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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第4期
收稿日期 : 2011-11-08
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31000564）, 山东省高校科技计划（G08LG53, J10LF12）
作者简介 : 王娟 , 女 , 硕士 , 研究方向 : 干细胞培养及表观遗传机制 ; E-mail: wangjuan76@126.com
通讯作者 : 焦飞 , 男 , 博士 , 研究方向 : 干细胞定向分化机理 ; E-mail: slytjiaofei@yahoo.com.cn
不同培养条件对鸡胚胎生殖细胞 Oct4启动子 DNA
甲基化的影响
王娟1 焦飞2 于媛2 潘效红1 马云3
（1 滨州医学院药学院细胞工程教研室，烟台 264003 ；2 滨州医学院基础学院生物化学教研室，烟台 264003 ；
3 滨州医学院基础学院病理教研室，烟台 264003）
摘 要： 旨在在体外通过胚胎生殖细胞（EGC）和细胞外基质共同构建一个 EGC的小生境（niche）模型，通过比较 Oct4
DNA甲基化的变化，研究 niche中特有的表观遗传效应对胚胎生殖细胞自我更新的影响。构建 EGC细胞标准培养方案（对照组）
和改良培养方案（试验组），采用甲基化特异性 PCR（MS-PCR）技术、RT-PCR技术，对比分析两种培养方案中 Oct4启动子的甲
基化状态，判断基因表达与其 CpG岛甲基化的关系，分析 DNA甲基化模式与 EGC细胞自我更新的关系。结果显示，试验组可扩
增出 Oct4的非甲基化扩增产物，而对照组为其甲基化扩增产物，试验组 Oct4表达水平明显高于对照组。试验组 EGC生长状态明
显好于对照组。试验表明，在改良培养条件下，Oct4基因启动子 DNA甲基化程度较低，且与基因表达水平呈负相关，更有利于维
持胚胎生殖细胞的自我更新状态。
关键词： 胚胎生殖细胞 Oct4基因 DNA甲基化 全能性
Effect of Different Culture Conditions on the DNA Methylation Status of
Oct4 Promoter in Chick Embryonic Germ Cells
Wang Juan1 Jiao Fei2 Yu Yuan2 Pan Xiaohong1 Ma Yun3
（1Department of Cell Engineering, School of Pharmaceutical Sciences, Binzhou Medical College, Yantai 264003；2Department of Biochemistry,
School of Basic Medical Sciences, Binzhou Medical College, Yantai 264003；3Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences,
Binzhou Medical College, Yantai 264003）
Abstract: It was to establish a niche model for embryonic germ cells（EGCs）through culturing EGCs in extracellular matrix in vitro.
By comparing DNA methylation changes in Oct4 gene, we studied the impact of specific epigenetic effects in niche on the self-renewal of EGCs.
Chick EGCs were cultured in standard procedure （control group） and improved procedure （experimental group）, respectively. Methylation-
specific PCR （MS-PCR） and RT-PCR were performed to compare the methylation status of Oct4 promoter and its expression level in different
procedures. The relationship between Oct4 expression and its methylation status was also determined. Moreover, the relationship between DNA
methylation patterns of Oct4 and the self-renewal capability of chick EGCs was explored. Results showed non-methylated products of Oct4
could be amplified in experimental group. While in the control group, the products of PCR amplification were methylated. The level of Oct4
expression was significantly higher in experimental group than in control group. Similarly, the growth state of EGC was significantly better in
the experimental group than in the control group. In the improving culture conditions, the methylation level of Oct4 promoter is much lower, and
there was a negative correlation between the level of Oct4 expression and its methylation status. These results indicated that low methylation and
high expression of Oct4 can promote the self-renewal maintenance of EGCs.
