全 文 ：园艺学报，2015，42 (2)：289–300.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0686；http：//www. ahs. ac. cn 289
收稿日期：2014–09–18；修回日期：2015–01–21
基金项目：国家自然科学基金项目（31171991）；国家教委博士点专项基金项目（20120008110006）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：ymfang@cau.edu.cn）
唐菖蒲茉莉素受体基因 GhCOI1 的克隆与表达
分析
吴晨雨 1，何俊娜 1，钟雄辉 1，僧珊珊 1，吴 健 1，隋娟娟 1,2，刘 晨 1，
吴 泽 1，刘 超 1，义鸣放 1,*
（1 中国农业大学观赏园艺与园林系，北京 100193；2阜阳师范学院生命科学学院，安徽阜阳 236037）
摘 要：通过 RACE 技术在唐菖蒲（Gladiolus hybridus）品种‘Rose Supreme’的籽球苗叶片中克隆
得到茉莉素受体 COI1 基因的 cDNA 序列，命名为 GhCOI1。该基因全长为 2 603 bp，包含一个编码 613
个氨基酸的开放阅读框，5′utr 和 3′utr 分别为 484 bp 和 277 bp，预测的蛋白质分子量为 69.46 kD；其氨基
酸序列具有典型的 F-box 基序和 LRRs 结构域。同源比对和系统进化树的分析结果表明，GhCOI1 与番茄
LeCOI1 氨基酸序列的相似性最高，达到 64.3%；与水稻 OsCOI1 的亲缘关系最近。利用实时荧光定量 PCR
分析基因表达的结果表明，GhCOI1 在唐菖蒲叶片中的相对表达量最高，根中其次，匍匐茎、新球、籽球、
花瓣、雄蕊、雌蕊里中的相对表达量较低，推测在唐菖蒲中存在器官专一性表达的 COI1 同源基因。采用
0.05、0.1 和 0.5 mmol · L-1 MeJA 喷施处理唐菖蒲叶片，检测到施用 0.1 mmol · L-1 MeJA 可显著上调 GhCOI1
的表达。同时伴随此浓度 MeJA 处理时间的增加，12 h 内 GhCOI1 的表达量呈现先上升再下降后上升的趋
势。洋葱表皮细胞瞬时表达结果表明 GhCOI1 蛋白定位于细胞质和质体中。本研究中初步验证了 GhCOI1
在茉莉素信号途径中的作用。
关键词：唐菖蒲；COI1；茉莉素；克隆；表达分析
中图分类号：S 682.2+4 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）02-0289-12

Cloning and Expression Analysis of Coronatine Insensitive Gene Encoding
a Jasmonate Receptor from Gladiolus hybridus
WU Chen-yu1，HE Jun-na1，ZHONG Xiong-hui1，SENG Shan-shan1，WU Jian1，SUI Juan-juan1,2，LIU
Chen1，WU Ze1，LIU Chao1，and YI Ming-fang1,*
（1Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beijing 100193，
China；2College of Biology，Fuyang Normal College，Fuyang，Anhui 236037，China）
Abstract：A full length cDNA of jasmonate receptor CORONATINE INSENSITIVE1（COI1）was
amplified from the leaves of Gladiolus hybridus‘Rose Supreme’by the technique of RACE，and it was
named GhCOI1. The gene had a length of 2 603 bp，and it included a 5′-untranslated region（UTR）of 484
bp，a 3′-UTR of 277 bp and an open reading frame that encoded a protein of 613 amino acid residues with
a predicted molecular mass of 69.46 kD. The results of multiple alignments revealed that the deduced amio

Wu Chen-yu，He Jun-na，Zhong Xiong-hui，Seng Shan-shan，Wu Jian，Sui Juan-juan，Liu Chen，Wu Ze，Liu Chao，Yi Ming-fang.
Cloning and expression analysis of coronatine insensitive gene encoding a jasmonate receptor from Gladiolus hybridus.
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acid sequence of GhCOI1 had a high similarity（64.3%）to LeCOI1. Phylogenetic analysis showed that
GhCOI1 shared a close relationship with the OsCOI1. The results of qRT-PCR demonstrated that the
highest level of GhCOI1 mRNA was detected in leaves which followed by roots，while the extreme low
level was observed in stolon，cormel，corm，petal，stamen and pistil，suggesting that the homologous genes
of GhCOI1 expressed specifically in organs. Leaves were treated with the solution of 0.05，0.1 and 0.5
mmol · L-1 methyl jasmonate（MeJA）respectively，the transcript level of GhCOI1 was up-regulated
significantly by 0.1 mmol · L-1 MeJA. The expression of GhCOI1 showed an alternating pattern of rise and
fall by treatment during 12 hours with 0.1 mmol · L-1 MeJA. Following transient expression of GhCOI1 in
onion epidermal cells，GhCOI1 was found to be localized in both the cytoplasm and the plastid. The
research suggested that GhCOI1 has specific function in jasmonate signal pathway of Gladiolus hybridus.
Key words：Gladiolus hybridus；CORONATINE INSENSITIVE1；jasmonic acid；cloning；expression
analysis

