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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-03-22
基金项目 : 兰州市生物医药专项（2011-1-61）
作者简介 : 鞠美芳 , 女 , 硕士 , 研究方向 : 动物传染病及病原分子流行病学 ; E-mail: jumeifang8899011@163.com
通讯作者 : 柳纪省 , 男 , 研究员 , 博士生导师 , 研究方向 : 动物传染病及分子流行病学 ; E-mail: liujixing@hotmail.com
狂 犬 病（Rabies） 是 由 狂 犬 病 病 毒（Rabies
virus，RV）感染中枢神经系统而引起的烈性人兽共
患传染病，又称恐水病、疯狗病。目前对该病只能
预防，尚无特殊有效的治疗方法，所以人被携带 RV
的动物咬伤、抓伤后，主要采取伤口紧急处理并接
种狂犬疫苗和抗狂犬病血清来预防感染狂犬病。这
些措施对防制该病很有效，但是如果未能及时采取
这些预防措施或咬伤部位离颜面部很近，都有可能
造成该病的发生，而一旦发病，目前尚无有效方法
治疗，病死率几乎 100%［1］。我国是仅次于印度的
受狂犬病危害较严重的国家之一，该疫情自 1998 年
以来一直在我国呈上升趋势，严重威胁着畜牧业的
发展和人群的健康，已成为严重危害我国公共卫生
的重大疫病［2］。
RV 基因组中约 91% 的核苷酸为结构基因，由
3端 poly（A）-5端 AACA 依次编码核蛋白（NP）、
磷酸蛋白（NSP）、基质蛋白（MP）、糖蛋白（GP）
和转录酶蛋白（LP）［3］。GP 是存在病毒颗粒表面的
唯一的蛋白质，以三聚体形式构成病毒的棘状突起，
在病毒致病性和嗜神经性中发挥重要作用。而糖蛋
白膜外区有 4 个抗原位点和表位可识别宿主细胞的
受体并与之结合［4］，诱导机体产生保护性中和抗体，
狂犬病病毒 aG株糖蛋白膜外区的原核表达及纯化
鞠美芳 殷相平 柳纪省
（中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部草食动物疫病重点开放实验室，兰州 730046）
摘 要： 旨在有效检测狂犬病毒抗原及抗体。以狂犬病病毒 aG株为模板，反转录扩增糖蛋白膜外区基因，并进行序列测定。
将目的片段与表达载体 pET-32a（+） 分别双酶切、胶回收后相连并转化至 Rosseta（DE3） 菌株。选取阳性克隆经 IPTG诱导表达后，
进行 SDS-PAGE和Western blotting及质谱鉴定。结果显示，在大肠杆菌中成功表达了糖蛋白膜外区。本研究为建立检测狂犬病毒
抗原及抗体的 ELISA诊断方法奠定了基础。
关键词： 狂犬病病毒 糖蛋白膜外区 原核表达
Prokaryotic Expression and Purification of Glycoprotein Extracellular
Domain of Rabies Virus Strain aG
Ju Meifang Yin Xiangping Liu Jixing
（Lanzhou Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology，Key
Laboratory of Grazing Animal Disease of the Ministry of Agriculture，Lanzhou 730046）
Abstract: The gene of glycoprotein extracellular domain from rabies virus aG strain was amplified by reverse transcriptase-polymerase
chain reaction （RT-PCR） . The product was purified and subcloned into the expression vector pET-32a （+） . The recombinant plasmid pET-G
was transformed into expression strain E. coli Rosetta （DE3） cells and then Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside （IPTG） was added to induce
protein expression. The recombinant protein of glycoprotein extracellular domain was analyzed by SDS-PAGE, Western blotting and mass
spectrometry. Results showed that the recombinant protein had been successfully expressed in E. coli. The study establishes the foundation of
ELISA kits to detect the antibodies against rabies virus or antigens of rabies virus.
