全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2007-12-12
基金项目:甘肃省自然基金项目(3ZS051-A25-076);甘肃省科技攻关(2GS0S2-A41-006-02)
作者简介:李江涛(1981-),男,甘肃岷县人,硕士研究生,主要从事动物传染病学与分子免疫学研究
通讯作者:柳纪省,E-mail:L ujixing@hotmail.com.cn
狂犬病病毒(Rabies virus,RV)是一种能引起人和动物高度致死性疾病的嗜神经病毒,属弹状病毒科狂
犬病毒属,其基因组大小约为 12kb,编码 5种主要结构蛋白,即核蛋白(N)、基质蛋白(M)、磷酸化蛋白
(P)、糖蛋白(G)和转录酶蛋白(L)[1]。核蛋白是除糖蛋白以外具有免疫原性的另一种重要的内部结构蛋白,
也是毒粒中最保守的蛋白,在不同毒株之间有高度的保守性[2]。对狂犬病毒 CVS株核蛋白基因克隆和序列
分析,构建原核表达重组质粒,在大肠杆菌中进行蛋白质诱导表达,并对表达产物进行了分离纯化和鉴定,
为进一步利用原核表达产物研制狂犬病的基因疫苗和诊断试剂盒奠定基础。
1 材料和方法
1.1病毒、菌株、质粒与主要试剂
狂犬病病毒CVS株核蛋白基因的原核表达、纯化及鉴定
李江涛 1 李轶女 2 殷相平 1 邹媛媛 2 张志芳 2 柳纪省 1
(1中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰州 730046;
2中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081)
摘 要: 用RT-PCR技术对狂犬病病毒(RV)CVS株核蛋白(N)基因进行扩增,经克隆与序列分析,该基因编码
450个氨基酸残基。将目的基因克隆到原核表达载体 pET28a(+)中,构建了重组质粒pET-N,将其转化表达菌BL21
(DE3) ,于37℃1.0mmol∕L IPTG条件下诱导表达。大肠杆菌菌体裂解产物经SDS-PAGE电泳分析,在分子量约为54
kD处出现一新蛋白带,和预期的目的蛋白的分子量相符。质谱鉴定的结果表明成功表达了RV N蛋白,为狂犬病的进一
步研究奠定了基础。
关键词: 狂犬病病毒 核蛋白 原核表达
Prokaryotic Expression,Purification and Identification of N
Protein Gene of Rabies Virus Strain CVS
Li Jiangtao1 Li Yinu2 Yin Xiangping1 Zou Yuanyuan2 Zh g Zhifang2 Liu Jixing1
(1Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,State Key Laboratory of Veterinary
Etiological Biology,Key Laboratory of Animal Virology of Ministry of Agriculture,Lanzhou 730046;
2Biotechnology Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Be jing 100081)
Abstract: N gene of RV CVS strain was amplified by reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR).
The product was purified and cloned into pMD 18-T,The p sitive recombinant pMD-N was used for sequencing. The
results showed that the complete length of N gene was 1 353bp,which encoded 450 amino acids. The N gene was
subcloned into the prokaryotic vector pET28a(+). The positive recombinant pET-N was transformed into E.coli BL21
and induced in 1.0mmol∕L IPTG in 37℃,SDS-PAGE was performed to analyze the N gene production. Results
showed that the protein was highly expressed in E.coli,and t e molecular weight was 54kD. The mass spectrum results
proved that the N protein of RV CVS strain was successfully expressed,this may provide tools for fu ther study of rabies
diseases vaccines and the diagnostic reagent development.