茉莉酸（jasmonic acid，JA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）等统称为茉莉素（jasmonates，
JAs），JAs 在植物生长发育过程中发挥着重要的调控作用（Stintzi et al.，2001），由其介导的信号转
导途径参与植物抵御生物及非生物逆境胁迫的应答反应（Koda，1992；Howe et al.，1996；Skibbe et
al.，2008）。JAs 介导的信号转导途径始于 COI1 对激素信号的识别，COI1 蛋白作为 JAs 的受体是茉
莉酸信号途径中的关键调控因子（Katsir et al.，2008；Yan et al.，2009）。植物的 JAs 诱导反应依赖
于 COI1 对 JAs 的响应。在拟南芥中，受 JA 诱导表达的 212 个基因中有 84%的基因需要 COI1 的响
应，受 JA 抑制表达的 104 个基因中也有 53%的基因依赖 COI1 响应（Devoto et al.，2005）。COI1
是一类 F-box 蛋白，包含了 2 个典型的特征结构域，即 F-box 结构和富亮氨酸的重复结构 LRRs（Xie，
1998）。通过对拟南芥 COI1 的研究发现，COI1 与 ASK1（Arabidopsis Skp1-like 1）、ASK2（Arabidopsis
Skp1-like 2）、Cul1（cullin 1）和 Rbx1（ring-box protein 1）结合形成 SCFCOI1 泛素连接酶复合物 E3
ubiquitin ligase（Xu et al.，2002；Liu et al.，2004），E3 识别并泛素化底物 Jasmonate-ZIM-domain（JAZ）
蛋白，从而介导负调控因子 JAZ 蛋白通过 26S 蛋白酶体降解，开启一系列下游 JAs 响应基因的表达
（Chini et al.，2007；Thines et al.，2007；Yan et al.，2007）。大量的研究表明茉莉素信号途径能有
效防御病原菌和昆虫的侵害（Thomma et al.，1998；Halitschke & Baldwin，2004；María et al.，2004；
Glazebrook et al.，2005）。
生产中，唐菖蒲（Gladiolus hybridus）极易受病虫害影响，如叶斑病、枯萎病及蚜虫、红蜘蛛
等引起的虫害等（刘峰，2008）。COI1 是调控茉莉素信号途径的关键基因（Xu et al.，2002；Devoto
et al.，2005），目前在唐菖蒲中还没有利用 GhCOI1 提高其抗性的报道。本研究中通过克隆唐菖蒲
GhCOI1，检测该基因在其不同部位表达，对其在 MeJA 处理后的表达量变化规律及亚细胞定位结果
进行了分析，验证 GhCOI1 在茉莉素信号途径中的作用，为进一步探讨 GhCOI1 对唐菖蒲抗病性的
功能，提高种球及鲜切花的品质提供理论和技术依据。
1 材料与方法
1.1 材料及其 GhCOI1 基因的克隆
试验在中国农业大学科学园和观赏园艺与园林系观赏植物栽培生理与生物技术实验室进行，试
吴晨雨，何俊娜，钟雄辉，僧珊珊，吴 健，隋娟娟，刘 晨，吴 泽，刘 超，义鸣放.
唐菖蒲茉莉素受体基因 GhCOI1 的克隆与表达分析.
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验时间为 2012 年 11 月至 2013 年 11 月。
以直径为 1 cm 的唐菖蒲品种‘Rose Supreme’的籽球（图 1，A）和直径为 8 ~ 10 cm 新球为试
材（图 1，B）。将打破休眠的籽球种植于光照培养箱中，光周期为 16 h 光照/8 h 黑暗，光照强度为
8 000 lx，温度为 22 ℃。

图 1 唐菖蒲‘Rose Supreme’繁殖材料
A：籽球；B：花后 2 ~ 3 d 的新球和籽球。
Fig. 1 Two different breeding materials of G. hybridus‘Rose Supreme’
A：Cormels；B：Corms and cormels 2–3 days after flowering.

唐菖蒲籽球苗叶片 RNA 的提取采用北京天根生物技术有限公司的 RNAprep pure Plant Kit。
RNAase-Free H2O 溶解 RNA，NanoDrop 测定 RNA 浓度，根据 OD260/OD280 及 OD260/OD230 评估 RNA
质量，通过琼脂糖凝胶电泳的结果判断 RNA 的完整性。RT-PCR 反转录参照 TaKaRa 公司的 M-MLV
Reverse Transcriptase 说明书进行。
cDNA 合成及 PCR 反应所用引物见表 1。

表 1 逆转录和 PCR 引物
Table 1 Primers applied in the reverse transcription and PCR
引物
Primer
序列 Sequence
（5′–3′）
引物
Primer
序列 Sequence
（5′–3′）
PF1 GGVAARCCHMGMGCNGCBATGT AP CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC
PF2 ANGHKYTBAAGCTNGAYA AGTG AP1 CCAGTGAGCAGAGTGACG
PF3 CGGAGTTGCCCCTGGATAATGG AP2 GAGGACTCGAGCTCAAGC
PF4 TGTCGGAAACTGCAGAAACTGGA 5′RACE outer CATGGCTACATGCTGACAGCCTA
PF5 GCTCTAGAATGGAGAACGGCAGTAGTAGTA 5′RACE inner CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG
PR1 ATGCYCTRTADCCYTGYACCCA RtCOI1 F GGTGGTATATCGGATGCGGCT
PR2 CCTTCTCAGTAATGGTGCTTTCTTCC RtCOI1 R CGAGGAATAGCAGAGGGCCA
PR3 GCAAGAACGAGCAATGAGGGTGAGGG Actin F ACTGCAGAGCGGGAAATTGT
PR4 GGACTAGTCACCATCTGGGCAATCTGTCCTTTG Actin R CCAATCAGGGATGGCTGGAA
注：下划线表示限制性内切酶酶切位点。
Note：The underline indicates cleavage site of restriction endonuclease.

