能产生影响。因此，选择了典型的氧
化胁迫、酸胁迫、渗透胁迫和冻干脱水条件，对比
测 定 L14-pMG76e-gshF 和 L14-pMG76e 菌 株 的 抗 逆
胁迫能力的变化，对 GshF 的影响进行评价。
2.4.1 抗过氧化氢胁迫 由图 5 可见，与对照菌株
L14-pMG76e 相比，gshF 阳性转化菌株 L14-pMG76e-
gshF 在 8 mmol/L H2O2 胁 迫 30 min、MRS 培 养 基、
37℃生长条件下的存活率提高 16.7 倍，60 min 胁迫
后重组菌株仍保持一定的存活率，而对照组存活率
接近于零。说明表达 gshF 基因显著提高了副干酪乳
杆菌 L14 抗过氧化氢胁迫的能力。
0.00001
30 ᰦ䰤 min 600.0001ᆈ⍫⦷ 0.0010.010.1110 L14-pMG76eL14-pMG76e-gshF
图 5 重组 gshF 转化副干酪乳杆菌在 H2O2 胁迫下的存活
率变化
10 ᰦ䰤 min 200.000010.0001ᆈ⍫⦷ 0.0010.01 L14-pMG76eL14-pMG76e-gshF
图 6 重组 gshF 转化副干酪乳杆菌在酸胁迫下的存
活率变化
30 ᰦ䰤 min 60ᆈ⍫⦷ 0.070.060.050.040.030.020.010 L14-pMG76eL14-pMG76e-gshF
图 7 重组 gshF 转化副干酪乳杆菌在 5 mol/L NaCl 渗透胁
迫下的存活率变化
2.4.3 抗渗透胁迫 由图 7 可见，与对照菌株 L14-
pMG76e 相 比， 重 组 菌 株 L14-pMG76e-gshF 在 5
mol/L NaCl 胁迫 30 min 后，存活率提高了 2.60 倍 ；
胁迫 1 h 后，存活率提高了 2.59 倍。说明表达 gshF
基因可以提高副干酪乳杆菌 L14 抗渗透胁迫的能力。
2.4.4 冷冻干燥存活率分析 通过冷冻干燥后存活
率可以看出，对数期重组菌株 L14-pMG76e-gshF 与
对照组 L14-pMG76e 相比，存活率提高了 2.19 倍，
稳定期菌株存活率差异变小，但是仍比对照组提高
了 1.65 倍（图 8）。说明表达 gshF 基因可以提高不
同生长时期的副干酪乳杆菌 L14 冷冻干燥后菌株的
活力，尤其是对对数生长后期的菌体保护效果更好。
2.4.2 抗酸胁迫 由图 6 可见，在 pH2.0 的低酸环
境下胁迫 10 min 后，重组菌株 L14-pMG76e-gshF 和
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期154
抵御氧胁迫中的重要作用。本研究中重组粪肠球菌
gshF 基因的副干酪乳杆菌 L14 在过氧化氢胁迫条件
下，存活率相比对照菌株提高 17 倍，说明表达外
源 gshF 显著提高了副干酪乳杆菌 L14 的氧化胁迫
耐受能力。副干酪乳杆菌自身也有合成 GSH 的编
码基因，包括谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase
（NADPH）［EC∶1.8.1.7］）、谷氨酸-半胱氨酸连接酶
（glutamate--cysteine ligase［EC∶6.3.2.2］）、谷胱甘肽
S-转 移 酶（glutathione S-transferase［EC∶2.5.1.18］）
谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase［EC∶
1.11.1.9］），但无双功能谷胱甘肽合成酶基因 GshF
或 GshAB［EC∶6.3.2.2/3］。外源 gshF 的转入，明显
产生了谷胱甘肽合成酶的超表达，为谷胱甘肽的合
成提供了保障，并由此产生了相应的细胞生理学的
功能。
人和动物的胃液是偏酸性，因此乳酸菌必须抵
御低 pH 环境才能顺利到达肠道。Meury 和 Kepes ［25］
研究谷胱甘肽在大肠杆菌中通过控制 K+ 通道——
KefB 和 KefC，来控制细胞内的 pH，从而使细胞能
够耐受一定的酸胁迫。虽然谷胱甘肽在乳酸菌抵御
酸性环境中的作用机制尚未探明，但是已有研究表
