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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-08-17
基金项目 : 科技部自然科技资源平台项目（2006DKA21203）, 河北省教育厅资助项目（2009466）
作者简介 : 袁丽杰 , 女 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 微生物分类鉴定及其次级代谢产物 ; E-mail: yuanlijie@sohu.com
一株根际放线菌的分离鉴定及其生物活性初探
袁丽杰1, 2 刘爱华1 张玉琴2 余利岩2 张月琴2
（1 河北联合大学基础医学院，唐山 063000 ；2 中国医学科学院医药生物技术研究所，北京 100050）
摘 要： 从四川重庆药用植物蒿本根际土中分离到一株放线菌 I06-02658，该菌株的发酵产物具有 Caspase7抑制活性。菌株
I06-02658在供试培养基上生长良好，形成丰富的基内菌丝，颜色从乳白到肉粉。在部分供试培养基上形成丰富的气生菌丝，产生
浅黄至浅粉色可溶性色素。系统发育、化学分类特征、形态特征、生理生化特性等分析表明菌株 I06-02658 是糖霉菌属（Glycomyces）
的一个菌株。
关键词： 根际 放线菌 分离 鉴定 次级代谢产物
Isolation and Identification on One Rhizosphere Actinomycete
Strain with Activities
Yuan Lijie1, 2 Liu Aihua1 Zhang Yuqin 2 Yu Liyan2 Zhang Yueqin2
（1Hebei United University Medical College，Tangshan 063000；2Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Sciences
and Peking Union Medical College，Beijing 100050）
Abstract: One rhizosphere actinomycete strain I06-02658 was isolated from rhizosphere soil of medicinal plant Artemisia collected from
Chongqing. The fermentation broth of strain I06-02658 exhibited inhibitive activity of Caspase7. Strain I06-02658 grew well on most media
tested. The color of basal filament was creamy white to pink, and abundant aerial hyphae were observed on most media, which caused light yellow
to pink diffusible pigments. Phylogenetic, chemotaxonomic, morphological analyses, physiological and biochemical characteristics demonstrated
that strain I06-2658 belong to the genus Glycomyces.
Key words: Rhizosphere Actinomycetes Isolation Identification Microbial secondary metabolites.
微生物次级代谢产物是发现与研制新药的丰富
资源之一，自 20 世纪 40 年代青霉素被发现以来的
数十年中从微生物代谢产物中已开发出大量的生物
活性物质［1］。但是近些年，普通环境微生物来源的
新生物活性物质发现的速率明显减慢，且从中重复
