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Cloning and Characterization Analysis of ZmJAZ4,a JAZ Family Gene in Maize(Zea mays L.)

玉米JAZ家族基因ZmJAZ4的克隆及功能分析



全 文 :·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(3):96-101
JAZ(Jasmonate ZIM-domain)蛋白是一类新发
现的植物中特有的蛋白家族,其通过抑制茉莉素调
控基因的表达而参与植物的生长发育[1,2]。JAZ 属
于 TIFY 家族,该家族蛋白序列都含有高度保守的
TIF[F/Y]XG 氨基酸序列,且 JAZs 可依靠该 TIFY
基序形成同源或者异源二聚体。作为 TIFY 家族中
收稿日期 :2014-10-13
基金项目 :国家高技术研究发展计划“863”项目(2012AA10A306),国家重点基础研究发展计划“973”项目(2014CB138200),转基因
专项(2008ZX08003-002)
作者简介 :晏胜伟,男,硕士研究生,研究方向 :植物分子生物学与基因工程 ;E-mail :zhongdayan109@163.com
通讯作者 :陈茹梅,女,研究员,研究方向 :植物分子生物学与基因工程 ;E-mail :chenrumei@caas.cn
玉米 JAZ 家族基因 ZmJAZ4 的克隆及功能分析
晏胜伟  孙程  周晓今  陈茹梅
(中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081)
摘 要 : JAZ(Jasmonate ZIM-domain)蛋白是植物特有的一类转录因子,通过抑制茉莉素调控基因的表达,在植物的生长
发育及非生物胁迫等方面发挥重要的功能。从玉米 B73 自交系中克隆到一个新的 JAZ 家族基因 ZmJAZ4,该基因 cDNA 全长为 651
bp,编码蛋白含有 216 个氨基酸,分子量约为 23.1 kD,pI 为 10.78,属于碱性蛋白。Real-time RT-PCR 结果表明,ZmJAZ4 主要在
茎端分生组织、雄穗、发育早期的种子以及胚乳中表达。系统进化分析显示,ZmJAZ4 与 AtJAZ10 转录因子相似性较高。亚细胞定
位试验表明,ZmJAZ4 定位于细胞核内。ZmJAZ4 在酵母细胞中不具有转录激活活性。激素及胁迫处理表明,ZmJAZ4 在地上部的
表达受 PEG、NaCl、SA、GA 和 ABA 诱导,而在地下部的表达受到 ABA 和 GA 诱导。结果分析表明,ZmJAZ4 可能是一个重要的
转录调控因子,参与调控多种激素信号通路及非生物胁迫响应。
关键词 : 茉莉素 ;ZmJAZ 基因 ;逆境胁迫
DOI :10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.013
Cloning and Characterization Analysis of ZmJAZ4,a JAZ Family
Gene in Maize(Zea mays L.)
Yan Shengwei Sun Cheng Zhou Xiaojin Chen Rumei
(Biotechnology Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081)
Abstract: Jasmonate ZIM-domain(JAZ)proteins are a group of plant-specific transcription factors, which have important function in
plant growing development and abiotic stress by inhibiting the expression of genes associated with JA regulation. In this study, a novel JAZ family
gene, named ZmJAZ4, was isolated from maize(Zea mays L.)inbred lines B73. The ZmJAZ4 cDNA has a total length of 651 bp and encodes
a protein of 216 amino acids with a molecular weight of about 23.1 kD and a isoelectric points of 10.78, belonging to the basic protein. Real-time
RT-PCR showed that ZmJAZ4 was mainly expressed in shoot apex meristem, tassel, developing seeds and endosperm. Phylogenetic analysis
revealed that ZmJAZ4 was related to AtJAZ10 from Arabidopsis. Subcellular localization experiment showed that ZmJAZ4 was localized to the
nucleus. ZmJAZ4 possessed no transcriptional activating activity in yeast cells. Various treatments were performed to detect the expression level
of ZmJAZ4 in response to phytohormones or abiotic stresses. The transcripts of ZmJAZ4 was induced by PEG, NaCl, SA, GA and ABA treatment
in shoots and that was induced by ABA and GA in roots. The above results showed that ZmJAZ4 may be an important transcriptional regulator,
which participates in many hormones signaling pathways and abiotic stress.