Key words: Embryonic germ cells（EGCs） Oct4 gene DNA methylation Pluripotency
胚 胎 生 殖 细 胞（embryonic germ cells，EGCs） 是一类未分化的细胞或原始细胞，具有多潜能分化
2012年第4期 119王娟等 ：不同培养条件对鸡胚胎生殖细胞 Oct4 启动子 DNA 甲基化的影响
及自我更新两个生物学特性，因此是胚胎干细胞
（embryonic stem cells，ES）的来源之一［1］。目前，
胚胎生殖细胞自我更新机制的研究是细胞生物学和
发育生物学研究的热点，也是胚胎生殖细胞得以临
床应用的前提。阐明干细胞自我更新、分化的分子
调控机制，其成果将惠及骨髓移植、干细胞治疗、
组织工程研究及肿瘤临床治疗。
研究表明，EGCs 生长环境（又名小生境，niche）
的改变与 EGCs 的自我更新密切相关。体外特定小
生境中，细胞因子、细胞外基质、分化发育相关基
因均参与了 EGCs 自我更新调控［2］。其中细胞外环
境是外因，细胞内相关基因改变是内因，内因是关
键，外因通过内因发挥重要作用。因此，明确干细
胞关键基因在不同培养条件下的表达改变及可能机
制，将为阐明干细胞全能性维持的机制提供理论
基础。
众所周知，表观遗传改变是影响基因表达的重
要方式，其中 DNA 甲基化是表观遗传修饰的主要形
式，并与基因表达水平成反比。来自哺乳动物的研
究结果证明，Oct4 基因对于维持干细胞自我更新能
力具有重要意义，而且其表达水平亦受 DNA 甲基化
状态的调控［3］。但对于禽类而言，Oct4 同源基因刚
刚被证实，对于小生境是否可通过影响 Oct4 基因表
达改变而影响 ES 自我更新能力，及其中可能存在的
表观遗传机制尚一无所知。
本研究旨在在体外构建 EGCs 的 niche 模型，通
过甲基化特异性 PCR（MS-PCR）方法，比较 EGCs
不同培养环境下 Oct4 DNA 甲基化的变化，探讨表观
遗传修饰对胚胎生殖细胞自我更新的影响 , 从而为
EGC 表观遗传机制的分子基础研究提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料
寿光黑鸡 EG-D1 细胞株（滨州医学院生物技术
综合实验室）；EGCs 基础培养基（对照组）为改良
的 Eagle 培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium，
DMEM）添加 10% 的胎牛血清、2% 的鸡血清、2
mmol/L 谷 氨 酰 胺、1 mmol/L 丙 酮 酸 钠、5.5×105
mol/L β-巯基乙醇 ；EGCs 改良培养基（试验组）为
在基础培养基的基础上添加 5 ng/mL hSCF、10 IU/mL
mLIF、10 ng/mL bFGF、10 ng/mL IGF 和 100 IU/mL
硫酸庆大霉素。以鼠胚成纤维细胞作饲养层。0.25%
胰酶消化液（Sigma 公司）。Transwell 共培养系统
（Coning 公司）。基因组 DNA 纯化试剂盒（TaKaRa
公司产品）、CpGenomeTM DNA 修饰试剂盒（Chemicon
公司产品），TRIzol 一步法 RT-PCR 试剂盒（TaKaRa
公司产品）。引物由赛百盛生物有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 不同条件EGCs的培养及鉴定 EGCs以 1.5×
105/cm2 的密度种植，分别加入 CEGs 基础培养基
和改良培养基。24 h 半量换液，48 h 按 1 3 传代。
CEGs 为自鸡胚生殖嵴分离建系所获得的细胞株 , 经
PAS 染色、AKP 染色、体外分化等试验证明其具有
EG 细胞的诸多特性［4, 5］。
1.2.2 DNA 提取及亚硫酸盐处理 用基因组 DNA
纯化试剂盒提取细胞的基因组 DNA。然后取 1 μg
DNA 按照 CpGenomeTM DNA 修饰试剂盒的操作步骤
进行 DNA 亚硫酸盐处理，-20℃保存备用。
1.2.3 甲基化特异性PCR （MS-PCR） 亚硫酸盐处理
后的 DNA 序列中甲基化的胞嘧啶维持不变，而未甲
基化的胞嘧啶则转化为尿嘧啶，在PCR反应过程中尿
嘧啶能被脱氧胸腺嘧啶所替代。甲基化反应引物
（M-primer）序列，正义链为 5-CGTTTTATTTCGGTT-
TTGTTTTC-3， 反义链为 5-CTCGAAATTTAATAAA-
AACTTCACG-3，产物大小为 275 bp；非甲基化引物
（U-primer），正义链为 5-TTGTTTTATTTTGGTTTTG-
TTTTTG-3，反义链为 5-CCTCAAAATTTAATAAAA-
ACTTCACAC-3，产物大小为 275 bp。每份标本同时
进行甲基化引物扩增和非甲基化引物扩增。PCR 扩
增程序 ：94℃预变性 10 min ；94℃变性 45 s，58℃
退火 45 s，72℃延伸 45 s，共 35 个循环 ；72℃延伸
7 min。扩增产物在含溴化乙锭的 20 g/L 琼脂糖凝胶
上电泳，紫外检测仪下观察。应用 M-primer 出现扩
增产物者表明存在 DNA 甲基化，应用 U-primer 出现
扩增产物者即为不存在 DNA 甲基化。
1.2.4 RT-PCR检测Oct4基因mRNA 用TRIzol一步
法提取以上细胞总 RNA。取 2 μg RNA 逆转录合成
cDNA 后，进行 PCR 扩增。应用 Oligo 软件设计 Oct4
mRNA 引物：正义链为 5-TGTAAATGGCTTAAAGGA-
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期120
