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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 ：2012-01-13
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30671349），公益性行业（农业）科研专项（200903049-05）
作者简介 ：董章勇，男，博士，讲师，研究方向 ：微生物学和分子植物病理学 ；E-mail: dongzhangyong@hotmail.com
通讯作者 ：王振中，男，博士，教授，研究方向 ：植物病理学 ；E-mail: zzwang@scau.edu.cn
香蕉枯萎病菌果胶甲基酯酶基因的克隆与
生物信息学分析
董章勇1， 2 王振中2
（1 仲恺农业工程学院，广州 510225 ；2 华南农业大学植物病理生理学研究室，广州 510642）
摘 要： 旨在了解香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）4号生理小种（FOC4）PME基因序列特征，根据同
源物种 PME相关序列设计引物，利用 PCR和 RT-PCR技术，克隆 FOC4序列基因和开放阅读框，命名为 Foc4Pme。结果表明，
所获得的 PME基因均含有 2个内含子和 3个外显子，990 bp的片段，编码 329个氨基酸。预测编码蛋白有信号肽，具有 1个功
能位点，其分子质量和等电点分为 34.894 8 kD和 9.17，该蛋白为稳定存在的蛋白。该蛋白疏水性最大值为 2.022，最小值为 -2.156，
大部分区域为亲水区。该基因编码的蛋白具有一定保守性，进化上与镰刀菌亲缘关系最近。
关键词： 果胶甲基酯酶 香蕉枯萎病 香蕉枯萎病菌 生物信息学分析
Cloning and Bioinformatic Analysis of Pectin Methylesterase
Gene from Fusarium oxyporum f. sp. cubense
Dong Zhangyong1,2 Wang Zhenzhong2
（1Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225；2Laboratory of Physiological Plant Pathology，South China
Agricultural University，Guangzhou 510642）
Abstract: To understand the Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4 （FOC4） pectin methylesterase （PME） gene sequence features,
a pair of primer that according to the homologous gene sequence documented in GenBank was designed to amplify the PME gene. Using PCR
and RT-PCR, the genome and open reading frame （ORF） from FOC4 was successfully amplified and named it Foc4Pme. The gene included 2
introns and 3 exons. The ORF encoded 329 amino acid polypeptide with 34.894 8 kD of calculated molecular weight and 9.17 of pI. The protein
hydrophobic maximum 2.022, minimum value is -2.156, most of the region for the hydrophilic areas.The protein with evolutionary conservative
and got the closest relatives with Fusarium.
Key words: Pectin methylesterase Fusarium wilt Fusarium oxyporum f. sp. cubense Bioinformatic analysis
香蕉枯萎病又称香蕉巴拿马病、黄叶病，是一
种毁灭性的香蕉病害，病原菌为尖孢镰刀菌古巴专
化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）。该菌的 4
个生理小种中的 4 号小种（FOC4）几乎能侵染所有
香蕉种类，如 Cavendish、大蜜哈、矮香蕉、棱指蕉等，
危害最大［1-5］。目前香蕉枯萎病仍无有效的防治方法，
因而，FOC4 的出现和在全球的蔓延，使香蕉产业再
度陷入危机，Grimm ［6］认为一旦 FOC4 在拉丁美洲
的香蕉产区爆发，香蕉产业将面临覆灭的危险。