Key words: Jasmonate ;Zea mays Jasmonate ZIM-domain gene ;Abiotic stress
2015,31(3) 97晏胜伟等:玉米 JAZ 家族基因 ZmJAZ4的克隆及功能分析
的一个亚家族,JAZ 蛋白是茉莉素(JA)信号通路
的一个重要的抑制因子[3,4]。在拟南芥中存在 12 个
JAZ 蛋白家族成员,它们均含有 3 个保守区,分别
为 NT、TIFY 和 Jas 结构域,其中 TIFY 结构域包含
有 ZIM(ZINC-FINGER EXPRESSED IN INFLORESC-
ENCE MERISTEM) 结 构 域[5]。 正 常 生 长 条 件 下,
植物体内具有生物活性的 JA(JA-Ile)水平很低,
JA 介导的应答反应受 JAZ 蛋白的抑制,即 JAZ 蛋白
抑制 JA 下游转录因子发挥调节作用[6,7]。而当植物
受到昆虫咬食或植物腐蚀病原菌感染的胁迫时,植
物体内 JA-Ile 的水平升高,通过降解 JAZ 蛋白释放
被其抑制的转录因子,进而激活 JA 应答基因的转录,
以发挥调控功能[2,6]。
自从 JAZ 蛋白被报道以来,已对拟南芥、水稻
和大豆等物种中的 JAZ 家族基因开展了较系统和深
入的研究。拟南芥 JAZ10 的过表达植株对茉莉酸不
敏感,且可减轻由损伤胁迫引起的生长抑制[8]。水
稻 OsJAZ10 的超表达可以提高水稻对盐和干旱的耐
受性且增加籽粒大小[9]。而野生大豆 GsJAZ2 在植
物的抗逆方面具有一定的功能,如 GsJAZ2 超表达拟
南芥表现出对盐、碱胁迫的耐受性,且胁迫信号通
路相关基因 RD29B、KIN1 和 DREB 等表达上调[10]。
烟草 NaJAZd 的超表达可抑制花蕾脱落[11]。JAZ 蛋
白不仅参与植物抗逆,同样也与抗病相关[12]。但
是,同样作为十分重要的粮食和经济作物,玉米中
的 JAZ 类基因的研究还鲜有报道。本实验室以玉米
B73 自交系为材料,通过基因芯片技术和生物信息
学方法建立了玉米特异的转录因子库,ZmJAZ4 基因
即选自其中。本研究通过 RT-PCR 克隆得到 ZmJAZ4
基因全长序列,分析该基因的氨基酸序列和在玉米
不同组织中的表达特性,鉴定 ZmJAZ4 的亚细胞定
位,分析其转录激活活性,另外通过激素及逆境胁
迫诱导分析该基因的调控机制,旨在为探索玉米中
JAZ 家族基因的功能以及研究玉米的生长发育、抗
逆等机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
玉米 B73 自交系材料种植于中国农业科学院生
物技术研究所试验田。
1.2 方法
1.2.1 玉米 ZmJAZ4 基因的克隆 根据本实验室转
录因子库筛选出的 ZmJAZ4 基因(序列号 GRMZM2-
G024680),设计基因全长引物 :5-AAGGATCCATG-
GCCGCCTCCGGGAACAA-3 和 5-AAGGTTACCTCA-
GAGCCTGAGCGCGAGCC-3,提取 B73 玉米自交系
三叶一心时期幼苗总 RNA,反转录成 cDNA 后作为
模板进行 PCR 扩增,反应程序 :95℃预变性 30 s ;
95℃变性 10 s,56℃退火 30 s,72℃延伸 45 s,30
个循环 ;72℃延伸 10 min。PCR 产物连接到 pEASY-
Blunt(北京全式金公司)载体测序,验证克隆。
1.2.2 ZmJAZ4 氨 基 酸 序 列 特 性 分 析 通 过 搜 索
玉 米 全 基 因 组 数 据 库(http ://www.gramene.org/ 和