TTGC-3，反义链为5-CCACGTCAGCCTGAGTGAA-3，
产物大小为 283 bp。PCR 扩增程序 ：94℃预变性
5 min；94℃变性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，
共 30 个循环 ；72℃延伸 7 min。同时以看家基因
GAPDH 为内对照进行质控和标化，引物序列 ：正
义链为 5-TGGCAAAGTCCAAGTGGT-3，反义链为
5-CGCTCCTGGAAGATAGTGAT-3，产物大小为 163
bp。扩增产物在含溴化乙锭的 20 g/L 琼脂糖凝胶上
电泳分离，紫外检测仪下观察。
1.2.5 统计分析 试验中利用 SPSS 统计软件（SPSS）
的 ANOVA 模块分析。数据先经 LSD 转换后进行单
因素方差分析，P < 0.05 为差异显著，评判某种条
件优劣的标准为 EGCs 平均克隆数的多少。
2 结果
2. 1 不同培养条件对EGCs生长状态的影响
研究（表 1）表明，基础培养基和改良培养基
对 EGCs 的培养效果影响显著（P<0.05）。
表 1 不同培养条件对鸡 EGCs克隆的影响 *
基础培养基 改良培养基
原代 EGCs 平均克隆数 9.2±2.4a 51.4±7.8b
第 4 代 EGCs 平均克隆数 4.3±1.5a 53.1±6.5b
第 9 代 EGCs 平均克隆数 1.3±0.3a 52.9±5.7b
* 共做 3 次重复试验，每次接种 16 个孔，a, b 表示两组间差异显著（P < 0.05）
2.2 MS-PCR及琼脂糖凝胶电泳结果
对照组和试验组（添加了 β-巯基乙醇和 mLIF
因子）培养方案，均用 Oct4 甲基化引物（M）和非
甲基化引物（U）对亚硫酸盐处理过的 DNA 进行
MS-PCR 扩增。经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳（图 1）显示，
试验组改良培养方案中扩增出全能性相关基因 Oct4
图 1 MS-PCR扩增 Oct4基因结果
M. 1 kb Marker ；m 为甲基化 DNA 条带，275 bp ；u 为非甲基化 DNA 条带，
275 bp；1，2，3 组分别为试验组（改良培养）EGCs 细胞传代后第 2 代，第 4 代，
第 6 代检测结果 ；4，5，6 组分别为对照组（基础培养）EGCs 细胞传代后
第 2 代，第 4 代，第 6 代检测结果 ；Pos 为阳性对照
的非甲基化 DNA 条带，未见甲基化 DNA 条带 ；而
对照组扩增出的是甲基化 DNA 条带。
2.3 RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳结果
对照组与试验组两种培养方案中，特异性基因
引物对提取的 RNA 进行 RT-PCR 扩增。经 1.0 %琼
脂糖凝胶电泳（图 2）显示，试验组改良培养方案
中 EGC 自我更新关键基因 Oct4 表达水平上调，对
照组表达则较低。
M. 1 kb Marker；Oct4 为 283 bp； GAPDH 为内参照，163 bp；1-3 为试验组（改
良培养） EGCs细胞传代后第2代，第4代，第6代检测结果；4-6为对照组 （基
础培养）EGCs 细胞传代后第 2 代，第 4 代，第 6 代检测结果
图 2 RT-PCR扩增 Oct4及 GAPDH结果
3 讨论
同源异型域蛋白 Oct4 基因是转录因子 POU 家
族的成员，是维持 ES 细胞多能性最主要的内源
性调节因子。POU 家族转录因子都有一个保守的
DNA 结合结构域—POU 结合域，因最先在转录因子
Pit-1，Oct1 和 Unc-86 中发现而得名［6］。根据 POU
结构域的同源性和连接肽的长度，POU 转录因子家
族被分为 7 个亚族，Oct4 属于第 V 亚族，因此又名
PouV［7］。Oct4 转录因子可与含八聚体模体（octamer
motif）的 DNA 结合，其辨认结合的保守序列为
ATGCAAAT，进而调节下游基因的转录。在体外，
Oct4 基因只在未分化的 ES 细胞和 EG 细胞中表达，
当这些细胞被诱导向体细胞分化时，Oct4 表达下降，
提示 Oct4 在维持细胞的全能性及未分化状态中起重
要的作用［8］。
研究证明，Oct4 基因的时空表达主要通过起始
位点上游的启动子、近端增强子（PE）和远端增强
子（DE）三个调控元件的相互作用进行调控，这些
调控元件在人、小鼠、牛等不同物种间具有很高的
同源性（66%-94%），说明 Oct4 的调控在不同物种
p1
2012年第4期 121王娟等 ：不同培养条件对鸡胚胎生殖细胞 Oct4 启动子 DNA 甲基化的影响
具有保守性。在由干细胞与成纤维细胞融合形成的
杂交细胞中，Oct4 活性消失，而且 Oct4 启动子 / 增
强子区域如 PE 和 DE 伴有明显的甲基化改变［9］。用
DNA 甲基化抑制剂（5’-aza）处理体外培养的小鼠
滋养层细胞，可以诱导滋养层细胞表达 Oct4 mRNA。
进一步的试验发现，在胚胎干细胞 Oct4 的启动子和
增强子中，DNA 的甲基化明显高于滋养层细胞［10］。
Oct4 基因的甲基化同样与细胞分化有关，RA 诱导
人 NT2 细胞分化为神经细胞的过程中，伴随着 Oct4
基因 5序列的甲基化和基因表达永久性下调［11］。
小生境（niche）是干细胞最初的生长和（或）
分化因素，部分由细胞外基质组成，部分由细胞自
身产生。其作用是滋养干细胞并保持干细胞的稳定
态，并能产生一系列生长因子或配体，与干细胞相
互作用，调控其更新和分化［12］。研究显示，niche
中的各种基质成分，对干细胞生物学特性的维持极