从 GenBank 核酸数据库中获得拟南芥（NM_129552.3）、水稻（AY168645.1）、小麦（HM447645.1）、
玉米（NM_001156957.1）、烟草（EF025087.1）、大豆（DQ136026.1）等物种的 COI1 基因的 mRNA
序列，通过 DNAman 软件进行同源比对并设计保守区兼并引物，并根据已获得的片段序列设计特异
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引物（表 1）。保守片段由引物 PF1、PF2、PR1 经两轮巢式 PCR 扩增得到。第 1 轮反应引物用 PF1
和 PR1，反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 10 s，5 个循环；94
℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 10 s，30 个循环。第 2 轮反应的引物为 PF2 和 PR1，反应程
序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5 个循环；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，
72 ℃ 1 min，30 个循环。
COI1 基因 3′端序列克隆，根据已得到的唐菖蒲 COI1 保守片段设计两条 3′ RACE 上游特异 PF3
和 PF4。第 1 轮 PCR 反应的引物为 PF3 和接头引物 AP1（表 1），反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃
1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 10 min。第 2 轮反应引物为 PF4 和接头引物
AP2（表 1），反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 10
min。
COI1 基因 5′端序列克隆，参照 TaKaRa 公司的 5′-Full RACE Kit 说明书进行，第 1 轮 PCR 反应
引物用 5′RACE outer primer 和特异引物 PR2（表 1），反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃
1 min，72 ℃ 2 min，35 个循环；72 ℃ 10 min。第 2 轮反应采用引物对 5′ RACE inner primer 和
PR3（表 1）。94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，61 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 30 s，35 个循环；72 ℃ 10
min。
使用 DNAMAN 对 COI1 基因的保守片段、3′端和 5′端序列进行拼接，根据在 NCBI 网站上预
测的 ORF 设计特异引物，PCR 反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，61 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min
30 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。将回收的目的片段与 PMD18-T 载体连接并转化大肠杆菌感受态
DH5α，在培养基上鉴定重组质粒后送北京华大基因公司进行测序。
1.2 序列分析及蛋白质结构分析
采用 Primer Premier 5 将 ORF（Open Reading Frame）翻译成氨基酸序列，对其进行 BLAST 同
源比对分析（http：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi），将目的序列与其它物种的 COI1 氨基酸序列
在 DNAMAN 进行多重比对，用 MEGA 5.0 构建系统进化树。
然后利用在线软件对蛋白进行分析。ProtParam（http：//web. expasy. org/protparam/）预测蛋白
的分子量及等电点；蛋白的可溶性、跨膜结构域、信号肽及亚细胞定位的预测分别使用 SOSUI（http：//www.
bionity. com/en/encyclopedia/SOSUI. html）、TMHMM Sever2.0（http：// www. cbs. dtu. dk/services/
TMHMM/）、SignalP4.1（http：//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/）及 wolf PSORT（http：//wolfpsort.
seq. cbrc. jp/）；SMART（http：//smart. embl-heidelberg. de/）分析蛋白的保守结构域。使用 SOPMA
（http：//pbil. ibcp. fr/）和 Phyre 2（http：//www. sbg. bio. ic. ac. uk/phyre2/html）分别对蛋白的二、
三级结构进行分析。
1.3 荧光定量 RT-PCR 的表达分析
将贮藏于 4 ℃冷库 4 个月左右已打破休眠的种球种植于大田，植株开花后 2 ~ 3 d 取叶、根、匍
匐茎、新球（图 1，B）、籽球、花、雄蕊和雌蕊，迅速放入液氮冷冻，10 min 后取出，放置于–80 ℃
冰箱中保存备用。
采用实时荧光定量 PCR（real-time PCR）方法研究 GhCOI1 基因在唐菖蒲‘Rose Supreme’不
同器官的表达模式，以及籽球苗叶片在 0、0.05、0.1、0.5 mmol · mL-1 MeJA 溶液处理后的表达情况。
提取唐菖蒲各器官、MeJA 处理后的籽球苗叶片的总 RNA，取 1 µg RNA 合成第 1 链 cDNA，然后
将 cDNA 模板稀释 5 倍，反应体系为 20 µL，参照荧光定量试剂盒 SYBR Prime ScriptTM RT-PCR Kit
吴晨雨，何俊娜，钟雄辉，僧珊珊，吴 健，隋娟娟，刘 晨，吴 泽，刘 超，义鸣放.
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（TaKaRa）说明书。反应程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s 和 72 ℃ 20 s，40 个循环后作熔解
曲线。每个样品均重复 3 次，在 ABI7500 实时 PCR 仪上进行，采用 2-ΔΔCT 法计算分析。
1.4 构建瞬时表达载体
根据目的基因 GhCOI1 及 pCAMBIA1300-GFP 载体序列设计带有 XbaⅠ/SpeⅠ酶切位点的引物
对，使用 PF5 和 PR4 扩增 GhCOI1 基因不含终止子的开放阅读框。将胶回收产物与 pCAMBIA1300-
GFP 载体分别用 XbaⅠ/SpeⅠ进行双酶切，产物用 T4 连接酶进行过夜连接，构建成瞬时表达载体
pCAMBIA1300-GhCOI1-GFP。
1.5 洋葱表皮亚细胞定位
60 mg · mL-1 的金粉悬液 8 μL、0.1 mol · mL-1 亚精胺 4 μL、2.5 mol · L-1 CaCl2 8 μL 分别与 1 ~ 5 μg
的 pCAMBIA1300-GhCOI1-GFP、pCAMBIA1300-GFP 的质粒混合制作成金粉悬浮液。涡旋振荡 3
min，10 000 r · min-1 离心 15 s，弃上清液。加入 40 μL 无水乙醇重悬混合物，重复以上步骤 2 次，
最后使用 10 μL 无水乙醇重悬金粉沉淀。将幼嫩的洋葱表皮平铺于 MS 固体培养基上，25 ℃预培养
12 h。采用 PDS 1000/He 型基因枪轰击洋葱表皮，25 ℃暗培养 12 h 后，20 μmol · L-1 MG-132 处理
洋葱表皮细胞 12 h，在激光共聚焦显微镜（Nikon）下观察表达情况。
2 结果与分析
2.1 唐菖蒲茉莉素受体 GhCOI1 基因全长 cDNA 序列
如图 2 所示，PCR 扩增得到长度为 1 152 bp 的 COI1 基因中间片段；获得的 3′RACE 产物经测
序表明长度为 583 bp；获得一条预期长度为 1 010 bp 的 5′端末端序列。通过将中间片段、3′端以及 5′
端序列拼接，得到全长为 2 601 bp 的 COI1 基因序列，预测其 ORF，并设计上下游引物进行 PCR 扩
增，获得的编码区序列（CDS）长为 1 842 bp。唐菖蒲 COI1 基因全长为 2 603 bp，包含一个长度为
484 bp 的 5′非翻译区和 277 bp 的 3′非翻译区，以及一个长度为 1 842 bp 的编码 613 个氨基酸的开放
阅读框，命名为 GhCOI1。