http ://www.maizegdb.org/)对目的基因编码蛋白等电
点和分子量进行分析。使用 Clustal W 软件进行氨基
酸序列比对。分子进化树的构建使用 MEGA4.1 软件。
1.2.3 ZmJAZ4 转录本表达分析 分别取玉米根、茎、
叶、叶鞘、茎尖、雄花,以及授粉后 10、15、20 和
25 d 的胚和胚乳,液氮速冻研磨,提取总 RNA。激
素及逆境胁迫处理 :玉米幼苗在蛭石中生长至三叶
一心期,将幼苗从蛭石中取出,放于水中平衡 2 h
后开始逆境与激素处理,并取处理后 0、0.5、1、3、
6、9 和 24 h 的地上部与地下部 ;激素处理包括赤霉
素(GA,100 μmol/L), 水 杨 酸(SA,100 μmol/L)
和脱落酸(ABA,100 μmol/L)。逆境处理方法分为
干旱(20% PEG4000)和高盐(NaCl,250 mmol/L),
每个时间点取材分为地上部与地下部,然后液氮速
冻研磨,提取总 RNA。使用 RNAiso Plus(TaKaRa,
Japan) 提 取 上 述 材 料 总 RNA, 利 用 RevertAidTM
First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher
Scientific,USA) 进行 逆 转 录 扩 增, 合 成 第 一 链
cDNA,qRT-PCR 应用 ABI Prism 7500 system(Applied
Biosystems,USA)检测系统和 SYBR Premix Ex Taq
(TaKaRa,Japan)试剂盒。ZmJAZ4 基因的 RT-PCR
上下游引物为 :5-CGCTCAGGCTCTGAAACAGTGA-
AACC-3 和 5-CGACGACAGACACAGTGCCTAAGA-
AT-3 ;以玉米 Actin1 作为内参,其上下游扩增引物
为 5-ATGTTTCCTGGGATTGCCGAT-3 和 5-CCAGT-
TTCGTCATACTCTCCCTTG-3。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.398
1.2.4 亚细胞定位分析 以克隆得到的 ZmJAZ4 全
长 cDNA 为模板,应用引物 5-CTCGAGATGGCCGC-
CTCCGGGAACAA-3 和 5-TCTAGAGAGCCTGAGCG-
CGAGCCACG-3 扩 增 获 得 不 含 终 止 密 码 子 的
ZmJAZ4 全长 ORF,并在其两端引入 Xho I 与 Xba I
内切酶位点,经上述酶切位点将 ZmJAZ4 cDNA 连入
pRTL2-NGFP 载体 CaMV35S 启动子和 GFP 的 cDNA
之间,使目的基因与 GFP cDNA 的 N 端融合,然后
经测序验证[13]。通过 PEG 介导转化玉米原生质体[14],
培养 12 h 后,在共聚焦显微镜下观察蛋白定位结果。
1.2.5 ZmJAZ4 的 转 录 激 活 活 性 分 析 通 过 PCR
方 法 在 ZmJAZ4 的 cDNA 两 端 分 别 引 入 EcoR I 和
BamH I 酶 切 位 点, 经 上 述 酶 切 位 点 将 ZmJAZ4
cDNA 与 pGBK-T7(CLONTECH)载体的 GAL4 DNA
结合结构域融合,融合载体经测序验证。将上述重
组载体和空载体 pGAD-T7 共转化到酵母 AH109 菌
株中,29℃培养 3 d 后,挑取 SD/-Trp/-His 筛选培养
基上的酵母单菌落于 SD/-Trp/-His 液体培养基中培