分离已知化合物的几率在上升，因此必须考虑开发
多种微生物分离环境，扩大微生物菌种来源，如从
海洋［2］，特定环境（植物内生菌、植物根际菌）和
极端环境分离菌株，并对其次级代谢产物进行筛选
研究。
植物根际是生物和物理特性受到植物根系影响
的紧密环绕根的区域，通常为距离根表面 1-4 mm
的范围，甚至更小的区域。在植物根际区域内生长
的微生物称为根际微生物。根际微生物在种类和数
量上不同于非根际微生物。越来越多的研究表明，
从根际微生态环境中分离得到的许多微生物具有重
要生物活性，因此，植物根际微生物是一类值得深
入研究与开发的微生物资源。
国内外有关植物根际来源的微生物资源的研究
报道还不多。本研究主要选择具有我国地域特色的
藏药植物及一些民族中药的根际土作为分离对象，
运用选择性分离策略着重分离稀有放线菌，拟从中
发现新种，开发出新的活性化合物。在分离过程中
得到菌株 I06-02658 并对其进行活性研究及系统分类
鉴定，包括形态特征和生理生化特性测定、细胞化
学组分分析、16S rRNA 基因序列相似性比对、基因
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期118
组 DNA G+C mol% 和 DNA-DNA 同源性测定等的多
相分类研究。从表型、基因型及系统发育 3 个层次
确定其分类地位。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 土壤样品 I06-02658 分离土样来自重庆南川
药用植物蒿本根际土。
1.1.2 分离培养基 高氏琼脂培养基（%）：可溶性
淀粉 2，KNO3 0.1，K2HPO4·3H2O 0.05，NaCl 0.05，
MgSO4·7H2O 0.05，CaCO30.1，重铬酸钾 0.05，琼
脂 1.5，pH7.2-7.4。
1.2 方法
1.2.1 放线菌分离 自然风干土样 2 g（20℃，3 周），
充分研细，加入 0.1% Na4P2O5 18 mL ，180 r/min 摇
60 min，取 1 mL 土悬液加入到 9 mL 0.05% SDS ＋ 6%
酵母膏溶液中，40℃，180 r/min 摇 20 min 取出，稀
释 10 倍，0.2 mL/ 平板，均匀涂布，28℃培养箱培养 7、
14、21、28 d。
1.2.2 菌株形态特征观察 采用 ISP2 培养基于 28℃
条件下进行埋片培养，培养 7、14、21、28 d，分别
取出埋片，用光学显微镜及电子显微镜观察气丝、
基丝和孢子丝的形态特征。
1.2.3 菌株培养特征测定 参照国际链霉菌规划中
有关放线菌的培养特征描述所采用的标准培养基
进行培养特征的测定［3］。所用培养基有 ISP2、ISP3、
ISP4、ISP5、察氏琼脂、马铃薯浸汁琼脂、营养琼
脂，斜面接种，28℃培养 7、14、21、28 d 后分别
观察并记录基内菌丝、气生菌丝的生长情况及可溶
性色素。
1.2.4 菌株生理生化特性测定 生理生化特性的测
定主要根据 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology
（Volume 4）中相应属、种鉴定的有关试验。主要包
括 pH、盐浓度和温度耐受性、唯一碳、氮源利用、
明胶液化、牛奶胨化和凝固、纤维素生长、硝酸盐
还原、H2S 的产生、几丁质降解、淀粉水解、酪蛋
白水解、脲素的利用、黑色素的产生、抗生素抗性、
苯酚耐受及溶菌酶抗性等试验。利用 API 50 CH 试
剂盒及杭州天和微生物试剂公司的细菌生化微量鉴
定管，获得唯一碳源利用指标。其他试验方法主要
参考文献［3］和［4］中的方法。
1.2.5 菌株细胞化学组分分析 采用微晶纤维素薄
层层析法（thin layer chromatography，TLC）进行全
细胞氨基酸及全细胞水解液糖型分析［5, 6］。磷酸类
脂分析［7］，甲基萘醌（MK）的提取参照 Collins［8］
的方法，用高效液相（HPLC）法分析醌型［9］。脂肪
酸组分分析按照 Kroppenstedt［10］和 Meier 等［11］的