Keywords: Rabies virus Nucleoprotein Prokaryotic expression
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
狂犬病病毒 CVS株致死小鼠、DH10B、BL21(DE3)和 pET28a(+)载体由本实验室保存。pMD18-T载体﹑
AMV反转录酶、PremixTaqDNA聚合酶、RNA酶抑制剂、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、dNTP、及限制
性内切酶 BamHⅠ和 NotⅠ、胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品。RNA提
取试剂盒购自 Qiagen公司。DL2000plusDNAMarker和 BriliantBluePlusPre-StainedProteinStandard购于
Trans公司。其他试剂均为分析纯试剂。
1.2 引物设计与合成
参考 GenBank中收录的 CVS株 N基因序列设计了如下一对引物,并在 N1、N2划线处分别引入
BamHⅠ、NotⅠ酶切位点。
上游引物 N1:5′-AGGATCCATGGATGCCGACAAGAT-3′
下游引物 N2:5′-AGCGGCCGCTTATGAGTCATTCGAATACGT-3′
引物由大连宝生物工程有限公司合成。
1.3 病毒 RNA的提取
取狂犬病病毒 CVS株致死小鼠一只,无菌解剖取脑组织少许,加适量含抗生素的溶液研磨,用 PBS制
成 1∶5的悬液,反复冻融。然后以 7500r/min于 4℃离心 10min,取上清液用于提取 RNA。其他步骤按 RNA
提取试剂盒说明书进行。获得的 RNA于-20℃保存或直接用于反转录。
1.4 目的基因的扩增、克隆及序列分析
使用合成的引物 N2,用 AMV反转录酶和 PremixTaqDNA聚合酶,进行 RT-PCR反应扩增目的基因,
用 10g/L的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。将 PCR产物纯化回收,并与 pMD18-T载体连接,转化 DH10B
感受态细胞,用 Amp+LB琼脂平板筛选,提取质粒,酶切鉴定重组质粒,阳性克隆命名为 pMD-N,送大连宝
生物工程有限公司测序。应用生物软件对序列进行分析。
1.5 重组原核表达载体的构建
用 BamHⅠ和 NotⅠ从 pMD-N质粒上双酶解切下目的基因片断,纯化回收后与同样双酶切的 pET28a
(+)载体相连,转化 DH10B感受态细胞,用 kan+LB琼脂平板筛选,经酶切鉴定为阳性的重组质粒命名为
pET-N。
1.6 表达载体在大肠杆菌中的表达及 SDS-PAGE凝胶电泳
将 pET-N阳性质粒转化至 BL21(DE3)中,挑取单个菌落于 kan+LB培养基中,于 37℃振荡培养至
OD600值为 0.6～1.0时,加入 IPTG至终浓度为 1.0mmol∕L诱导表达目的蛋白,并分别在 2、3和 4h时取
1.0ml菌液煮沸,于 12%SDS-PAGE分离胶上进行电泳。同时收集未诱导的菌液作为阴性对照,对经转化
BL21的空载体也以相同的条件诱导,作为对照。
1.7 包涵体的分离与纯化
用细胞裂解缓冲液 I(50mmol∕LTris-Cl,1mmol∕LEDTA,100mmol∕LNaCl,100mmol∕LPMSF)溶解
菌体沉淀,超声破碎菌体后,于 4℃高速离心 15min,沉淀重悬于 9倍体积的 4℃预冷的细胞裂解缓冲液 I
(50mmol∕LTris-Cl,10mmol∕LEDTA,100mmol∕LNaCl,0.5%TritonX-100),室温放置 5min后 4℃高速离
心 15min,沉淀重悬于 100# 水中,上清和沉淀各取 10#l与 2×SDS凝胶加样缓冲液混合后,SDS-PAGE电
泳。
1.8 重组蛋白的质谱鉴定
切割下 SDS-PAGE电泳图谱中的目的蛋白条带,送至中科院动物研究所进行质谱鉴定。
2 结果
2.1 N基因的扩增和克隆
RT-PCR扩增出约 1353bp左右大小的片断,与预测结果一致。回收扩增产物,克隆到 pMD18-T载体
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中,得到重组质粒 pMD-N,经 BamHⅠ和 NotⅠ双酶切鉴定正确(图 1)。
2.2 序列测定与分析
重组阳性质粒测序结果表明,狂犬病毒 CVS株 N基因 cDNA阅读框全长 1353bp,编码 450个氨基酸。
整个蛋白的分子量为 50.73kD,其中含有 49个碱性氨基酸,55个酸性氨基酸,152个疏水氨基酸和 123个
极性氨基酸,在 pH7.0时,蛋白所带电荷为-4.090。
所测 CVS株 N基因核苷酸序列与 GenBank中登录号为 DQ286762的 CVS株 N基因相比,核苷酸同源
性为 99.7%,氨基酸同源性为 99,3%;与 CVS-11、PV-11、SRV9和 SAD-B19标准毒相比,核苷酸同源性为
92.6%～99.6%,核苷酸同源性为 97.6%～99,3%;与 HEP-Flury和 ERA疫苗株相比,核苷酸同源性分别为
96.7%和 92.9%,氨基酸同源性分别为 98.7%和 98.0%;与国内分离的 7株野毒株(贵州 2株、湖南 2株、江
苏 2株、河南 1株)相比,氨基酸同源性为 92.5%～99.3%,核苷酸同源性为 96.9%～98.2%。
2.3 重组表达质粒的鉴定
将所获得的重组表达质粒 pET-N用 BamHⅠ和 NotⅠ双酶切鉴定,酶切结果与预期大小相符(图 2),
表明重组原核表达载体构建成功。
图 1 pMD-N经 BamHⅠ和 NotⅠ酶切鉴定 图 2 pET-N经 BamHⅠ和 NotⅠ酶切鉴定
M.DL2000plusDNAMarker 1、2.pET-N∕BamHⅠ+NotⅠM.DL2000plusDNAMarker 1、2.pMD-N∕BamHⅠ+NotⅠ
2.4 SDS-PAGE电泳及目的蛋白的分离、纯化结果
N基因表达产物 SDS-PAGE电泳后,经染色、脱色,发现含重组质粒的诱导菌在 54kD处出现一条特别
粗的蛋白带,大小与 6*His-NP融合蛋白的理论值 54.3kD一致,随着诱导时间的增加,其表达量随之增加,
在 4h时达到最大值,而未诱导的重组质粒转化菌和空载体质粒转化菌没有出现相同的条带(图 3-a)。用本
方法分离、纯化的蛋白,纯度较高,结果见图 3-b。
图 3-a 重组 N蛋白的 SDS-PAGE电泳结果
M.BriliantBlue PlusPre-Stained Protein Standard
1,2,3.pET-N∕BL21inducedwithIPTGfor2h,3h,4h
4.pET-N∕BL21untreatedwithIPTG 5.pET28a(+)∕
BL21inducedwithIPTG
图 3-b N蛋白的纯化结果
M.pET-N∕BL21inducedwithIPTGfor4h
1.PurificationoftheexpressedNprotein
李江涛等:狂犬病病毒CVS株核蛋白基因的原核表达、纯化及鉴定 105
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2.5 质谱鉴定结果
对 N蛋白的质谱分析图谱见图 4,鉴定结果表明,N蛋白肽段质量数与理论值匹配率为 70%。从质谱峰图
中解析出的肽段序列,搜索数据库表明,IVEHHTLMTTHK、GSNMDADKIVFK、ELQEYEAAELTK、SDVALADD
GTVNSDDEDYFSGETR、VNNQVVSLKPEIVDQYEYK以及 TNIADRIEQIFETAPFVK等六条肽段只在假定的 N
蛋白中存在,故可鉴定为假定的 N蛋白中的片断。从峰值数据来看纯化的重组融合蛋白质中主要为狂犬
病毒 CVS株 N蛋白。
图 4 质谱分析结果
3 讨论
成功克隆和表达了狂犬病病毒 CVS株 N基因。测序结果与狂犬病病毒标准毒株、疫苗株以及国内分
离的 7株野毒株比对发现,核苷酸同源性都在 92%以上,氨基酸的同源性更高,其中与我国分离的野毒株
的氨基酸的同源性都在 96.9%以上,进一步说明 N基因保守性很高,可以作为狂犬病分子生物学诊断依
据。Takita[3]和 Lodmel[4]等通过应用小鼠免疫实验证明核蛋白是一种重要的保护性抗原,抗狂犬病病毒核衣
壳抗体具有抵御狂犬病病毒攻击的保护作用,在体内能抵抗狂犬病病毒感染。因此,在原核表达系统中成
功地表达 N蛋白可用于狂犬病 DNA免疫和作为诊断抗原检测 RV奠定了基础。
选用原核表达载体 pET28a(+)构建编码 N基因的重组质粒,其在大肠杆菌中的表达物为融合蛋白,意
义在于融合蛋白质在大肠杆菌细胞内较稳定,不易被细胞内的蛋白酶水解[5]。当表达的蛋白量达到一定程
度时,蛋白可能呈不溶形式,并于细胞浆中的一些其他物质形成不溶性包涵体,其主要成分是重组蛋白(约
占 40%～90%),其他成分还有细菌蛋白如 RNA聚合酶的 4个亚基、外膜蛋白 OmpF、OmpA、OmpC;质粒编
码的蛋白如抗菌素酶;核酸如核糖体的 16S、23SrRNA及 mRNA等[6]。采用的蛋白包涵体纯化方法比较简
单,获得的纯度较高,既可直接用于蛋白质的质谱鉴定,也可用作于 DNA免疫和诊断抗原。
生物质谱技术最强大的应用功能之一是能够鉴定蛋白质复合物的组成成分,可以直接通过对蛋白复
合体的组分进行蛋白序列分析,来鉴定蛋白质,具有简单、方便、快速、准确的优点。是目前进行蛋白质鉴定
的首选方法之一[7]。表达的融合蛋白经质谱鉴定其含有目的蛋白,表明成功表达了狂犬病病毒 CVS株 N蛋
白,为狂犬病的进一步研究奠定了基础。
参考 文献
1 TordoN,PochO,ErmineA.Virology,1988,165:565~576.
2 殷震,刘景华.动物病毒学(第 2版)[M].北京:科学出版社,1997,777~955.
3 TakitaSY,FujiH,MifuneK.ArchVirology,1993,132:51.
4 LodmelDL,EspositoJJ,EwaltLC.JVirol,1993,67(10):6080~6086.
5 牛挺,刘霆,贾永前,等.四川大学学报(医学版),2005,36(3):301~304.
6 SavvasC,MakridesJ.MicrobiologicalReviews,1996,(9):512~538.
7 CrowleyTA,HayesMA.Protecmics,2005,5:3798~3804.
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