明在培养基中添加的谷胱甘肽能够使唾液乳杆菌、
乳酸乳球菌干酪亚种耐受不同程度的酸胁迫［26，27］。
除此之外，当在肠膜明串珠菌生长的培养基上加入
一定量的 GSH 时，其在对数中期和对数后期时的存
活率比无 GSH 添加的对照组有显著地提高［28］。本
研究则以异源谷胱甘肽合成酶基因 gshF 转化表达的
方式，证实 GSH 在副干酪乳杆菌中也有相同的效果。
在发酵食品加工过程中，往往需要添加糖和盐，
以降低水活度，防止食品变质。这样乳酸菌就会受
到渗透胁迫。已有研究显示，当培养在含有终浓度
为 5 mol/L 的 NaCl 的培养基中时，含有 GSH 的乳酸
乳球菌 SK11 可以存活至少 24 h 而对照组在 2 h 时细
胞已经裂解［29］。由本研究结果可知，表达外源 gshF
基因也能够提高副干酪乳杆菌 L14 对高渗透环境的
耐受能力。另外，冷冻储存、冷冻干燥是乳酸菌在
工业应用中常用到的保藏加工手段。在大肠杆菌中，
当遭遇冷冻胁迫时菌株的生理反应与遭遇氧胁迫时
相同—Mn-SOD 的水平增高，GSH 的水平降低［18］。
同时，当在培养基中添加谷胱甘肽时的存活率比添
8 ษޫᰦ䰤 h 16ᆈ⍫⦷ 0.200.150.100.050 L14-pMG76eL14-pMG76e-gshF
图 8 重组 gshF 转化副干酪乳杆菌冷冻干燥后的存活率
3 讨论
多年以来研究者普遍认为能够合成谷胱甘肽
的革兰氏阳性菌相对较少，但随着一些具有体内合
成或外源吸收谷胱甘肽能力的革兰氏阳性菌的发
现，谷胱甘肽在革兰氏阳性菌中的生理作用也日
益成为研究热点。谷胱甘肽对机体抵御包括氧胁
迫、酸胁迫、渗透胁迫等多种胁迫的重要保护作
用［16-18］，含有谷胱甘肽的旧金山乳杆菌（Lactobacillus
sanfranciscensis）DSM20451 对冷胁迫及冷冻干燥胁
迫有很好的抵御效果［19］。除此之外，GSH 还可以
加速唾液乳杆菌（L. salivarius）的生长［20］以及作
为单一硫源为罗伊氏乳杆菌提供营养［21］。随着基
因工程的发展，除了自身具有 gshA 和 gshB 或 gshF
的生物外，有学者通过转基因的方式在不含有 GSH
合成系统的生物内构建完整的 GSH 合成途径。如
将来自于大肠杆菌的 gshA 和 gshB 基因转入乳酸乳
球菌 NZ9000 并成功表达谷胱甘肽使其对氧胁迫［22］
和酸胁迫［23］有较好的抵御效果。而且 GSH 的成功
表达还可以恢复过氧化物歧化酶缺失的乳酸乳球菌
NZ9000 的抗氧胁迫能力［22］。
作为经常在发酵工业及益生菌制剂中使用的
乳酸菌，氧、高渗透压、低酸以及冷冻干燥等是
其在加工过程中经常遇到的非生物胁迫。Yoon 和
Byun［24］在 11 株乳杆菌中发现菌株无细胞提取物
的抗氧化能力与其中的还原状态的谷胱甘肽的水
平成正相关。同时，有氧条件下培养的干酪乳杆
菌（L. casei）SK11 细胞中的谷胱甘肽的积累比无
氧条件下培养时提高了 30%，谷胱甘肽过氧化物酶
的水平提高了 5 倍，这同时也证明了谷胱甘肽在其
2014年第9期 155
于蕊等 ：重组粪肠球菌 gshF 基因对副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）
L14 抗逆性能的影响
加半胱氨酸或不作任何处理的对照增加了 3 倍［30］。
在旧金山乳杆菌 DSM20451 中，长时间地冷冻处理
后含有 GSH 的细胞膜比对照组细胞膜中不饱和脂肪
酸的含量更高，同时细胞膜结构也能够保持完整［31］。
本试验中表达 gshF 的重组菌株与对照菌株相比在冷
冻干燥处理后存活率也有明显地提高，表明 GshF 对
细胞内 GSH 和冻干脱水保护作出了贡献。
4 结论
通过转入谷胱甘肽基因，研究其对逆境状态下
生长的乳酸乳球菌的保护作用已有研究，但是 gshF
在乳杆菌属中的表达及其保护效果还鲜有研究。本
研究表明 gshF 的表达使菌株对多种胁迫的耐受能力
与不表达 gshF 的对照菌株相比都有不同程度地显著
提高，这对副干酪乳杆菌工业化定向选育具有积极
的参考价值。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）