其重要，干细胞体外分化时所处的特定 niche 如果不
同，可能对干细胞分化影响也不同。研究证实，与
常规培养体系相比，三维培养体系可使小鼠 EGC 间
的黏附和增殖明显加快，向血管内皮细胞分化的效
率也显著增高，流式细胞仪检测 Oct4 的表达上调［13］。
4 结论
本研究以与胚胎干细胞发育全能性密切相关
的转录因子 Oct4 为切入点，首次通过改良小生境
（niche）以探讨其表观遗传效应对胚胎生殖细胞自
我更新的影响。结果显示，试验组中可扩增出全能
性相关基因 Oct4 的非甲基化 DNA 条带，未见甲基
化DNA条带；而对照组扩增出的是甲基化DNA条带。
同时试验组中 EGC 自我更新关键基因 Oct4 表达水
平上调，对照组表达则较低，表明 EGC 小生境可影
响全能性相关基因 Oct4 的甲基化状态，并且其 DNA
甲基化程度与 Oct4 表达水平呈负相关。
参 考 文 献
［1］ Passier R, van Laake LW, Mummery CL. Stem-cell-based therapy
and lessons from the heart. Nature, 2008, 453: 322-329.
［2］ Postovit LM, Seftor EA, Seftor RE, et al. A three-dimension model
to study the epigenetic effects induced by the microenvironment of
human embryonic stem cells. Stem Cells, 2006, 24（3）: 501-505.
［3］ Soodeen-Karamath S, Gibbins AM. Apparent absence of oct 3/4 from
the chicken genome. Mol Reprod Dev, 2001, 58（2）: 137-148.
［4］ 王娟 , 杜立新 . 影响鸡原始生殖细胞分离克隆因素的研究 . 实
验生物学报 , 2004, 37（3）: 247-250.
［5］ 王娟 , 杨娜娜 , 杜立新 . 从原始生殖细胞分离克隆鸡胚胎生殖
细胞的研究 . 中国生物工程杂志 , 2004, 2（9）: 69-73.
［6］ Herr W, Sturm RA, Clerc RG, et al. The POU domain: a large con-
served region in the mammalian pit-1, oct-1, oct-2, and Caenorhab-
ditis elegans unc-86 gene products. Genes Dev, 1988, 2: 1513-1516.
［7］ Yeom YI, Fuhrmann G, Ovitt CE, et al. Germline regulatory
element of Oct4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells.
Development, 1996, 122: 881-894.
［8］ Zhao XY, Li W, Lü Z, et al. iPS cells produce viable mice through
tetraploid complementation. Nature, 2009, 461: 86-90.
［9］ Ben-Shushan E, Pikarsky E, Klar A, Bergman Y. Extinction of
Oct-3/4 gene expression in embryonal carcinoma×fibroblast somatic
cell hybrids is accompanied by changes in the methylation status,
chromatin structure, and transcriptional activity of the Oct-3/4
upstream region. Mol Cell Biol, 1993, 13（2）: 891-901.
［10］ Hattori N, Nishino K, Ko YG, et al. Epigenetic control of mouse
Oct-4 gene expression in embryonic stem cells and trophoblast stem
cells. J Biol Chem, 2004, 279: 17063-17069.
［11］ Deb-Rinker P, Ly D, Jezierski A, et al. Sequential DNA methylation
of the Nanog and Oct-4 upstream regions in human NT2 cells during
neuronal differentiation. J Biol Chem, 2005, 280: 6257-6260.
［12］ Jung JG, Lee YM, Park TS, et al. Identification, culture, and charac-
terization of germline stem cell-like cells in chicken testes. Biol Re-
prod, 2007, 76（1）: 173-182.
［13］ Scadden DT. The stem-cell niche as an entity of action. Nature,
2006, 441: 1075-1079.
（责任编辑 马鑫）