养,并将菌液滴于 SD/-Leu-Trp/-His-Ade 缺陷筛选培
养基上验证是否具有转录激活活性。
2 结果
2.1 ZmJAZ4 的克隆和序列分析
本研究扩增的 ZmJAZ4 基因长度为 651 bp(图
1),编码蛋白含有 216 个氨基酸,分子量约为 23.1
kD,pI 为 10.78,属于碱性蛋白。为了研究 ZmJAZ4
与其他已报道的 JAZ 类转录因子间的进化关系,
选择研究比较深入的拟南芥和水稻 JAZ 家族蛋白
与 ZmJAZ4 进 行 了 比 对 分 析( 图 2)。 结 果 表 明,
ZmJAZ4 含有 JAZ 家族基因特有的 NT、TIFY 和 Jas
保守结构域(图 2-A),但其氨基端和羧基端的 NT
和 Jas 结构域保守性较低。将 ZmJAZ4 氨基酸序列与
拟南芥 JAZ 家族的 12 个成员进行了进化树分析(图
2-B)。结果表明,ZmJAZ4 与 AtJAZ10 相似性最高。
而 AtJAZ10 的过表达植株对茉莉酸不敏感,且可减
轻由损伤胁迫引起的生长抑制,推测 ZmJAZ4 在植
物抗逆方面具有与 AtJAZ10 相似的功能。
2.2 ZmJAZ4 转录本的时空表达分布
基因的表达模式分析有助于人们更有效地了解
其功能。为了鉴定 ZmJAZ4 的时空分布特征,以玉
米 B73 自交系的不同组织提取的总 RNA 进行了荧光
定量 RT-PCR 分析。结果(图 3)显示,ZmJAZ4 的
转录本在茎端分生组织、雄花和籽粒中有表达,在
籽粒中主要于胚乳中表达,而在胚中的表达量较低。
此外,ZmJAZ4 的表达量随着籽粒的成熟而逐渐上
调。推测 ZmJAZ4 可能在雄穗及种子的发育,尤其
是在胚乳的发育过程起一定的调控作用。
2.3 ZmJAZ4 蛋白的亚细胞定位分析
转录因子作为反式作用因子,是通过与靶基因
启动子区结合或通过与其他转录因子互作来调节靶
基因的表达,因此其若发挥功能则首先应该进入到
细胞核。为了探究 ZmJAZ4 蛋白的亚细胞定位特征,
将其编码序列融合到 GFP 的 5 端(图 4-A),通过
PEG 介导转化玉米原生质体使融合蛋白在玉米原生
质体中瞬时表达,使用激光共聚焦显微镜观察荧光
蛋白的亚细胞定位。结果(图 4-B)显示,空载 GFP
对照蛋白定位于细胞质和细胞核 ;而 ZmJAZ4-GFP
蛋白融合,只定位于细胞核。此结果说明 ZmJAZ4
蛋白定位于细胞核,可能参与调控下游基因的转录。
2.4 ZmJAZ4 的转录活性分析
为了验证 ZmJAZ4 是否具有转录因子的功能,
将 ZmJAZ4 的 cDNA 与 pGBK-T7 载体的 GAL4 DNA
结合域融合,然后与 pGAD-T7 载体共转化到酵母
AH109 菌株中,结果(图 5)表明 ZmJAZ4 不具有
转录激活活性。已知 ZmJAZ4 蛋白定位于细胞核,
因此可以推测 ZmJAZ4 可能通过与其他转录因子互
作发挥转录调节因子的作用。
2.5 玉米ZmJAZ4 于非生物胁迫下的表达特性分析
采用 qRT-PCR 方法,以玉米 B73 自交系为材料
分 析 了 ZmJAZ4 在 GA、SA、ABA、PEG、NaCl 和
1000
bp
M 1
500
M :DNA Marker ;1 :RT-PCR 产物
图 1 ZmJAZ4 基因的 RT-PCR 琼脂糖凝胶电泳
2015,31(3) 99晏胜伟等:玉米 JAZ 家族基因 ZmJAZ4的克隆及功能分析
ZmJAZ4
AtJAZ1
OsJAZ9
Consensus
ZmJAZ4
AtJAZ1
OsJAZ9
Consensus
ZmJAZ4
AtJAZ1
OsJAZ9
Consensus
ZmJAZ4