方法分析。菌株 DNA 的 G+Cmol% 采用熔点法（Tm
值法）测定［12］，参考菌株为大肠杆菌（Escherichia
coli）JM105。
1.2.6 分子分类研究 采用 Chelex-100 法提取基因
组 DNA。DNA 样品作为 DNA 模板进行 16S rRNA 基
因序列扩增［13］。将所得序列利用 Blast 软件在 Gen-
Bank，EMBL 及 DDBJ 等数据库中进行相似性搜索，
选取同源性比较高的典型菌株的 16S rRNA 序列为
参比对象，然后用 CLUSTAL X 软件［12］进行多序列
比对并计算供试菌株与参比菌株之间的序列相似性，
采用邻接法（Neighbor-Joining）［14, 15］，用 MEGA 2.1［16］
构建供试菌与参比菌之间的系统进化树。
1.2.7 放线菌活性筛选 根际放线菌的活性筛选所
用检定菌包括 G＋细菌、G－细菌、分枝杆菌、酵母菌、
黑曲霉菌，以及各种生理活性物质筛选模型。
1.2.7.1 放线菌发酵培养基 葡萄糖 5 g ；酵母膏
5 g ；牛肉膏 5 g ；蛋白胨 5 g ；黄豆饼粉 10 g ；玉
米浆 4 g ； 可溶性淀粉 20 g ； 碳酸钙 4 g ； 氯化钴
（0.002%）1 mL ；双蒸水 1 000 mL ；pH7.2。
1.2.7.2 菌株发酵 将分离纯化的根际放线菌转接
于 ISP2 斜面培养基，28℃，培养 7 d。将生长良好
的斜面培养物分别接种于含 25 mL 发酵培养基的
100 mL 三角瓶中，180 r/min 旋转摇床，28℃培养 4 d。
1.2.7.3 抗菌活性测定 发酵液离心 4 000 r/min，取
上清测定抗菌活性。采用平板纸片法测活，纸片直
径为 10 mm。细菌平板于 37℃培养 18 h 后测定抑菌
圈 ；耻垢分枝杆菌在 35℃培养 18 h 后测定抑菌圈 ；
黑曲霉菌在 28℃培养 18 h 后测定抑菌圈。
1.2.7.4 其他生物活性检测 发酵液离心 4 000
r/min，取上清，倒入平皿中，-20℃冰箱中冷冻，冷
冻真空干燥仪中抽干，称重；同时制备菌丝浸出物：
收集菌丝体，加入 20 mL 丙酮浸泡过夜，过滤，留
取上清，挥干丙酮，50% DMSO 溶解，用于各种模
2012年第3期 119袁丽杰等 ：一株根际放线菌的分离鉴定及其生物活性初探
型活性检测。
2 结果
2.1 菌株形态及培养特征
菌株 I06-02658 菌落形态及在 ISP2 平板上的生
长状况（图 1）。菌株 I06-02658 在供试的有机及无
机培养基上生长良好，形成丰富的基内菌丝。菌丝
颜色从乳白到肉粉，在部分供试培养基上形成丰富
的气生菌丝。菌株在部分供试培养基上可以产生浅
黄至浅粉色可溶性色素。在不同培养基上的生长情
况，见表 1。
电子显微镜观察结果（图 2）显示，在 ISP2 琼
脂平板上，菌株 I06-02658 基内菌丝丰富，高度分支。
其上分化出气生菌丝，气丝断裂为棒杆状孢子。
表 1 菌株 I06-02658的培养特征
培养基 生长 气生菌丝 基内菌丝 可溶性色素
ISP2 好 白 乳白 －
ISP3 好 白 肉粉 浅粉
ISP4 好 － 乳黄 －
ISP5 好 白 浅粉 浅粉
马铃薯浸汁琼脂 好 － 肉粉 浅粉
察氏琼脂 好　 白 浅粉 浅黄
营养琼脂 好 － 浅黄 －
“－” 表示生长阴性或未产色素
2.4 细胞化学组分分析
菌株 I06-02658 细胞壁化学成分含有 meso-DAP，
全细胞水解液主要糖组成为半乳糖，磷脂主要含有
DPG、PIM、PI、PG（磷脂Ⅰ型）。优势醌型为 MK-
10、MK-10（H2）、MK-11（H4）。优势脂肪酸是 iso-
C14:0（13.9%）、iso-C16:0（31.9%）、anteiso-C15:0（29.0%）、
anteiso-C17:0（11.2%）。I06-02658基因组DNA G+C mol%
值为 71.6 mol%。
2.5 16S rRNA基因序列的数据分析及系统发育进
化树的构建
菌株 I06-02658 与相关菌株的系统进化树，见图
3。菌株 I06-02658 的 16S rRNA 基因序列长1 406 bp，