细胞壁降解酶（cell wall degrading enzymes，CW-
DEs）是病原物产生的对寄主的细胞壁组分有降解
作用的酶类，它能使真菌穿入并侵染寄主植物组
织，也可能在真菌生活史中的某一阶段起到营养作
用。董章勇等［7-10］研究表明，细胞壁降解酶在香
蕉枯萎病入侵过程中起重要的作用。果胶酶是众
多细胞壁降解酶中的一种。果胶甲基酯酶（pectin
methylesterase，PME 或 PE）是一种果胶酶（Pectina-
se），属于水解酶（hydrolase）。PME 的活动贯穿在细
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期112
胞新陈代谢的全过程。贾永健等［11］研究表明 PME
在辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的致病过程中起
重要作用。本研究通过克隆香蕉枯萎病菌尖镰刀菌
古巴专化型生理小种 4 号 PME 基因，并根据其序列
信息推测 PME 基因编码的蛋白结构及进化关系，旨
在为进一步研究其在 FOC4 致病中的作用打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料 香蕉枯萎病菌 4 号生理小种，田间采
样分离后经过致病性鉴定，保存于华南农业大学资
源环境学院植物病理生理学研究室 ；DNA 提取试
剂盒 E. Z. N. A. Fungal DNA Kits、RNA 提取试剂盒
E. Z. N. A. Fungal RNA Kits等购自Omega Biotek公司；
DNA 分子量标准、DNA 凝胶回收试剂盒等购自北京
天根公司 ；rTaq酶、pMD18-T vector、M-MLV 反转
录酶均购自宝生物工程有限公司 ；引物合成与测序
由广州英骏生物技术有限公司完成。
1.1.2 培养基 葡萄糖培养基 ：KNO3 10 g、KH2PO4
5 g、MgSO4·7H2O 2.5 g、FeCl3 0.02 g、葡萄糖 50 g
水定容至 1 000 mL ；柑桔果胶培养基 ：KNO3 10 g、
KH2PO4 5 g、MgSO4·7H2O 2.5 g、FeCl3 0.02 g、柑桔
果胶 50 g 水定溶于 1 000 mL。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 和总 RNA 的提取 分别滤取在
葡萄糖液体培养基中培养 7 d 的 FOC4 菌丝体，参照
DNA 提取试剂盒 E. Z. N. A. Fungal DNA Kits 提取基
因组 DNA，滤取柑桔果胶培养基中培养 7 d 的 FOC4
菌丝体，参照 RNA 提取试剂盒 E. Z. N. A. Fungal
RNA Kits 操作说明提取总 RNA。
1.2.2 引物设计与克隆 根据 NCBI 公布的 PME 同
源基因（XP_003042680.1、XP_383582.1、XP_00300-
3175.1 和 EFQ28960.1 等）序列设计一对引物：PME-
F（5-ATGAAGTTCCTCACAACATTG-3）和 PME-R
（5-CTACATGTAAGAAGCATCGTA-3）。
PCR 体系（50 μL）含模板 DNA 2 μL、10 μmol/L
的双向引物各 1 μL、2.5 mmol/L 的 dNTP mix 4 μL、
rTaq 酶 0.4 μL、10×rTaq Buffer（Mg2+ plus）5 μL、
超纯水 34.6 μL。PCR 扩增程序 ：94℃预变性 5 min ；
94℃变性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，循
环 35 次 ；最后 72℃延伸 5 min。PCR 产物经琼脂
糖凝胶电泳，采用天根凝胶回收试剂盒回收目的
片段，连接到克隆载体 pMD18-T vector。连接反应
液含 pMD18-T vector 1 μL、Solution I 5 μL、目的片
段 4 μL，共 10 μL，16℃孵育 12 h。连接产物转化
Escherichia coli DH5α 感受态细胞，涂平板，待菌液
吸干后倒置平板于 37℃培养 12-16 h ；随机挑取白
色单菌落到含有氨苄青霉素 50 mg/L 的 LB 液体培养
基中，37℃，200-300 r/min 振荡培养过夜，然后以
1 μL 菌液为模板进行 PCR 扩增反应，同时以无菌水
为模板设为对照。反应体系（不同点在于模板为培
养菌液）及反应条件同上。将阳性克隆交由广州英
骏生物技术有限公司进行测序。
1.2.3 基因的 cDNA 克隆 以香蕉枯萎病菌 4 号生
理小种总 RNA 为模板，按反转录酶的使用说明进行
cDNA 第一链的合成 ；再用 cDNA 第一链为模板，采
用方法 1.2.1 中同样的引物扩增，PCR 产物经琼脂糖
凝胶电泳，采用天根凝胶回收试剂盒回收目的片段，
克隆到 pMD18-T vector 进行序列测定。PCR 反应条
件及克隆方法同方法 1.2.2。
1.2.4 序列分析 测序结果通过 GenBank 中的 Blast
搜索数据库进行序列的同源性比较分析，用 Prot-