AtJAZ1
OsJAZ9
Consensus
ZmJAZ4
AtJAZ1
OsJAZ9
Consensus
ZmJAZ4
AtJAZ1
OsJAZ9
Consensus
ZmJAZ4
AtJAZ1
OsJAZ9
Consensus 1
r
g a a p r k q
saaaffgYfitla
t
g f c l
26
TIFY domain Jas domainNT domain
40
26
60
80
55
84
120
68
124
154
102
164
189
130
197
229
168
216
252
187
ZmJAZ4
AtJAZ10
AtJAZ7
AtJAZ12
AtJAZ6
AtJAZ8
AtJAZ11
AtJAZ3
AtJAZ4
AtJAZ9
AtJAZ1
AtJAZ2
AtJAZ587
31
15
8
43
55
37
49
6
34
A
B
A :ZmJAZ4 与 AtJAZ1 及 OsJAZ9 的 蛋 白 序 列 比 对。B :ZmJAZ4 与 拟 南
芥 JAZ 家族成员蛋白的进化树分析,所涉及蛋白在 GenBank 中的登录号
分 别 为 :ZmJAZ4(Zea mays):XP_008664988 ;AtJAZ1,AtJAZ,AtJAZ3,
AtJAZ4,AtJAZ5,AtJAZ6,AtJAZ7,AtJAZ8,AtJAZ9,AtJAZ10,AtJAZ11,
AtJAZ12(Arabidopsis thaliana):NM_101776,NM_106153,NM_202601,
NM_001123979,NM_101599,NM_105904,NM_129014,NM_102753,
NM_105738,NM_203047,NM_114212,NM_122098
图 2 ZmJAZ4 的氨基酸序列(A)及其进化树分析(B)
H2O 六种处理下的表达特性。结果(图 6)显示,在
玉米的地上部分,ZmJAZ4 主要受到 GA、SA、PEG
和 NaCl 四种胁迫诱导表达,其中在 GA 诱导下表
达量最高,即在诱导后 1 h 增加 60 多倍。在根中,
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
⴨ሩ㺘䗮䟿
100
0
roo
t
sta
lk lea
f
she
ath sam tas
sel
DA
P1
0 s
eed
DA
P1
0 E
N
DA
P1
5 E
M
DA
P1
5 E
N
DA
P2
0 E
M
DA
P2
0 E
N
DA
P2
5 E
N
DA
P2
5 E
M
root :根 ;stalk :茎 ;leaf :叶 ;sheath :叶鞘 ;sam :茎端分生组织 ;tassel :
雄穗 ;seed :种子 ;EN :胚乳 ;EM :胚 ;DAP(days after pollination):授
粉后天数
图 3 ZmJAZ4 mRNA 的时空表达分布
35S-Pro ZmJAZ4 GFP Tnos
pRTL2-ZmJAZ4
GFP
10 μm
G
FP
Zm
JA
Z4
-G
FP
Bright Field
10 μm
A
B
A :ZmJAZ4 亚细胞定位载体构建图 ;B :ZmJAZ4-GFP 在玉米原生质体中的
亚细胞定位
图 4 ZmJAZ4 的亚细胞定位分析
SD/-L-T
1 2 3
SD/-L-T-A-H
1-3 :分别为酵母菌液 1OD 浓度,稀释 10 倍浓度,稀释 100 倍浓度
图 5 ZmJAZ4 转录激活活性分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.3100