将菌株 I06-02658 的 16S rRNA 基因序列与 GenBank
中相关菌株进行同源性比较，结果表明它与已知种
Glycomyces sambucus DSM 45047T 之间序列相似性高
达 99.2%。基于 16S rRNA 基因序列的系统发育分析
也显示 I06-02658 与 Glycomyces sambucus DSM 45047T
同在一个进化分支。
2.6 分类鉴定结果分析
通过形态特征、培养特征和细胞化学组分分
析的研究结果，同时根据《伯杰细菌鉴定手册》对
Glycomyces属放线菌的描述，可将放线菌 I06-02658
2.2 生物活性检测
菌株 I06-02658 发酵液具有 Caspase7 抑制活性。
2.3 生理生化特性
菌株 I06-02658 的 pH 值生长范围为 6.0-9.0，
最适生长 pH 值为 7.0-8.0。最适生长盐浓度为小于
或等于 3%。最适生长温度 28℃。菌株对碳源利用
范围较宽，除不能利用西蒙枸橼酸盐、葡萄糖酸盐、
苯丙氨酸、乙酰胺、醋酸盐、酒石酸盐、黏液酸和
弱利用丙二酸盐外，对其余测试的碳源都能利用。
不能降解 DNA，不产生 H2S，能利用部分氮源，对
溶菌酶有抗性，对 0.05% 的酚有抗性。牛奶凝固胨
化阳性，纤维素水解阴性（表 2）。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期120
归属于 Glycomyces属。从系统进化树上可以看出，菌
株I06-02658在Glycomyces属中构成一个独立的分枝。
同时，16S rRNA 基因序列分析表明，I06-02658 与
Glycomyces属目前所报道的已知模式菌种 Glycomyces
sambucus DSM 45047T 的同源性最高，达到 99.2%，
两者之间的生理生化特征差异比较见表 3。其与该
属中 Glycomyces scopariae DSM 44968 T 之间序列相
似 性 为 98.7%， 与 Glycomyces mayteni YIM 61331T、
Glycomyces harbinensis IFO14487T 的序列相似性分别
为 98.5% 和 97.1%。菌株 I06-02658 因与上述几个
标准菌株间同源性均高于 97%，故只能确定菌株
I06-02658 为 Glycomyces属的一个菌株，其准确的分
类地位还需进行菌株间的 DNA-DNA 杂交来确定。
表 2 I06-02658的部分生理生化特性测试结果
检测项目 特征 检测项目 特征 检测项目 特征
葡萄糖 + 乳糖 + 黏液酸 -
甘露醇 + 棉子糖 + DNA -
阿拉伯糖 + 松三糖 + β-半乳糖苷 +
木糖 + 糊精 + 0.05% phenol R
半乳糖 + 淀粉 + 0.1% phenol S
山梨醇 + 蕈糖 + 0.5% phenol S
卫茅醇 + 葡萄糖胺 + 1% phenol S
鼠李糖 + 水杨素 + 2% phenol S
肌醇 + 尿素 - 牛奶凝固胨化 +
侧金盏花醇 + 七叶苷 + 纤维素水解 -
果糖 + 西蒙枸橼酸盐 - 腺嘌呤 +
甘露糖 + 丙二酸盐 +- 次黄嘌呤 -
D-核糖 + 葡萄糖酸盐 - 酪氨酸 -
山梨糖 + 苯丙氨酸 - 丙氨酸 +
麦芽糖 + 乙酰胺 - 脯氨酸 -
蔗糖 + H2S - 酪蛋白 +
松二糖 + 明胶液化 - 几丁质 -
蜜二糖 + 硝酸盐还原 + 黄嘌呤 -
纤维二糖 + 醋酸盐 - 弹力蛋白 +
5% 乳糖 + 酒石酸盐 - 溶菌酶 R
“+” 表示菌株可利用此碳源或氮源，“- “表示菌株不能利用此碳源或氮源，“S”表示菌株对底物敏感，“+-”表示反应弱阳性
2012年第3期 121袁丽杰等 ：一株根际放线菌的分离鉴定及其生物活性初探
3 讨论
糖霉菌属（Glycomyces）是由 Labeda 等 1985 年
首次描述。该属菌株细胞壁含meso-DAP和甘氨酸（胞
壁Ⅱ型），全细胞水解液糖型是核糖、木糖、甘露糖、
半乳糖，磷脂主要含 PIM（磷脂Ⅰ型）。该属优势醌