图 2 PCR 产物检测
Fig. 2 Agrose gel electrophoresis of PCR products
Wu Chen-yu，He Jun-na，Zhong Xiong-hui，Seng Shan-shan，Wu Jian，Sui Juan-juan，Liu Chen，Wu Ze，Liu Chao，Yi Ming-fang.
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2.2 唐菖蒲 GhCOI1 蛋白质特性分析
通过生物学信息软件分析 GhCOI1 蛋白质特性，唐菖蒲 GhCOI1 基因编码蛋白的分子式为
C3054H4875N855O913S40，分子量为 69.46 kD，等电点为 5.89，为可溶性蛋白，无信号肽位点，稳定系
数为 53.83，为不稳定蛋白，没有跨膜结构域，不属于跨膜蛋白。
GhCOI1 蛋白质的二级结构预测结果为 55.46%的 α–螺旋，3.92%的 β–转角，28.55%的随机卷
曲。GhCOI1 的三级结构与拟南芥 AtCOI1 具有很高的相似性（66%）。此外，同属 F-box 蛋白类的
拟南芥生长素受体 AtTIR1，与拟南芥 AtCOI1 在亲缘关系上处于相同分支，均含有 LRR 和 F-box
结构域，在蛋白三级结构对比中与唐菖蒲 GhCOI1 相似性高达 33%。
对唐菖蒲 GhCOI1 功能域结构（图 3）分析表明，GhCOI1 是一类 F-box 蛋白且包含了两个重要

图 3 唐菖蒲与几种植物 COI1 氨基酸序列同源比对
方框：F-box 保守结构域；下划线：富亮氨酸重复序列；黑色箭头：茉莉酸结合位点。
Fig. 3 Homology comparison of amino acid sequences alignment of GhCOI1 with other plants
Box：F-box domain；Under lines：Leucine-rich repeats（LRRs）；Black arrows：Jasmonate binding sites.
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的特征结构域，即定位在该氨基酸序列 N 端第 33 ~ 74 位区域的 1 个 F-box 结构域及 9 个串联排列
的 LRRs 基序，分别定位在 157 ~ 182、185 ~ 201、203 ~ 225、240 ~ 259、313 ~ 337、336 ~ 359、
396 ~ 420、454 ~ 480、506 ~ 530 氨基酸序列上。该蛋白含有 6 个茉莉素结合位点（Arg102，Arg367，
Glu369，Val406，Arg428，Arg515），与拟南芥 AtCOI1 茉莉素结合位点分析结果一致。此外，唐菖蒲
GhCOI1 具有 6 个磷酸化位点，包括 4 个丝氨酸磷酸化位点（Ser14，Ser16，Ser21，Ser25），1 个苏氨
酸磷酸化位点（Thr359）和 1 个酪氨酸磷酸化位点（Tyr476）。
2.3 唐菖蒲 GhCOI1 同源比对及进化分析
运用 Blast 分析，唐菖蒲 GhCOI1 与大豆 GmCOI1 核苷酸序列的相似性最高达到 64.4%，其次是
单子叶植物大麦和水稻，分别为 63.6%和 63.4%。将几类研究报道较多的不同物种 COI1 氨基酸序列
下载，与目的序列在 DNAMAN 上进行同源性比对发现，唐菖蒲 GhCOI1 与多种植物的 COI1 具有
较高的同源性，均在 60%以上。GhCOI1 编码的氨基酸序列与番茄（AY423550.1）的相似性最高，
为 64.3%，与水稻（AY168645.1）、橡胶树（EU136026.1）、大豆（DQ136026.1）的相似性分别为 63.6%、
63.3%、62.8%，与拟南芥（NM_129552.3）和烟草（EF025087.1）的相似性为 61.2%。不同植物 F-box
蛋白在功能域及活性位点上的高保守性，表明唐菖蒲 GhCOI1 与其他物种 COI1 可能具有相似的功
能。
MEGA5 构建的进化树（图 4）显示具有相同种属关系的物种被聚为同一类，而唐菖蒲 GhCOI1
形成一个独立的分支。由于唐菖蒲与禾本科植物均为单子叶植物，因此它与同属于禾本科植物的水
稻、玉米、小麦有较近的亲缘关系，其中唐菖蒲 GhCOI1 与水稻 OsCOI1 亲缘关系最近，与小麦 TaCOI1
的亲缘关系最远（图 4）。
图 4 不同物种 COI1 氨基酸序列的聚类分析
Fig. 4 Clustering of the deduced amino acid sequences of COI1 with homologous amino acid sequences among
Gladiolus hybridus and other plants