ZmJAZ4 受 GA 和 ABA 诱 导, 且 在 ABA 诱 导 后 1
h 表达量达到最高值,增加约 30 倍。此结果说明
ZmJAZ4 受盐、干旱、GA、SA 以及 ABA 胁迫诱导表
达,可能在激素及逆境胁迫信号通路中起一定的调
控作用,且 ZmJAZ4 在玉米的根和叶中响应胁迫的
方式有一定的差异。
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 0.5 3 9 24
⴨ሩ㺘䗮䟿
6ᰦ䰤h1
35
A
B
30
25
20
15
10
5
0
0 0.5 3 9 24
⴨ሩ㺘䗮䟿
6ᰦ䰤h1
H2O NaCl PEG SA GA ABA
H2O NaCl PEG SA GA ABA
3 讨论
JAZ 是特异存在于植物中的一类转录因子家族,
属于 TIFY 超家族。目前,人们对 JAZ 蛋白的调控
机制逐步有了深入了解。已有研究结果表明,JAZ
蛋白调控的信号通路在植物生长发育以及逆境胁迫
方面具有重要的功能,如拟南芥 JAZ 家族基因可以
被多种非生物逆境诱导表达[15],AtJAZ10 在拟南芥
中过表达会导致拟南芥对茉莉酸不敏感,并且降低
损伤导致的生长抑制[8]。而水稻中的大部分 JAZ 基
因受茉莉酸和非生物胁迫的诱导,且其在水稻中过
表达后显著提高植株对高盐和干旱的抗性[16]。于大
豆中过表达 GsJAZ2 可以增加植株对盐碱的敏感性,
并可调控 RD29B、DREB、KIN1 等基因的表达[10]。
有研究表明,芸苔属植物中 JAZ5a 能够显著提高抽
薹期植物的耐热性[17]。烟草中过表达 NaJAZd 和
图 6 不同激素及胁迫处理下 ZmJAZ4 在 B73 玉米植株地上部分(A)及根部(B)的表达特性分析
NaJAZh 可以分别抑制花蕾脱落和促进尼古丁的合
成[11,18]。可以看出,JAZ 家族基因虽然在不同物种
中所表现出的功能不尽相同,但在植物生长发育及
响应逆境胁迫中扮演着十分重要的角色。然而,玉
米中的 JAZ 至今鲜有报道。若能够对玉米中 JAZ 家
族蛋白进行系统而又深入的研究,将能够为玉米育
种工作提供重要的帮助。ZmJAZ4 作为一个转录调
节子,可以受盐、干旱、GA、SA 以及 ABA 多种胁
迫诱导表达,可能在植物的生长发育及抗逆等方面
扮演重要角色。下一步的试验中,计划将 ZmJAZ4
基因在玉米中过量表达和抑制表达,进一步探究其
在玉米中发挥的调控功能。
4 结论
本研究利用基因芯片技术获得的玉米转录因子
数据库,结合 RT-PCR 技术,获得 ZmJAZ4 基因的
2015,31(3) 101晏胜伟等:玉米 JAZ 家族基因 ZmJAZ4的克隆及功能分析
cDNA 序列。序列分析发现 ZmJAZ4 具有 JAZ 家族
的保守结构域,利用进化树分析发现 ZmJAZ4 与拟
南芥中的 AtJAZ10 相似性最高。利用 qRT-PCR 对其
在不同组织及发育阶段的表达特征进行分析,结果
显示 ZmJAZ4 在茎端分生组织、雄花和籽粒中有表
达,而籽粒中主要于胚乳表达,且其表达量随着籽
粒的成熟而上调。ZmJAZ4 定位于细胞核,为不具有
转录激活活性的转录调控因子。非生物胁迫处理结
果表明 ZmJAZ4 受盐、干旱、GA、SA 以及 ABA 胁
迫诱导表达,且在玉米的根和叶中相应胁迫的表达
模式有一定的差异。结果表明,ZmJAZ4 编码的蛋
白在细胞核中可能作为一个转录调节因子,在激素
及逆境胁迫信号通路中发挥一定的调控作用。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫)