全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第9期
海门山羊是以生产优质笔料毛为特征的肉、皮、
毛兼用的山羊地方良种，主要分布长江三角洲地带
的海门、启东、南通等县。体格小，公母羊均有角、
有髯，背腰平直，后躯发达，被毛为全白色、短毛型，
公羊额部有卷毛，肩肿前缘和背部的毛较长。具有
早熟、繁殖力强，产羔多，耐高温高湿，耐粗饲，
适应性强，抗病力强和遗传性稳定等特点。随着经
济发展和人们生活水平的提高，海门山羊向肉用山
羊的方向发展，如何尽快提高海门山羊的生长速度
和肉用品质成了迫切需要解决的问题［1］。
MDFI（MyoD family inhibitor）基因，又名 I-mf
收稿日期 ： 2013-03-25
基金项目 ： 江苏省高校科研成果产业化推进工程项目（JHB2012-32），江苏高校优势学科建设工程资助项目，徐州市科技计划项目（XF12-
C052）
作者简介 ：王春侠，女，讲师，研究方向 ：生物化工 ；E-mail ：wcxjs@163.com
通讯作者 ：房兴堂，男，教授，硕士生导师，研究方向 ：动物遗传资源及利用 ；E-mail ：xtfang@jsnu.edu.cn
海门山羊 MDFI 基因 SNP 及其与体尺性状的关联分析
王春侠1  林加娟2  刘宣宣2  李园2  房兴堂2
（1. 江苏省徐州医药高等职业学校，徐州 221116 ；2. 江苏师范大学细胞与分子生物学研究所，徐州 221116）
摘 要 ： 采用 PCR-SSCP 和 DNA 测序技术，检测了 18 月龄海门母山羊共 116 只个体的 MDFI 基因所有外显子和部分内含子
的遗传变异，分析了其遗传多态性和遗传结构，并对该基因的多态位点与海门山羊的体尺性状进行了相关分析。结果表明，在海
门山羊 MDFI 基因的外显子 3 和外显子 4 共发现了 2 个 SNPs，引起了 1 个无义突变和 1 个错义突变。与体尺性状的相关性分析发现，
MDFI 基因的 2 个 SNPs 与海门山羊的体高、胸围和管围有显著相关（P<0.05），可作为海门山羊分子育种的辅助标记。
关键词 ： 海门山羊 MDFI 基因 单核苷多态性 遗传分析
Single Nucleotide Polymorphism of MDFI Gene and Association with
Body Size Traits in Haimen Goats
Wang Chunxia1 Lin Jiajuan2 Liu Xuanxuan2 Li Yuan2 Fang Xingtang2
（1. Jiangsu Provincial Xuzhou Pharmaceutical Vocational College，Xuzhou 221116 ；2. Institute of Cellular and Molecular Biology，Xuzhou
Normal University，Xuzhou 221116）
Abstract:  Genetic variations of MDFI gene were detected by PCR-SSCP and DNA sequencing in 116 Haimen goats at 1.5 years old.
Association analyses were conducted to evaluate the effect of genotypes of polymorphic loci on body size traits of the breed. The results showed
that two SNPs of Haimen goats in MDFI gene were found in extron 3 and extron 4, and caused one nonsense mutation and one missense mutation.
The genotypes of P4 and P5 loci had significant associations with the body height, circumference of cannon bone and chest circumference of
Haimen goat（P<0.05）. The associations were appropriate for the auxiliary mark of molecular breeding.
Key words:  Haimen goat MDFI gene Single nucleotide polymorphism（SNP） Genetic analysis
（Inhibitor of MyoD family）基因和 I-mfa（Inhibitor of
MyoD family a）基因，是一种负向转录调节因子［2］。
研 究 表 明，MDFI 蛋 白 具 有 与 MyoD 家 族 bHLH 域
（basic helix loop helix）结合的功能［3］，并且可以与
其他具有 bHLH 结构域的蛋白结合抑制它们的转录
活性，如 Zic 家族蛋白等，参与 Wnt 信号途径调节
生物体的生长发育，对生物体肌肉分化和骨骼生成
的调控更为重要［4］。MyoD 家族蛋白能促进肌肉的
分化和生成，Zic 家族蛋白在哺乳动物和脊椎动物中
轴骨骼发育时具有重要的正向作用。MDFI 蛋白对
骨骼形成的调控作用 ：脊柱的发育是由中胚层的生
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期100
骨节细胞围绕着脊髓和脊索形成的，而 MDFI 蛋白
在生骨节表达丰度最大，这预示着 MDFI 基因对骨
骼的发育有着密切的关系。已有报道揭示了 MDFI
对骨骼形成的作用，MDFI 通过与影响中轴骨骼图
式发育的锌指蛋白家族成员结合，掩盖其 NLS（核
定位信号）使之停留在胞质中从而抑制其转录活
性［4］。Tsujik 等［5］在原代小鼠颅盖骨细胞中检测
到 MDFI 基因的表达，且 VD3 能增强其表达。Chen
等［2］在研究小鼠胚胎分化时也发现，缺失 MDFI 基
因的小鼠在某些特定条件下可以存活，但是骨骼图
式发育比野生型小鼠要迟缓。由此可见 MDFI 蛋白
在骨骼细胞形成分化时发挥重要作用。此外，Ilgren
等［6］发现，MDFI 和具有 MDFI 高度保守的 C 末端
的 XIC，能阻碍 HMG 盒转录因子 Xtcf3 的转录活性
而抑制背轴的分化。因而，许多学者认为［7］，MDFI
既可以通过影响 Wnt 信号通路又能直接与 bHLH 蛋
白结合，达到调控这两条重要发育途径的作用。自
1996 年 Chen 等［2］发现 MDFI 基因以来，国内外关
于 MDFI 基因的研究大都集中于人类和小鼠胚胎生
长发育及肿瘤发生的研究上，对于山羊 MDFI 基因
遗传变异的研究未见报道。本研究对海门山羊 MDFI
基因多态性进行研究，并分析其与体尺性状的相关
性，旨在发现对重要经济性状具有显著效应的遗传
标记，为海门山羊遗传资源的保护与利用、分子育
种辅助标记的开展以及海门山羊生产性能的大幅提
高提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
从江苏省海门市随机抽取 116 只海门山羊（均
为 18 月龄母羊）的血样，静脉采血，ACD 抗凝，
冰冻运回后放入 -80℃保存待用。采样的同时按罗军
等［8］介绍的体尺测量方法测量山羊的各项体尺指标，
体尺数据包括 ：体高，体斜长，胸围，管围。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 由于目前还没有山羊 MDFI 基因
的 DNA 序列的报道，根据 GenBank 中牛的 MDFI 基
因 序 列（Accession No. ：NC_007324.4） 设 计 引 物，
扩增 MDFI 基因的所有外显子和部分的非编码区。
根据基因序列共设计了 5 对引物，扩增所用引物序
列、退火温度、扩增产物片段大小等具体信息，见
表 1。所用引物由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成。
表 1 MDFI 基因 PCR 引物序列及扩增条件
位点 引物序列（5 → 3） 产物大小（bp） 退火温度（℃） 扩增区域
P1
F ：5-CCCAGAACTTCCAGACAGCA-3
R ：5-AGGGCCTCTTCTCGGTGTT-3
280 63.0 5UTR
P2
F ：5-CACCCGCTGAGCCTTGTTTC-3
R ：5 TCCCGTCCGGTCTTGTTTTG 3
149 62.3 外显子 1 及部分内含子 1
P3
F ：5-TGGAGGGCACCAGAAGGATG-3
R ：5-GCTAGGCTCCCGTAGGCACA 3
329 62.8 外显子 2 及部分内含子 2
P4
F ：5-TTCTCCTCCATCGCCCTTTTC-3
R ：5-ATGCTGCTGCCGCTCCCT-3
331 67.5 外显子 3 及部分内含子 3
P5
F ：5-GCCTTGGGGTCACCTGGAA-3
R ：5-AGGGGTCAGGAGGAGAAGCAG-3
366 65.0 外显子 4 及部分 3’UTR
1.2.2 PCR-SSCP 分析 本研究采用天根公司的 Mix
扩 增 体 系， 即 总 体 积 为 15 μL 的 PCR 反 应 体 系 ：
2×buffer 7.5 μL，Taq DNA 聚合酶（2.5 U/μL）0.12
μL，基因组 DNA（50 ng/μL）0.6 μL，上下游引物（10
pmol/μL） 各 0.6 μL，ddH2O 5.58 μL。PCR 扩 增 程
序为 95℃预变性 5 min，94℃变性 30s，69.4℃退火
40 s，72℃延伸 40-60 s，共 35 个循环，72℃终延伸
10 min。PCR 产物经变性、电泳、显色后，判型。
1.2.3 数据的统计处理［9］ 利用 SPSS（14.0）软件，
根据以下线性模型，经最小二乘校正后对 MDFI 基
因位点的不同基因型间的海门山羊体尺性状进行方
差分析。
yij=μ + Gi + eij。
式中 ：yij 为第 i 个个体体尺性状的观察值 ；μ 为群体
2013年第9期 101王春侠等 ：海门山羊 MDFI 基因 SNP 及其与体尺性状的关联分析
均值 ；Gi 为第 i 个个体的基因型效应值 ；eij 为随机
残差效应。
2 结果
2.1 海门山羊基因组DNA样品的检测
采用酚、氯仿抽提法提取了 116 只海门山羊血
样中基因组 DNA。图 1 是基因组 DNA 在 1% 的琼脂
糖凝胶中的检测结果，电泳条带清晰，没有明显拖
尾现象。说明提取的海门山羊基因组 DNA 既无降解
也无 RNA，质量较好，可用于后续研究。
2000
1 2 3 4 5 6 7 8M
bp
1000
750
500
250
100
图 1 海门山羊基因组 DNA 检测电泳图谱
2.2 海门山羊MDFI基因5个位点的PCR扩增结果
与SSCP分析
2.2.1 PCR 扩增结果 对 MDFI 基因的所有外显子、
5 UTR、部分 3 UTR 和部分内含子进行 PCR 扩增，
共 5 个位点，依次命名为 P1-P5。扩增产物用 1% 的
琼脂糖凝胶电泳检测，图 2- 图 6 为相应的电泳结
果。从相应图谱中可以看出，扩增产物条带都很清
晰，特异性强，满足下一步试验的需要。
2000
bp
1000
750
500
250
100
图 2 海门山羊 MDFI 基因 P1 位点 PCR 扩增产物电泳图
谱（280 bp）
2000
bp
1000
750
500
250
100
图 3 海门山羊 MDFI 基因 P2 位点 PCR 扩增产物电泳图
谱（149 bp）
2000
bp
1000
750
500
250
100
图 4 海门山羊 MDFI 基因 P3 位点 PCR 扩增产物电泳图
谱（329 bp）
2000
bp
1000
750
500
250
100
图 5 海门山羊 MDFI 基因 P4 位点 PCR 扩增产物电泳图
谱（331 bp）
2000
bp
1000
750
500
250
100
图 6 海门山羊 MDFI 基因 P5 位点 PCR 扩增产物电泳图
谱（366 bp）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期102
2.2.2 PCR-SSCP 分 析 结 果 以 海 门 山 羊 基 因 组
DNA 为模板，采用相应的最佳扩增条件进行扩增，
产物送到上海生工生物科技服务有限公司进行双向
测序，初步检测有无突变存在。对 MDFI 基因 5 个
位点的扩增片段用 0.5×TBE 缓冲液，进行 10% 聚
丙烯酰胺（29∶1）凝胶电泳检测，150 V 过夜，电
泳时间根据片段长度大小而定。结果（图 7）显示
在海门山羊的 P1、P2 和 P3 位点均未出现多态性，在
P4 和 P5 位点上表现出了多态性，P4 位点存在 3 种带
型，分别命名为基因型 A4A4、B4B4 和 A4B4，P5 只检
测到 2 种带型，分别命名为基因型 A5A5 和 A5B5。电
泳结果条带清晰，能够清楚准确地进行条带判型。
2.4 MDFI基因P4和P5位点遗传结构分析
2.4.1 MDFI 基因 P4 位点遗传结构分析 海门山羊
MDFI 基因 P4 位点的基因型和等位基因的频率统计
结果（表 2）显示，P4 位点有 3 种基因型。在所研
究的海门山羊品种中，A4A4 纯合体占绝大多数。
根据 Nei 的方法计算了 P4 位点的遗传多态性指
标，包括纯合度，杂合度，有效等位基因数和多态
信息含量（表 3）。
2.4.2 MDFI基因P5 位点遗传结构分析 海门山羊MD-
FI 基因 P5 位点的基因型和等位基因的频率统计结果
见表 4。从表 4 可以看出，P5 位点有 2 种基因型。在
所研究的海门山羊品种中，A5A5 纯合体占绝大多数。
根据 Nei 的方法计算了 P5 位点的遗传多态性指
标，包括纯合度，杂合度，有效等位基因数和多态
信息含量（表 5）。
P4ս⛩
P5ս⛩
B4B4 A4B4 B4B4 A4A4 A4B4 B4B4
A5A5 A5A5 A5A5 A5A5 A5B5 A5A5
图 7 海门山羊 MDFI 基因的多态的 P4 和 P5 位点的 PCR-
SSCP 电泳图谱
2.3 DNA测序及序列分析
2.3.1 P4 位 点 的 DNA 测 序 及 序 列 分 析 对 SSCP
检测 P4 位点时表现带型不一样的扩增产物样品进
行 测 序， 与 GenBank 上 提 交 号 的 序 列 比 对 显 示，
在 P4 位点临近 3UTR 的外显子区域存在 1 个 SNP
（NC_007324.4 ：g.12211C>A）（ 图 8）。 P4 位 点 有 3
种基因型，分别为 A4A4、A4B4 和 B4B4。此突变导致
了其编码的氨基酸由半胱氨酸（TGC）转变成了终
止密码子（TGA），这必然会导致阅读框（ORF）的
改变，从而使 MDFI 基因翻译的提前结束。因此预
测该突变会对 MDFI 蛋白结构和功能产生较大影响。
2.3.2 P5 位点的 DNA 测序及序列分析 在海门山羊
MDFI 基因 P5 位点上检测到两种带型，将不同带型
的扩增产物送去测序，测序结果与 GenBank 上提交
号的序列比对，序列存在 1 个 SNP（NC_007324.4 ：
g.16211C>A）（图 9）。P5 位点仅检测到两种基因型 ：
A5A5 和 A5B5 型，在所有检测的海门山羊中均未发现
突变纯合个体。此位点的突变位于外显子上，会引
起 ORF 中密码子的改变，这可能会导致其所编码的
氨基酸发生改变，即由丝氨酸转变成酪氨酸。
T A AG G C G C CC
T A AG G C G C CC
T A AG G A G C CC
I
II
III
Ⅰ ：A4A4 型 ；Ⅱ ：A4B4 型 ；III ：B4B4 型 ；箭头标明 SNPs
图 8 MDFI 基因 P4 位点的部分测序峰图
C T G GT TC C
C T G GT TA C
I
II
Ⅰ ：A5A5 型 ；Ⅱ ：A5B5 型 ；箭头标明 SNPs
图 9 MDFI 基因 P5 位点的部分测序峰图
2013年第9期 103王春侠等 ：海门山羊 MDFI 基因 SNP 及其与体尺性状的关联分析
表 5 MDFI 基因 P5 位点的群体遗传结构分析
品种 纯合度 杂合度
有效等位
基因数
多态信
息含量
信息熵
海门山羊（HM） 0.776 0.224 1.249 0.179 0.351
2.5 MDFI基因多态性与体尺性状的关系
对 P4 位点的 3 种基因型 4 个体尺性状进行关
联分析，结果见表 6。从表 6 可以看出基因型 B4B4
个 体 比 A4A4 和 A4B4 基 因 型 个 体 体 高 指 标 分 别 高
出 21.73% 和 15.5%， 基 因 型 B4B4 个 体 比 A4A4 基
因型个体体长指标高出 8.6%，基因型 B4B4 个体比
A4A4 和 A4B4 基因型个体胸围指标分别高出 21.5% 和
6.4%，基因型 B4B4 个体比 A4A4 和 A4B4 基因型个体
管围指标分别高出 23.6% 和 7.7%。P4 位点的突变与
海门山羊的体高、胸围、管围显著相关（P<0.05）。
表 6 MDFI 基因 P4 位点对海门山羊体尺性状的方差分析
体尺性状
基因型（LSM ± SE）
P 值
A4A4（N = 93） A4B4（N = 9） B4B4（N = 14）
体高（cm） 52.301±0.321a 60.429±0.272b 63.667±0.373b 0.013
体长（cm） 101.419±0.697a 110.929±1.762b 110.222±1.824b 0.002
胸围（cm） 64.645±0.485a 73.786±1.810b 78.556±1.987b 0.013
管围（cm） 7.145±0.691a 8.200±0.217b 8.833±0.204b 0.011
LSM±SE 表示最小二乘值 ± 标准误；同行上标字母不同表示差异显著（P<
0.05）
对 P5 位点的 2 种基因型 4 个体尺性状进行关联
分析，结果见表 7。从表 7 可以看出基因型 A5B5 个
体比 A5A5 基因型个体体高指标高出 17.5%，基因型
A5B5 个体比 A5A5 基因型个体胸围指标高出 16.1%，
基因型 A5B5 个体比 A5A5 基因型个体管围指标高出
18.3%。P5 位点的突变与海门山羊的体高、胸围和
管围显著相关（P<0.05）。
表 7 MDFI 基因 P5 位点对海门山羊体尺性状的方差分析
体尺性状
基因型（LSM ± SE）
P 值
A5A5（N=90） A5B5（N=26）
体高（cm） 52.111±0.312a 61.209±0.424b 0.010
体长（cm） 101.256±0.706 101.154±1.202 0.912
胸围（cm） 64.500±0.492a 74.885±1.322b 0.011
管围（cm） 7.111±0.066a 8.415±0.162b 0.009
LSM±SE 表示最小二乘值 ± 标准误 ；同行上标字母不同表示差异显著
（P<0.05）
3 讨论
在 MDFI 基因研究中，Kraut 等［7，10，11］对 MDFI
基因作图，将其定位在人 6p21 染色体和小鼠 17 号
染色体，牛的 MDFI 基因定位在 23 号染色体。MDFI
蛋白具有 247 个氨基酸，在整个氨基酸序列 C 末端
中半胱氨酸含量最高。MDFI 基因编码的 247 个氨基
酸，能够对哺乳动物的肌肉分化和骨骼生长起负向
调控作用，MDFI 基因发生突变可能会导致 MDFI 蛋
白功能的缺失。本研究首次对海门山羊 MDFI 基因
的 SNP 进行分析，在 P1、P2、P3 位点未检测到多态性，
而在 P4、P5 位点发现了 2 个 SNPs。在 P4 位点检测
到 A4A4、A4B4 和 B4B4 3 种基因型，PIC 为 0.210，属
于低度多态。在 P5 位点检测到 A5A5、A5B5 2 种基因
型，未发现突变纯合个体，PIC 为 0.179，属于低度
多态。可见，海门山羊具有丰富独特的遗传基因资
源，有必要对其保护、开发和利用。
本研究结合 DNA 测序结果，与 NCBI 上最新
提交的序列进行比对，发现存在 2 个遗传变异位
点。P4 位 点（NC_007324.4 ：g.12211C>A） 导 致 半
胱氨酸转变成终止密码子，从而使 MDFI 蛋白近 C
末端结构部分缺失，最终致使编码的蛋白失去生理
活性，且众多研究推测 MDFI 蛋白的 C 末端为其功
能域，该无义突变可能导致其功能丧失。P5 位点
（NC_007324.4 ：g. 16211C>A）导致丝氨酸转变成酪
氨酸，从而引起 ORF 中密码子的改变，这可能会导
致其所编码氨基酸发生改变，该错义突变则可能导
致其功能丧失。是否会影响 MDFI 蛋白结构及影响
的程度等问题还需要进一步研究。
体高、体长、胸围和管围是 4 个主要的体尺指
表 3 MDFI 基因 P4 位点的群体遗传结构分析
品种 纯合度 杂合度
有效等位
基因数
多态信
息含量
信息熵
海门山羊（HM） 0.879 0.121 1.312 0.210 0.401
表 2 MDFI 基因 P4 位点的基因频率和基因型频率
品种
基因型 等位基因频率
A4A4 B4B4 A4B4 A4 B4
海门山羊（HM） 93 14 9 0.862 0.138
表 4 MDFI 基因 P5 位点的基因频率和基因型频率
品种
基因型 等位基因频率
A5A5 A5B5 A5 B5
海门山羊（HM） 90 26 0.888 0.112
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期104
标，其对山羊的产肉性能具有重要的作用，所以在
遗传育种中最先考虑该 4 个体尺指标。相关性分析
结果表明海门山羊 P4 和 P5 位点突变均与海门山羊
的体高、体长、胸围和管围显著相关（P<0.05）。因
此海门山羊的 MDFI 基因的 2 个 SNP 可为其作为潜
在的生长发育性状标记提供一定的参考，但目前未
见到山羊相关生长性状与该基因的关联性研究，所
以 MDFI 是否可以作为新的影响山羊生长性状的分
子标记，应用于标记辅助选择，还有待在更多品种
和更大群体中进行更深入验证。
4 结论
采用 PCR-SSCP 和 DNA 测序技术检测了海门山
羊 MDFI 基因的遗传变异，共发现 2 个 SNPs。2 个
SNPs 与海门山羊的体高、胸围和管围有显著相关，
可作为海门山羊分子育种的辅助标记。
参 考 文 献
［1］ 黄玮 , 王锋 , 徐辉 , 等 . 加快发展海门山羊产业的思考［J］. 畜
牧与兽医 , 2011, 43（10）：44-46.
［2］ Chen CM, Kraut N, Groudine M, et al. I-mf, a novel myogenic
repressor, interacts with members of the MyoD family［J］. Cell,
1996, 86（5）：731-741.
［3］ Kraut N, Snider L, Chen CM, et al. Requirement of the mouse I-mfa
gene for placental development and skeletal patterning［J］. The
EMBO Journal, 1998, 17（21）：6276-6288.
［4］ Mizugishi K, Hatayama M, Tohmonda T, et al. Myogenic repressor
I-mfa interferes with the function of Zic family proteins［J］.
Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004, 320
（1）：233-240.
［5］ Tsuji K, Kraut N, Groudine M, et al. Vitamin D3 enhances the exp-
ression of I-mfa, an inhibitor of the MyoD family, in osteoblasts［J］.
Biochimicaet Biophysica Acta, 2001, 1539（12）：122-130.
［6］ Ilgren EB. Control of trophoblastic growth［J］. Placenta, 1983, 4
（3）：307-328.
［7］ Kraut N. The gene encoding I-mf（Mdfi）maps to human Chromo-
some 6p21 and mouse Chromosome 17［J］. Mammalian Genome,
1997, 8（8）：618-619.
［8］ 罗军 , 王志云 , 陈玉林 . 肉羊实用生产技术［M］. 西安 ：陕西
科学技术出版社 , 1998.
［9］ Nei M, Roychoudhury AK. Sampling variances of heterozygosity and
genetic distance［J］. Genetics, 1974, 76（2）：379-390.
［10］ Chen H, Leibenguth F. Studies on multilocus fingerprints RAPD
markers and mitochondrial DNA of a gynogenetic fish（Carassius
auratus gibelio）［J］. Biochem Genet, 1995, 33（9-10）：297-
306.
［11］ Joudrey EM, Lechniak D, Petrik J, et al. Expression of growth
hormone and its transcription factor, Pit-1, in early bovine develop-
ment［J］. Molecular Reproduction and Development, 2003, 64
（3）：275-283.
（责任编辑 李楠）