2.4 唐菖蒲 GhCOI1 组织特异性表达
采用荧光定量 RT-PCR 技术，分析唐菖蒲 GhCOI1 基因在叶、根、匍匐茎、新球、籽球、花瓣、
雄蕊、雌蕊各器官当中的表达。从图 5 可以看出，GhCOI1 在不同器官中的表达量存在较大差异，
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图 6 不同浓度的 MeJA 处理 12 h 后 GhCOI1 在唐菖蒲
叶片中的表达水平
Fig. 6 GhCOI1 relative expression level in leaves after treatment
with different concentrations of MeJA for 12 h
图 7 0.1 mmol · L-1 MeJA 处理不同时间对 GhCOI1 在唐菖蒲
叶片中表达水平的影响
Fig. 7 Effect of 0.1 mmol · L-1 MeJA on GhCOI1 relative
expression level in leaves over time
在叶中的相对表达量最高；在根中表达量次之，在新球、籽球、匍匐茎、花瓣、雄蕊和雌蕊中相对
表达量最低，该基因在叶中的相对表达量约为雌蕊中的 247 倍，在根中的相对表达量约为雌蕊中的
9 倍。
图 5 GhCOI1 在唐菖蒲不同器官中的相对表达量
Fig. 5 GhCOI1 relative expression level in different organs of Gladiolus hybridus

2.5 MeJA 对唐菖蒲 GhCOI1 表达的影响
对唐菖蒲籽球苗叶片在经过 0.05 ~ 0.1 mmol · L-1 MeJA 处理 12 h 后的 GhCOI1 表达情况进行分
析，GhCOI1 在 MeJA 浓度为 0.1 mmol · L-1 时表达水平最高，约为对照的 2.7 倍，而在 0.05 和 0.5
mmol · L-1 浓度下差异不显著（图 6）。可见，施用低浓度的 MeJA 能促进 GhCOI1 的表达。
采用浓度为 0.1 mmol · L-1 MeJA 处理唐菖蒲籽球苗叶片，提取总 RNA 反转成 cDNA 模板，分
析不同处理时间 GhCOI1 诱导表达量的变化。如图 7 所示，GhCOI1 表达量伴随处理时间的增加呈
现先上升再下降又上升的趋势，0.1 mmol · L-1 MeJA 处理唐菖蒲籽球苗叶片后 6 h 时表达量下降到最
低，约为对照的 1.7 倍，在 3 h、12 h 时 GhCOI1 的表达量均维持较高的水平，分别约为对照的 3.7









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倍与 4.6 倍。这与水稻 OsCOI1 在 MeJA 处理 1 ~ 24 h 内的表达趋势相同（Ye et al.，2012），利用茉
莉酸处理葡萄后 30 h 内 COI1 也有相似表达趋势（王文艳 等，2012），说明 GhCOI1、OsCOI1 和葡
萄 COI1 在茉莉素信号途径中可能有类似的作用方式。
2.6 唐菖蒲 COI1 的蛋白亚细胞定位
通过基因枪法将载体转化至洋葱表皮细胞内，结果表明，被 pCAMBIA1300-GFP 载体轰击的洋
葱表皮细胞内的绿色荧光分布在细胞膜、细胞质、细胞核及质体中，在被 pCAMBIA1300-
GhCOI1-GFP 载体轰击的洋葱表皮细胞中检测到绿色荧光不仅分布在细胞质中，并呈颗粒状分布在
洋葱细胞质体中（图 8），推测唐菖蒲 GhCOI1 蛋白可能定位在细胞质和质体。
图 8 GFP 和 GhCOI1 基因分别在洋葱表皮细胞中的瞬时表达
1、4：明场；2、5：混合场；3：激光共聚焦显微镜下洋葱表皮细胞内 GFP 蛋白的绿色荧光信号；
6：激光共聚焦显微镜下洋葱表皮细胞内的 GhCOI1-GFP 融合蛋白的绿色荧光信号。
Fig. 8 The transient expression of GFP and GhCOI1 gene in onion epidermal cells
1，4：Bright field；2，5：Mixing field；3：Images of green fluorescence of GFP in onion epidermal cells under the laser scanning
confocal microscope；6：Images of green fluorescence of GhCOI1-GFP protein in onion epidermal cells
under the laser scanning confocal microscope.