Key words: Rabies virus Glycoprotein extracellular domain Prokaryotic expression
2012年第9期 115鞠美芳等 ：狂犬病病毒 aG 株糖蛋白膜外区的原核表达及纯化
也能刺激机体产生细胞免疫应答，可抵抗 RV 经外
周和脑内途径的攻击，故近年来成为分子生物学（疫
苗学）研究的热点［5-8］。
本研究以狂犬病病毒 aG 株为模板，通过 RT-
PCR 扩增和定向克隆方法构建重组表达质粒，利用
大肠杆菌表达出带有 6×His 标签的 RV 糖蛋白膜
外区蛋白，旨在为建立检测狂犬病毒抗原及抗体的
ELISA 诊断方法奠定良好的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
狂犬病病毒 aG 株组织毒及原核表达载体 pET-
32a （+）为中国农业科学院兰州兽医研究所传染病
室保存 ；RNA 提取试剂盒购自 QIAGEN ；AMV 反转
录酶，dNTP，Oligo dT，RNase inhibitor，Premix Taq
DNA 聚合酶，pMD18-T 载体，大肠杆菌菌种 DH5α、
Rosseta（DE3），核酸 Marker 及限制性内切酶 EcoR I、
Hind III 为宝生物工程（大连）有限公司产品 ；蛋白
预染 Marker 产自 GenStar ；中国药品生物制品检定
所生产的、第五批、文号为（2002）国生标字 0010
的抗狂犬病人免疫球蛋白国家标准品为一抗，辣根
过氧化物酶标记的抗人的免疫球蛋白 IgG 为二抗、
异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自上海生物工
程有限公司 ；胶回收试剂盒购自 AXYGEN ；4×蛋
白上样 buffer 购自 Sigma ；其他试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 参照 GenBank 及文献中已
发表的 RV GP 基因序列，设计并合成了带有 EcoR I、
Hind III 酶切位点（下划线部分）的 GP 膜外区引物。
GP 膜外区上游引物：5-CCGGAATTCATGAAATTCC-
CTATTTACACG-3（30 bp）；GP 膜外区下游引物 ：
5-CCCAAGCTTTTACTCCCCCCAGTTCG-3（27 bp）。
1.2.2 病毒 RNA 的提取 取狂犬病病毒 aG 株致死
小鼠脑组织，加适量含抗生素的溶液研磨，用 PBS
制成 1 5 的悬液，反复冻融 2 次。然后以 7 500 r/min
于 4℃离心 10 min，取上清液用于提取 RNA。按
QIAGEN RNeasy Mini Kit 说明书提取 RNA。获得的
RNA 于 -20℃保存或直接用于反转录。
1.2.3 RT-PCR、重组质粒的构建、鉴定、测序及
序列分析 以提取的 RNA 为模板进行反转录合
成 cDNA，然后 PCR 扩增 GP 膜外区，反应程序
为 ：95℃预变性 5 min ；94℃变性 1 min，58℃退火
1 min，72℃延伸 2 min，共 35 个循环 ；72℃再延伸
10 min，4℃ 5 min。扩增产物于 10 g/L 的琼脂糖凝
胶电泳检测。
将 PCR 产物切胶、用胶回收试剂盒回收纯化，
并与 pMD18-T 载体在 16℃连接 4 h，转化至大肠杆
菌感受态细胞 DH5α，涂布于含 100 mg/L 氨苄青霉
素（Amp）的 LB 琼脂平板上，37℃培养过夜。经蓝
白斑筛选后，挑斑、摇菌，用质粒（小量）提取试
剂盒提取质粒，将 PCR 和酶切鉴定为阳性的重组质
粒命名为 pMD-G，送上海生物工程有限公司测序。
用分子生物学软件 DNAMAN、DNAStar、Mega 对序