型为 MK-10、MK-11 和 / 或 MK-12，且具有种特异性。
该属优势脂肪酸为异式和反异式 C15:0、C16:0、C17:0。
基因组 DNA G+C mol% 值都在 71-73 mol% 之间。该
属已经发表的典型菌株有 10 株［17-21］。
植物根系向根际区域释放有机物，如根部的渗
出液，溶解产物，植物黏液及分泌物等，这些物质
的数量和种类依不同的植物种类和植物生长阶段而
不同［22］。近年来，通过从植物根际区域抽提 DNA
进行 16S rRNA 基因序列分析和 DNA 杂交等分子生
态学研究，揭示了根际区域微生物群落种类不同于
非根际区域 ；不同的植物种类及其种系发生、影响
植物生长的环境因素等都会影响根际区域微生物菌
种的多样性［23, 24］。有研究表明，根际区域微生物在
数量上要比非根际区域微生物多 19-32 倍［25］。根际
放线菌产生抗菌抗生素和其他活性物质的比例显著
高于根际周围土壤来源的放线菌［26］。因此，从根际
微生物的代谢产物中寻找各种生物活性物质是人们
从大自然中探寻宝藏的又一条途径。
本课题分离得到近千株根际放线菌，菌株经发
酵和多种筛选模型的检测，显示出多种生物活性，
初筛总阳性率达 31%。其中菌株 I06-02658 是分离
自重庆南川药用植物蒿本根际土的放线菌株，其发
酵液具有 Caspase7 抑制活性。目前糖霉菌属报道的
活性产物只有来源于菌株 G. harbinensis ATCC 43155 T
产生的无定形的氨基酸类物质，主要涉及抗 G+、G-
细菌及抗肿瘤［27］生物活性。本文的初步研究对于
充分认识我国药用植物根际微生物资源的价值有重
要意义，为今后深入开发利用药用植物根际微生物
资源提供了可靠的试验依据，所得菌株的生物活性
有待深入研究，以期从中开发出具新活性、新结构
的药物先导化合物。
4 结论
菌株 I06-02658 细胞壁化学成分含有 meso-DAP，
全细胞水解液主要糖组成为半乳糖，磷脂主要含有
DPG、PIM、PI、PG（磷脂Ⅰ型）。优势醌型为 MK-
10、MK-10（H2）、MK-11（H4）。优势脂肪酸是 iso-
C14:0（13.9%）、iso-C16:0（31.9%）、anteiso-C15:0（29.0%）、
anteiso-C17:0（11.2%）。I06-02658 基 因 组 DNA G+C
mol% 值 为 71.6 mol%。 系 统 进 化 树 显 示， 菌 株
I06-02658 在 Glycomyces属构成一个独立分枝。放
线菌 I06-02658 与目前该属所报道的已知模式菌种
Glycomyces sambucus DSM 45047T 同源性最高，但与
其生理生化特征有一定差异，故菌株 I06-02658 是该
属中的一个菌株，它的准确分类地位还有待其与该
属标准菌株间的 DNA-DNA 同源杂交结果。
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表 3 菌株 I06-02658和 G. sambucus DSM 45047T
表型特征差异
“+ ”表示反应阳性，“-” 表示反应阴性，“ +-”表示反应弱阳性
特征 I06-02658 G. sambucusDSM 45047T
Acid produced from:
Sucrose - +
Melibiose - +
D-ribose - +
Lactose + -
Glucose + -
Raffinose - +
Maltose - +
Assimilation of sole carbon sources
Galactose + -
Fructose + -
Sorbose + -
Decomposition of gelatin +- -
Reduction of nitrate - +-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期122
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（责任编辑 李楠）