3 讨论
本研究中克隆获得的 GhCOI1 基因经过分析得知其编码的蛋白隶属于 F-box 家族。对拟南芥蛋
白结构模型的研究表明，AtCOI1 蛋白 N 端的 F-box 结构域介导了 COI1 与 ASK1 的相互作用，其 C
端 18 个 LRR 结构形成一个马蹄形螺线管，该结构域决定了识别靶蛋白的特异性（Jin et al.，2004），
其完整性有利于 COI1 在体内的稳定（Yan et al.，2013）。通过分析唐菖蒲 GhCOI1 编码的氨基酸序
列发现它的 N 端存在一个 42 个氨基酸长度的 F-box 基序，C 端包含 9 个串联排列的 LRR 基序。同
源比对的结果显示不同植物的 F-box 基序的保守性较低，GhCOI1 的 F-box 基序与拟南芥相似度仅为
62.3%，相关氨基酸残基的变异可能导致 GhCOI1 蛋白的 N 端结构发生改变，并将影响 GhCOI1 与
蛋白互作的比率及强度（Yan et al.，2009）。F-box 基序之后的 9 个 LRR 结构域由 α–螺旋，β–转
Wu Chen-yu，He Jun-na，Zhong Xiong-hui，Seng Shan-shan，Wu Jian，Sui Juan-juan，Liu Chen，Wu Ze，Liu Chao，Yi Ming-fang.
Cloning and expression analysis of coronatine insensitive gene encoding a jasmonate receptor from Gladiolus hybridus.
298 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (2)：289–300.
角，随机卷曲交错排布而成，GhCOI1 蛋白在此基础上进一步盘绕、折叠形成类似于拟南芥 AtCOI1
螺线管的三维构象，但两者之间 LRR 基序数相差一倍，并在 α–螺旋或 β–转角发生多处氨基酸替
换，如 S176L、V216T 等，氨基酸的替换能否改变蛋白的折叠方式进而降低唐菖蒲 GhCOI1 蛋白的
稳定性仍需要探索。
唐菖蒲 GhCOI1 序列比对及进化树分析结果表明，COI1 基因在物种进化上具有高度的保守性。
GhCOI1 与拟南芥 AtCOI1 编码的氨基酸序列相似性为 61.4%，该结果得到了唐菖蒲 GhCOI1 和拟南
芥 AtCOI1 蛋白三维空间结构比对的印证。唐菖蒲 GhCOI1 与拟南芥 AtCOI1 的三维构象相似性为
66%，且与拟南芥 AtTIR1 的三维构象相似性高达 33%。AtTIR1 蛋白是拟南芥生长素信号途径上的
F-box 蛋白，为生长素的受体，已被证明为茉莉素受体蛋白的 AtCOI1 与生长素受体蛋白 AtTIR1 具
有 33%的氨基酸序列一致性，皆存在 F-box 和 LRR 基序的结构特征（Tan et al.，2007）。在唐菖蒲
GhCOI1 编码蛋白的 LRR 特征结构域上存在 6 个完全保守的氨基酸残基，组成结合茉莉素的活性部
位，其中 Arg102、Arg367、Arg428 和 Arg515 表现为高正电性，Glu369 为亲水性氨基酸残基带负电，Val406
为疏水性氨基酸残基，该部位的氨基酸理化特性可能与茉莉素的结构特征有关。根据唐菖蒲 GhCOI1
基因在物种进化上的保守性，推断唐菖蒲 GhCOI1 编码的蛋白可能与其他功能已明确的物种如拟南
芥、烟草、番茄、葡萄等的 COI1 具有相似的功能，如响应茉莉素信号，开启茉莉素信号转导途径
下游基因的表达（Devoto et al.，2005）；参与介导泛素化降解途径（Yan et al.，2009）；激活植物防
御反应等（Li et al.，2004；Paschold et al.，2007）。
GhCOI1 在唐菖蒲各器官中存在显著的表达差异，在叶中高效表达，在根中的相对表达量次之，
在新球、籽球、匍匐茎、花瓣、雄蕊和雌蕊中表达量最低，这与 COI1 在辣椒及拟南芥中的表达模
式不一致。辣椒 CaCOI1 在根、茎、叶、花中均有表达，在花中的表达量最高（Hu et al.，2013）；
对拟南芥 coi1 突变体的研究发现，拟南芥 AtCOI1 参与介导了植株对真菌的抗性、调控根的伸长、
花发育、花粉的形成等，在根、茎、叶、花瓣、雄蕊当中均能检测到 AtCOI1 的表达（Benedetti et al.，
1998；Melotto et al.，2006；Adie et al.，2007）。由于本研究中唐菖蒲 GhCOI1 基因分离的材料来源
为叶片，推测在唐菖蒲的根、匍匐茎、球茎、花等器官中可能存在唐菖蒲 GhCOI1 功能分化的同源
基因，在不同器官中专一性表达，从而导致了唐菖蒲不同器官中基因表达模式的差异。近年来相继
在水稻、小麦等植物当中发现了 COI1 的同源基因，水稻的基因组中存在 3 个 COI 的同源基因分别
为 OsCOI1a，OsCOI1b，OsCOI2（Lee et al.，2013）；小麦的根部与病原菌 Pseudomonas fluorescens
互作期间，诱导了 COI1 的同源基因 COI2 的表达（Okubara et al.，2010）。在唐菖蒲其它组织或器
官中是否存在同源基因及其功能仍有待探究。
研究表明，MeJA负责植物细胞内与细胞间的信号传递，介导响应茉莉素的信号转导途径（Farmer
& Ryan，1990）。本研究结果表明唐菖蒲 GhCOI1 的表达受到 MeJA 诱导，低浓度 MeJA 水平能促进
该基因表达。0.1 mmol · L-1 MeJA 处理叶片 3 h 内随时间延长基因表达量增加，至 6 h 时表达水平大
幅下降，推测随着茉莉素转导途径被 MeJA 诱导而开启之后，唐菖蒲叶片内产生了某种抑制因子下
调了 GhCOI1 的表达量。前人发现植物对茉莉素的响应及一系列下游基因的表达对 COI1 蛋白存在
浓度依赖效应（Feng et al.，2003），据此推测在唐菖蒲叶片中由于 GhCOI1 表达水平降低其蛋白浓
度随之下降，从而导致茉莉素信号转导途径中断，处理 12 h 后抑制作用可能得以解除，检测到
GhCOI1 的表达水平回升。水稻 OsCOI1 基因的表达水平随 MeJA 处理时间呈现先升高后降低再升高
的趋势（Ye et al.，2012）。唐菖蒲 GhCOI1 表现出与其相似的 MeJA 诱导表达变化趋势，暗示唐菖
蒲 GhCOI1 在茉莉素信号转导途径中发挥作用的方式与水稻 OsCOI1 相似。
吴晨雨，何俊娜，钟雄辉，僧珊珊，吴 健，隋娟娟，刘 晨，吴 泽，刘 超，义鸣放.
唐菖蒲茉莉素受体基因 GhCOI1 的克隆与表达分析.
园艺学报，2015，42 (2)：289–300. 299

相关研究发现游离的 COI1 蛋白受 26S 蛋白酶体途径降解（Yan et al.，2013）。本研究中采用蛋
白酶体抑制剂处理洋葱表皮细胞，检测到 GhCOI1 蛋白定位于细胞质和质体中，与 SMART 软件预
测结果一致。由于该蛋白不存在跨膜结构域，推测在唐菖蒲叶片内存在 GhCOI1 蛋白的分子伴侣，
负责将其运送进入质体内发挥作用。通过本研究发现 GhCOI1 能响应外源茉莉素信号，参与唐菖蒲
茉莉素信号转导途径，由于该途径在植物抵御病害方面的重要作用及 GhCOI1 在该途径中的关键地
位，下一步探讨如何利用基因工程手段改良唐菖蒲的抗病能力，为改良种球及鲜切花的品质奠定理
论和技术基础。

References
Adie B A，Perez-Perez J，Perez-Perez M M，Godoy M，Sanchez-Serrano J J，Schmelz E A，Solano R. 2007. ABA is an essential signal for plant
resistance to pathogens affecting JA biosynthesis and the activation of defenses in Arabidopsis. Plant Cell，19 (5)：1665–1681.
Benedetti C E，Costa C L，Turcinelli S R，Arruda P. 1998. Differential expression of a novel gene in response to coronatine，methyl jasmonate，
and wounding in the COI1 mutant of Arabidopsis. Plant Physiol，116 (3)：1037–1042.
Chini A，Fonseca S，Fernandez G，Adie B，Chico J M，Lorenzo O，Garcia-Casado G，Lopez-Vidriero I，Lozano F M，Ponce M R，Micol J L，
Solano R. 2007. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature，448 (7154)：666–671.
Devoto A，Ellis C，Magusin A，Chang H，Chilcott C，Zhu T，Turner J G. 2005. Expression profiling reveals COI1 to be a key regulator of genes
involved in wound- and methyl jasmonate-induced secondary metabolism，defence，and hormone interactions. Plant Molecular Biology，58 (4)：
497–513.
Farmer E E，Ryan C A. 1990. Interplant communication：Airborne methyl jasmonate induces synthesis of proteinase inhibitors in plant leaves. Proc
Natl Acad Sci USA，87 (19)：7713–7716.
Feng S，Ma L，Wang X，Xie D，Dinesh-Kumar S P，Wei N，Deng X W. 2003. The COP9 signalosome interacts physically with SCFCOI1 and
modulates jasmonate responses. Plant Cell，15 (5)：1083–1094.
Glazebrook J. 2005. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu Rev Phytopathol，43：205–227.
Halitschke R，Baldwin. 2004. Jasmonates and related compounds in plant-insect interactions. Plant Growth Regul，23 (3)：238–245.
Howe G A，Lightner J，Browse J，Ryan C A. 1996. An octadecanoid pathway mutant（JL5）of tomato is compromised in signaling for defense against
insect attack. Plant Cell，8 (11)：2067–2077.
Hu T，Yang Y，Zeng H，Hu Z，Chen Z，Chen G，Wu Y. 2013. Transgenic pepper plants carrying RNA interference constructs of CaCOI1 gene show
severe abnormality. Mol Breed，31 (4)：971–979.
Jin J，Cardozo T，Lovering R C，Elledge S J，Pagano M，Harper J W. 2004. Systematic analysis and nomenclature of mammalian F-box proteins.
Genes Dev，18 (21)：2573–2580.
Katsir L，Schilmiller A L，Staswick P E，He S Y，Howe G A. 2008. COI1 is a critical component of a receptor for jasmonate and the bacterial
virulence factor coronatine. Proc Natl Acad Sci USA，105 (19)：7100–7105.
Koda Y. 1992. The role of jasmonic acid and related compounds in the regulation of plant development. Int Rev Cytol，135 (4)：155–199.
Lee H Y，Seo J，Cho J H，Jung H，Kim J，Lee J S，Rhee S，Do Choi Y. 2013. Oryza sativa COI homologues restore jasmonate signal transduction
in Arabidopsis COI1-1 mutants. PLoS ONE，8 (1)：e52802.
Li L. 2004. The tomato homolog of CORONATINE-INSENSITIVE1 is required for the maternal control of seed maturation，jasmonate-signaled
defense responses，and glandular trichome development. Plant Cell，16 (1)：126–143.
Liu F，Ni W，Griffith M E，Huang Z Y，Chang C Q，Peng W，Ma H，Xie D X. 2004. The ASK1 and ASK2 genes are essential for Arabidopsis early
development，Plant Cell，16 (1)：5–20.
Liu Feng. 2008. Identification and prevention of common diseases and insect pests in Gladiolus. Special Economic Animal and Plant，(2)：51–52.
(in Chinese)
刘 峰. 2008. 唐菖蒲常见病虫害的识别及其防治. 特种经济动植物，(2)：51–52.
Wu Chen-yu，He Jun-na，Zhong Xiong-hui，Seng Shan-shan，Wu Jian，Sui Juan-juan，Liu Chen，Wu Ze，Liu Chao，Yi Ming-fang.
Cloning and expression analysis of coronatine insensitive gene encoding a jasmonate receptor from Gladiolus hybridus.
300 Acta Horticulturae Sinica，2015，42 (2)：289–300.
María J Pozo，L C Van Loon，Corné M J Pieterse. 2004. Jasmonates signals in plant-microbe interactions. Plant Growth Regul，23 (3)：211–222.
Melotto M，Underwood W，Koczan J，Nomura K，He S Y. 2006. Plant stomata function in innate immunity against bacterial invasion. Cell，126
(5)：969–980.
Okubara P A，Call D R，Kwak Y，Youn-sig K，Daniel Z S. 2010. Induction of defense gene homologues in wheat roots during interactions with
Pseudomonas fluorescens. Biol Control，55 (2)：118–125.
Paschold A，Halitschke R，Baldwin I T. 2007. Co(i)-ordinating defenses：NaCOI1 mediates herbivore- induced resistance in Nicotiana attenuata and
reveals the role of herbivore movement in avoiding defenses. Plant J，51 (1)：79–91.
Skibbe M，Qu N，Galis I，Baldwin I T. 2008. Induced plant defenses in the natural environment：Nicotiana attenuata WRKY3 and WRKY6
coordinate responses to herbivory. Plant Cell，20 (7)：1984–2000.
Stintzi A，Weber H，Reymond P，Browse J，Farmer E E. 2001. Plant defense in the absence of jasmonic acid：The role of cyclopentenones. Proc
Natl Acad Sci USA，98 (22)：12837–12842.
Tan X，Calderon-Villalobos L I，Sharon M，Zheng C，Robinson C V，Estelle M，Zheng N. 2007. Mechanism of auxin perception by the TIR1
ubiquitin ligase. Nature，446 (7136)：640–645.
Thines B，Katsir L，Melotto M，Niu Y，Mandaokar A，Liu G，Nomura K，He S Y，Howe G A，Browse J. 2007. JAZ repressor proteins are targets
of the SCFCOI1 complex during jasmonate signalling. Nature，448 (7154)：661–665.
Thomma B P，Eggermont K，Penninckx I A，Mauch-Mani B，Vogelsang R，Cammue B P，Broekaert W F. 1998. Separate jasmonate-dependent
and salicylate-dependent defense-response pathways in Arabidopsis are essential for resistance to distinct microbial pathogens. Proc Natl Acad
Sci USA，95 (25)：15107–15111.
Wang Wen-yan，Yue Lin-xu，Zhang Yan-yi，Chu Jian-qing，Zhang Xiao-ying，Fang Jing-gui. 2012. Cloning of several important genes involved
in grapevine SA and JA signaling pathways and their response to exogenous signals. Acta Horticulturae Sinica，39 (5)：817–827. (in Chinese)
王文艳，岳林许，张演义，初建青，张晓莹，房经贵. 2012. 葡萄 SA 和 JA 信号转导重要基因克隆及其对外源信号应答 分析. 园艺学报，
39 (5)：817–827.
Xie D. 1998. COI1：An Arabidopsis gene required for jasmonate-regulated defense and fertility. Science，280 (5366)：1091–1094.
Xu L，Liu F，Lechner E，Genschik P，Crosby W L，Ma H，Peng W，Huang D，Xie D. 2002. The SCFCOI1 ubiquitin-ligase complexes are required
for jasmonate response in Arabidopsis. Plant Cell，14 (8)：1919–1935.
Yan J，Li H，Li S，Yao R，Deng H，Xie Q，Xie D. 2013. The Arabidopsis F-Box protein CORONATINE INSENSITIVE1 is stabilized by SCFCOI1
and degraded via the 26S proteasome pathway. The Plant Cell，25 (2)：486–498.
Yan J，Zhang C，Gu M，Bai Z，Zhang W，Qi T，Cheng Z，Peng W，Luo H，Nan F，Wang Z，Xie D. 2009. The Arabidopsis CORONATINE
INSENSITIVE1 protein is a jasmonate receptor. The Plant Cell Online，21 (8)：2220–2236.
Yan Y，Stolz S，Chetelat A，Reymond P，Pagni M，Dubugnon L，Farmer E E. 2007. A downstream mediator in the growth repression limb of the
jasmonate pathway. Plant Cell，19 (8)：2470–2483.
Ye M，Luo S M，Xie J F，Li Y F，Xu T，Liu Y，Song Y Y，Zhu Salzman K，Zeng R S. 2012. Silencing COI1 in rice increases susceptibility to
chewing insects and impairs inducible defense. PLoS ONE，7 (4)：e36214.