param 预测其编码蛋白质的等电点及相对分子质
量，采用 PROSITE 进行蛋白质功能位点预测，采用
SignalP 程序预测其信号肽。利用 Blast 在 NCBI 网
站进行序列相似性比对分析 ；通过比对，确认外显
子和内含子区域，进一步用 Sim4 在线工具进行验
证。ORF 预测在 NCBI 上的 ORF Finder 上进行预测。
利用 DNAMAN 进行同源性分析和多序列比对。用
PredictProtein 预测蛋白的二级结构。蛋白质的亲疏
水性用 ProtScale 程序分析。蛋白质三维结构预测采
用同源建模法，使用 SWISS-MODEL 进行。
1.2.5 分子系统进化分析 采用 Clustal X 2.1 进行
多序列比对后，利用 MEGA 5 软件中的 Neighbor-
Joining 方法，5 000 次重复构建分子系统进化树，进
行分析系统进化分析。
2 结果
2.1 基因克隆及序列分析
以 cDNA 为模板，用 PME-F 和 PME-R 引物进行
2012年第6期 113董章勇等 ：香蕉枯萎病菌果胶甲基酯酶基因的克隆与生物信息学分析
PCR 扩增，得到长约 1 000 bp 的条带（图 1）。该基
因的开放阅读框包含 990 bp 的片段，编码 329 个氨
基酸，命名为 Foc4Pme。用 Protparam 工具对该基因
编码的蛋白进行预测，其分子质量为 34.894 8 kD ；
理论等电点为 9.17 ；分子式为 C1546H2372N418O489S8，
共有 4 833 个原子组成 ；稳定系数为 21.55，推测该
蛋白是稳定存在的蛋白。
2.3 香蕉枯萎病4号小种果胶甲基酯酶蛋的二级结
构预测
329 个氨基酸组成的香蕉枯萎病 4 号小种 PME
的二级结构螺旋由 α-螺旋（alpha helix，Hh）、β-折
叠（β-sheet，E）和 loop 结构（Loop，L）组成。Hh
占了 8.81%，E 占了 44.68%，L 占了 46.50%。在植物、
动物及原核生物中，该类型的蛋白均定位于细胞外。
该蛋白没有核定位信号（Nuclear Localization Signals，
NLS）的存在。2 个 N-糖基化位点（N-glycosylation
site），216 位 NMSY 和 258 位 的 NMTS ；4 个 蛋 白
激酶 C 磷酸化位点（Protein kinase C phosphorylation
site），分别为 27、52、97 和 113 位的 TVK、SGK、
TAK 和 TLR ；3 个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点（Casein
kinase II phosphorylation site）， 分 别 为 63、101 和
273 位的 TYNE、SQAS 和 TGEE ；1 个酪氨酸激酶磷
酸化位点（Tyrosine kinase phosphorylation site），321
位的 KGFYDASY ；8 个豆蔻酸位点（N-myristoylation
site），分别为 35、91、151、184、232、287、295 和
316 位的 GQFGTV、GNKVTI、GVALTG、GQTASA、
GNAVAN、GNTGAG、GQRASF 和 GNYASK ；1 个果
胶酯酶位点（Pectinesterase signature 2），为 175 位
的 IQGATDFIFG。
2.4 香蕉枯萎病4号小种果胶甲基酯酶的亲疏水性
与三级结构预测
香蕉枯萎病 4 号小种果胶甲基酯酶编码蛋白的
疏水性分析（图 3）表明，疏水性最大值为 2.022，
最小值为 -2.156，大部分区域为亲水区。在 PDB 数
据库现有的果胶甲基酯酶数据库中，香蕉枯萎病 4
号小种 FOC4PME 与 PDB 号为 1gq8A 的一致性最高，
以此为模板对 FOC4PME 进行同源建模（图 4）。高
亲水性水域集中在蛋白质的卷曲结构部位。其表面
往往富集亲水性氨基酸，同时也是蛋白质中氨基酸
插入的主要位点。
2.5 香蕉枯萎病4号小种果胶甲基酯酶的多序列比
对与系统进化树
将香蕉枯萎病 4 号小种果胶甲基酯酶氨基酸序
列提交 NCBI 在线比对，选择与其同源性较高的 3 个
物种的氨基酸 ：玉蜀黍赤霉（Gibberella zeae：XP_3-
83582.1）、赤球丛赤壳（Nectria haematoc：XP_00304-
M. DNA Marker ；1， 2. Foc4Pme 基因 ；3. CK
图 1 香蕉枯萎病 4号小种 PME基因 cDNA扩增图
2.2 香蕉枯萎病4号小种PME基因DNA序列的获
得及结构分析
从香蕉枯萎病菌 4 号小种菌丝中提取全基因组
DNA，用合成的 PME-F 和 PME-R 引物进行 PCR，
扩增到长约 1 000 bp 的条带，测序获得基因组序
列（图 2）。经克隆测序得到 ORF 核苷酸序列，通
过 ORF 和基因组序列对比，发现该 PME 基因含有
2 个内含子和 3 个外显子，内含子长度分别为 47 bp
和 49 bp，分隔的 3 个外显子的长度分别为 449 bp、