列进行分析。
1.2.4 重组原核表达载体的构建和鉴定 将阳性重
组质粒 pMD-G 和 pET-32a （+）载体同时分别用限制
性内切酶 EcoR I 和 Hind III 37℃水浴双酶切 4 h，琼
脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化目的基因和载体片段，
将二者用 T4 DNA 连接酶 16℃连接过夜后，转化感
受态细胞 DH5α，用含 Amp+ 的 LB 琼脂平板筛选，
挑斑摇菌，提取质粒，经 PCR 和酶切鉴定为阳性的
重组质粒命名为 pET-G，并送上海生物工程有限公
司测序。
1.2.5 重组表达菌的诱导表达及 SDS-PAGE 凝胶电
泳 将阳性重组质粒 pET-G 转化至 Rosseta （DE3）
中，涂布于含 Amp+ 的 LB 琼脂平板，置 37℃过夜，
挑取单个菌落于含 Amp+ 的 LB 培养基中，37℃振
荡培养至 OD600 值为 0.6 时，加入 IPTG 至终浓度为
1.0 mmol/L，置 25℃振荡培养诱导表达目的蛋白，6
h 后取 1.0 mL 菌液，12 000 r/min 离心 2 min，弃去
上清液，加 PBS 和 4×蛋白上样 buffer 重悬后 100℃
煮沸 3-10 min，取 10 μL 上样于 5% 浓缩胶、10%
分离胶以浓缩胶电压 70 V、分离胶电压 120 V 进行
SDS-PAGE。同时对转化至 Rosseta（DE3）的空载体
也以相同的条件诱导作为对照。
1.2.6 目的蛋白（包涵体）的分离、纯化及浓度
测定 阳性重组菌按上一步条件大量诱导表达后，
10 000 r/min 离心 10 min，收集菌体，用结合缓冲
液以 10 1 的体积比重悬沉淀后，以 300 W，超声
3 s、间歇 3 s 的方式超声破碎 30 min。加 PBS 和 4×
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期116
蛋白上样 buffer 重悬后 100℃煮沸 3-10 min，进行
SDS-PAGE。将胶置于 NaAc 溶液中脱色，目的条带
呈白色条带后，切下于蒸馏水中脱去 NaAc，然后
置于加有蛋白电泳缓冲液的密闭透析袋内，于水平
电泳槽内 80 V 电泳过夜，使目的蛋白游离于透析袋
内，将袋置于 PEG8000，得到高纯度的蛋白。将纯
化后的蛋白进行 SDS-PAGE 分析，并在英国产的品
牌型号为 Nanovue 的超微量分光光度计上，以 PBS
（pH7.4）为空白对照，用紫外分光光度法测定蛋白
质的含量，-20℃保存。
1.2.7 重组蛋白的 Western blotting 鉴定 诱导后的
蛋白制样，经 SDS-PAGE 后转印至硝酸纤维素膜，
PBST 洗膜 3 次，每次 5 min，放入含有 3% BSA 的
PBST 中，封闭过夜。PBST 洗膜 3 次，每次 10 min，
与 1 200 稀释的一抗（即中国药品生物制品检定所
生产的、第五批、文号为（2002）国生标字 0010 的
狂犬病人免疫球蛋白国家标准品）于 37℃结合 1.5 h。
用 PBST 彻底洗膜 3 次，每次 10 min，加入 1 4 000
稀释的二抗（即辣根过氧化物酶标记的抗人的免疫
球蛋白 IgG），室温下轻摇孵育 1 h，PBST 洗膜 3 次，
每次 10 min，经 DAB 显色分析结果，以检查表达产
物是否具有特异性免疫活性。
1.2.8 重组蛋白的质谱鉴定 切割下 SDS-PAGE 电
泳图谱中的目的蛋白条带，密封于 50% 的乙氰（色
谱纯）溶液中保存，送至中国科学院动物研究所进
行质谱鉴定。
2 结果
2.1 GP膜外区基因的扩增和克隆
RT-PCR 扩增出约 1 317 bp 的 GP 膜外区基因，