172 bp 和 369 bp。用 PROSITE 预测显示该蛋白在
175-184 位点（IQGATDFIFG）具有果胶酯酶位点。
根据 SIGNALP 程序分析，预测该蛋白为前 15 个氨
基酸，最有可能的剪切位点为15与16个氨基酸之间。
M. DNA Marker ；1. Foc4Pme 基因
图 2 香蕉枯萎病 4号小种 PME基因 DNA扩增图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期114
种果胶甲基酯酶基因，命名为 FOC4Pme。该基因的
开放阅读框包含 990 bp 的片段，编码 329 个氨基酸。
其 DNA 序列含有 2 个内含子和 3 个外显子，内含子
长度分别为 47 bp 和 49 bp，分隔的 3 个外显子的长
度分别为 449 bp、172 bp 和 369 bp。由于果胶酯酶
来源广泛，且有很多同工酶，是一个多基因家族酶。
因此它们的性质有所差别。总之，果胶酯酶是一种
中分子量酶，分子量范围在 23-62 kD 之间。Christg-
au 等［12］克隆的细丝状真菌针尾曲霉的果胶甲基酯
酶含有一个 993 bp 的开放阅读框，分子量 43 kD。
两者氨基酸序列长度差异不大，但分子量有所差异。
疏水性氨基酸值大于 0，亲水性氨基酸值小于 0
图 4 FOC4PME的三级结构预测图 3 FOC4PME的亲疏水性
2680.1）、轮枝孢属（Verticillium alb：XP_00300317-
5.1），使用 DNAMAN 软件将这些序列进行比对（图 5）
发现，其中 FOC4 与玉蜀黍赤霉的同源性最高，为
85.41%，其次是赤球丛赤壳，为 85.31%，轮枝孢属
最低，为 75.76%。
香蕉枯萎病菌 PME 的氨基酸序列与从 GenBank
中获得的其他真菌的 PME 序列进行系统进化分析
（图 6）显示，2 种镰刀菌首先聚类，在进化上具有
较非常近的亲缘关系，其次与玉蜀黍赤霉聚类。
3 讨论
本研究通过 RT-PCR 克隆了香蕉枯萎病 4 号小
Nectria haematococca（赤球丛赤壳，XP_003042680.1）；Gibberella zeae（玉蜀黍赤霉，XP_383582.1）；Verticillium albo-atrum（XP_003003175.1）
图 5 FOC4PME与其他真菌氨基酸序列比较
2012年第6期 115董章勇等 ：香蕉枯萎病菌果胶甲基酯酶基因的克隆与生物信息学分析
说明 PME 基因在进化过程中比较保守。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）
Nectria haematococca（XP_003042680.1）；Gibberella zeae（XP_383582.1）；
Verticillium albo-atrum（XP_003003175.1）；Glomerella graminicola
（EFQ28960.1）；Verticillium dahliae（EGY14635.1）；Magnaporthe oryzae
（XP_368626.1）；Sordaria macrospora（XP_003349159.1）；Neurospora
tetrasperma（EGO54704.1）；Thielavia terrestris（XP_003652594.1）；
Chaetomium thermophilum（EGS21887.1）；Fusarium oxysporum
（EGU77183.1）；Phaeosphaeria nodorum（XP_001802863.1）；Vitis riparia
（AAD51853.1）；Myceliophthora thermophila（XP_003666007.1）
图 6 香蕉枯萎病与其他物种 PME氨基酸序列的
系统进化树
FOC4PME 的分子质量为 34.9 kD。PME 的来源广泛，
无论来自于植物还是微生物，其性质都有较大差别，
有酸性、碱性和中性 3 种形式。FOC4PME 等电点为
9.17，为碱性蛋白。PROSITE 预测显示，FOC4PME
在 175-184 位具有 1 个果胶酯酶位点。
在 84% 的 PMES 前区域和 70% 的成熟酶中都发
现了潜在的糖基化位点（NXT、NXS）。所有的真菌
PMES 有 1-6 个潜在的糖基化位点［13］，FOC4PME
具有 2 个 N-糖基化位点。Christgau 等［12］的研究表
明针尾曲霉的 PMEI 与黑曲霉的 PME 具有 83% 的相
似性和 74% 的一致性，并且测出 4 个保守区域。本
研究的分析中表明 PME 的相似性也较高。从进化上
看，FOC4PME 还是与镰刀菌相距最近。本研究的
结果从分子水平上丰富了香蕉枯萎病菌的进化理论，
为进一步研究 PME 在香蕉枯萎病致病过程中的作用
打下基础。
4 结论
本研究从香蕉枯萎病 4 号小种中成功克隆得到
果胶甲基酯酶基因，命名为 Foc4Pme。该基因编码
的蛋白质具有果胶酯酶位点，与其他物种的同源性
较高，不同属真菌间氨基酸水平上的同源性较高，