与预测结果一致（图 1）。回收扩增产物，连接到
pMD18-T 载体中，得到重组质粒 pMD-G，经 EcoR I
和 Hind III 双酶切鉴定正确（图 2）。
2.2 序列测定与分析
重组阳性质粒测序结果表明，狂犬病毒 aG 株 GP
膜外区基因长 1 317 bp，编码 440 个氨基酸，整个蛋
白的分子量为49.245 kD，其中含有43个碱性氨基酸，
51 个酸性氨基酸，140 个疏水氨基酸和 117 个极性
氨基酸，在 pH7.0 时，蛋白所带电荷为 -5.308。
所测 aG 株 GP 膜外区核苷酸序列与 GenBank
中登录号为 JN234417.1、JN234416.1、JN234414.1、
JN234412.1、JN234415.1、JN234413.1、JN234411.1
的 4aG 株 及 AY009097.1 的 PG 株、L04522.1 的 中
国疫苗株、GU936876.1 的 334 株相比核苷酸同源性
为 99%，AEV43277.1、AEV43275.1、AAG34721.1、
AEV43278.1 氨基酸同源性为 99%。将 GP 膜外区基
因测序结果于 MEGA5 中，建立系统进化树（图 3）。
2.3 重组表达质粒pET-G的鉴定
将所获得的重组表达质粒 pET-G 用 EcoR I 和
Hind III 双酶切鉴定和 PCR 鉴定，结果（图 4）与预
期大小相符，表明重组原核表达载体构建成功。
2.4 SDS-PAGE电泳及目的蛋白的分离、纯化结果
GP 膜外区基因表达产物 SDS-PAGE 电泳后，经
染色、脱色，发现含重组质粒的诱导菌在 60 kD（从
载体起始密码子到目的蛋白终止密码子，所以大于
理论值 49.245 kD）处出现一条粗的蛋白带（图 5，
M. DL2000 DNA Marker ；1. PCR 扩增产物
图 1 GP膜外区的 RT-PCR鉴定
M1. DL2000 DNA Marker ；1，2. 重组质粒经 EcoR I+Hind III 双酶切鉴定 ；
3. pET-32a（+）经 EcoR I+Hind III 双酶切 ；M2. λ-EcoT14 Ⅰ digest marker
图 2 pMD-G膜外区重组质粒的酶切鉴定
2012年第9期 117鞠美芳等 ：狂犬病病毒 aG 株糖蛋白膜外区的原核表达及纯化
第 2 泳道），大小与 6×His-GP 融合蛋白的理论值
一致，随着诱导时间的增加，其表达量随之增加，
在 6 h 时达到最大值（图 5，第 5 泳道），而相同条
件诱导的空载体转化菌及未诱导的阳性表达菌没
有出现相同的条带（图 5，第 3 泳道、第 4 泳道），
切胶纯化后得到无杂带的目的蛋白（图 5，第 1
泳道）。
纯化后的蛋白用英国产的品牌型号为 Nanovue
的超微量分光光度计上，用紫外分光光度法测定蛋
白质的含量，浓度达 1.2 mg/mL。
2.5 Western blotting检测结果
与蛋白凝胶上目的蛋白相同位置对应的硝酸纤
维素膜上出现了一条印迹（图 5，WB 泳道），表明
阳性重组质粒 pET-G 诱导表达的蛋白可被狂犬病人
免疫球蛋白国家标准品和辣根过氧化物酶标记的抗
人的免疫球蛋白 IgG 特异识别，说明目的蛋白具有
良好的免疫学活性。
2.6 质谱鉴定结果
中科院动物所蛋白质谱分析仪（LC-MS/MS，设
备型号 ：LCQ Deca Xp plus）（液相质谱联用仪）对
图 3 糖蛋白膜外区基因的系统进化树
图 4 重组质粒 pET-G的双酶切及 PCR鉴定
1，2. 重组质粒 pET-G 经 EcoR I+Hind III 双酶切鉴定 ；M. DL2000 DNA
Marker ；3，4. 重组质粒 pET-G 的 PCR 扩增
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期118
GP 膜外区蛋白进行质谱分析，从质谱峰图（图 6）
中解析出的肽段序列，搜索数据库表明 VGHISAIK、
YEESLHSPYPDYHWLR、ESLVIISPSVANLDPYDNS-
LHSR、LGTSCDIFTNSR 以及 AYTIFNKTLMEAEAHY
五条肽段只在假定的 G 蛋白中存在，故可鉴定为假
定的 G 蛋白中的片段。从峰值数据来看纯化蛋白质
中主要为狂犬病毒 aG 株 G 蛋白。
3 讨论
目前，人们已从不同的狂犬病毒株获得了全长
糖蛋白并在大肠杆菌和真核细胞中进行了表达［9-13］，
如 1983 年 -1984 年，在原核系统成功表达出 RV
GP，但其只有免疫反应性而缺乏使试验动物产生中
和抗体及保护动物抗感染的能力 ；后转向真核表达
系统，以痘苗病毒（浣熊、禽、金丝雀）、人 5 型腺
病毒、犬腺病毒为载体，制备狂犬病病毒糖蛋白的
重组疫苗 ；1994 年用带有 RV G 的表达载体接种小
鼠，诱导产生抗狂犬病的特异性免疫反应，并抵抗
RV 的攻击 ；另外，为了研究糖蛋白中不同肽段的功
能，制备和合成了糖蛋白的多肽及合成肽疫苗，但
免疫效果不理想，原因是糖蛋白诱导中和抗体的能
力主要依赖于其自身二级结构及三级结构的完整性。
由于已有的检测狂犬病抗原抗体的 ELISA 试剂
盒种类很少，且价钱昂贵，所以本试验要建立了一
种廉价有效地检测狂犬病毒抗原及抗体的 ELISA 诊
断方法。
本研究成功克隆和表达了狂犬病毒 aG 株 GP 膜
外区基因，测序的核苷酸序列与 GenBank 中的 4aG
株、PG 株、中国疫苗株、334 株相比核苷酸同源性
WB. Western blotting 分析 pET-G ；1. 纯化蛋白 ；2. pET-G 经 IPTG
诱导 4 h ；3. 空白对照 ；4. 未经 IPTG 诱导的 pET-G ；5. pET-G 经
IPTG 诱导 6 h ；M. 宽范围预染蛋白质分子量标准
图 5 表达蛋白的 SDS-PAGE分析和蛋白免疫
印迹法分析
为 99%，AEV43277.1、AEV43275.1、AAG34721.1、
AEV43278.1 氨基酸同源性为 99%，可以作为狂犬病
分子生物学诊断的依据。
试验中采用 pET 融合表达系统和原核启动子 T7
Lac，能高效表达外源蛋白。表达产物位于包涵体内，
而包涵体是原核表达系统表达重组蛋白的主要存在
形式之一。包涵体的形成使目的蛋白相对集中，易
于提取。但是蛋白表达量不是很高，原因可能是表
达出的 G 蛋白具有的疏水特性对细菌的正常表达有
一定影响。
在大肠杆菌中表达的蛋白构象和免疫原性与天
然蛋白不同，不能用作狂犬病毒疫苗，仅能作为诊
断试剂。但满足本研究的试验要求，且大肠杆菌中
表达蛋白遗传背景清楚，培养周期比真核表达周期
短，经济快捷。
经 Western blotting 验证，目的蛋白可被狂犬病
人免疫球蛋白国家标准品及辣根过氧化物酶标记的
抗人的免疫球蛋白 IgG 特异识别，说明该蛋白具有
良好的免疫学活性。虽然该蛋白有免疫反应性，但
其是否有使试验动物产生中和抗体及保护动物抗感
图 6 鉴定目的蛋白的质谱峰图
2012年第9期 119鞠美芳等 ：狂犬病病毒 aG 株糖蛋白膜外区的原核表达及纯化
染的能力需要后继的动物试验来验证。
4 结论
本研究以狂犬病病毒 aG 株为模板，通过 RT-
PCR 扩增和定向克隆方法构建重组表达质粒，利用
大肠杆菌表达出带有 6×His 标签的 RV 糖蛋白膜外
区蛋白，为生产纯度高且经济的 RV GP 膜外区抗原
奠定了基础，也为建立检测动物狂犬病抗原抗体的
ELISA 诊断方法奠定基础，同时有助于 RV 相关的
基础和应用研究的开展。
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（责任编辑 马鑫）