全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2008年第 6期
收稿日期：2008-04-21
基金项目：2006 年国家自然科学基金（30671539）
作者简介：张艳艳（1978-），女，博士研究生，主要研究方向：家畜生殖内分泌学；Tel：010-62896062，E-mail：kaixuanhao@yahoo.com.cn
通讯作者：关伟军，Tel：010-62815992，E-mail：wjguan86@126.com；马月辉，Tel：010-62813463，E-mail：yuehui.ma@263.net
禽类具有特殊的胚胎发育过程和生殖生理特
点，如鸡的世代周期短，生产性能高，卵生 ，从囊胚
期开始其胚胎发育都在母体外进行。 因此，方便进
行多种操作，如直接将外源基因显微注射入受精卵
原核中，制作嵌合体鸡或生产转基因鸡。但是，一般
认为生产转基因动物的最好时期是在单细胞受精
卵阶段， 而刚产下的鸡蛋已经是由 50 000~60 000
个细胞组成的胚胎了。 因此，对于不易获得单细胞
受精卵的禽类来说， 借助胚胎干细胞的技术平台，
在禽类胚胎发育研究、保种育种、提高生产性能及
抗病能力等多方面具有重大的应用价值。
此外，与 ICM 相比，PGCs 的数量大，取材方便。
研究表明， 小鼠胚胎在 8.5 d 时，PGCs 的数目约为
145 个 ；9.5d 时细胞增至 364 个 ；10.5d，PGCs 为 1
012 个；11.5d，PGCs 为 2 999 个；至 13.5 d 时 ，细胞
数可达 26 791 个 [1]。 鸡胚孵化在 16~23 期，PGCs 的
数目估计约有 150（16 期）~1 000 个（23 期），24~29
期 （孵化 3~5d）， 鸡胚胎中 PGCs 的数目为 329（24
期）~359（29 期）[2]。因此，对胚胎来源困难的濒危动
物及难于获得附植前早期胚胎的人类和禽类来说，
禽类胚胎生殖细胞的研究
张艳艳 1，2 王颖 1，3 陈莉娜 1 李林凤 1，4 靳亚平 2 关伟军 1 马月辉 1
（1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100094；2西北农林科技大学动物医学院，杨凌 712100；3浙江大学动物科学学院，
杭州 310029；4东北农业大学动物科技学院，哈尔滨 150030）
摘 要： 胚胎干细胞有2种来源：一种来自于早期胚胎囊胚期内细胞团（inner cell mass，ICM）的胚胎干细胞
（embryonic stem cells，ES细胞），另一种是来自胚胎生殖腺原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）的胚胎生殖细胞
（embryonic germ cells，EG细胞）。PGCs是生殖母细胞的前体细胞，是精子或卵子的祖先细胞。自Matsui等证实了PGCs
同样可以作为胚胎干细胞的原材料之后，现已在人、小鼠、猪和鸡等多种动物的PGCs进行了分离培养并获得了EG细
胞。现从形态特征和迁移、分离培养及鉴定方面对禽类EG细胞的研究进展作一综述。
关键词： 禽 胚胎生殖细胞 形态 分离培养 鉴定
Researches on Avian Embryonic Germ Cells
Zhang Yanyan1，2 Wang Ying1，3 Chen Lina1 Li Linfeng1，4 Jin Yaping2
Guan Weijun1 Ma Yuehui1
（1Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100094；2College of Animal Medicine，
Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry，Yangling 712100；3College of Animal Science，Zhejiang
University，Hangzhou 310029；4College of Animal Science and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）
Abstract： There are two kinds of embryonic stem cells. One is embryonic stem cell（ESC）from inner cell mass
（ICM）of forepart embryo，and the other is embryonic germ cell（EGC）from primordial germ cells（PGCs）of embryonic
gonad. PGCs are precursor cells of primordial germ cell and antecedent cells of sperm and ovum. In 1992，PGCs were
isolated firstly from mouse post-implantation embryo，which was also approved as material of embryonic stem cells. Many
animals PGCs，from human，mouse，pig and chicken，have been isolated and cultured and attained EGC. In this paper，
kesearches on avian EGC cell morphology and migration，isolation，culture and identification，were analyzed and
summarized.
Key words： Avian Embryonic germ cells Cell morphology Isolation and culture Identification
2008年第 6期
利用 PGCs 来分离克隆 EG 细胞具有重要的现实意
义。
1 禽类 PGCs的形态特征和迁移
1.1 PGCs 的形态特征
禽类的 PGCs 体积较大， 能与体细胞明显的区
分开 ，呈圆形或卵圆形，直径约为 15~25μm。 细胞
核偏于细胞的一端， 直径约为 8~10μm， 细胞核内
缘有少量的异染色质，常染色质则均匀分布。 PGCs
有 1~2 个核仁，电镜观察表明核仁为电子致密块状
结构。 PGCs 的细胞质中含有大量的糖原颗粒沉积，
而体细胞中糖原相对较少，并且随着其由生殖新月
区向生殖原基的迁移，所含的糖原颗粒数量逐渐减
少，说明 PGCs 在迁移过程中是消耗能量的 [3]。 由于
糖原的存在 ，PGCs 能被组化的高碘酸希夫氏染色
剂染成红色而与周围的体细胞区分开来，而且在胚
胎发育中可以迅速有效地辨别出 PGCs 的位置 [4]。
1.2 PGCs 的迁移
现有的研究认为，禽类的原始生殖细胞起源于
上胚层， 在孵化的第 4 期出现在明区的下胚层中，
即生殖新月区，在孵化的 10~12 期，PGCs 出现在血
液中，之后通过血液循环到达生殖嵴部位 ，并在此
处定居、增殖 ，到孵化的第 30 期开始分化 ，即形成
生殖细胞。 因此，根据 PGCs 的起源、迁移及定居规
律，可以从生殖新月区 、血液和原始生殖腺中提取
PGCs，进行体外培养 、遗传操作和干细胞建系等研
究 [5]。
PGCs 从生殖新月区向生殖嵴原基的迁移过
程，可分为分离期、迁移期和安置期 3 个阶段。
1.2.1 PGCs 的分离期（胚胎发育的第 4~8 期） 生
殖新月区的 PGCs，位于上胚层和下胚层之间。 当中
胚层出现时， 即进入中胚层并构成中胚层的一部
分。 PGCs 一般与下胚层细胞保持细胞连接，第 4~7
期，PGCs 开始与胚层细胞分离，第 8 期完成分离过
程 [6]。
1.2.2 PGCs 的迁移期（第 10 期至孵化第 2d） 从
第 10 期开始 ，PGCs 完全进入中胚层形成的血管
中。 血液循环从第 12 期开始，进入血管中的 PGCs
称循环 PGCs；还有一些 PGCs 不进入血管而留在中
胚层组织中，它们具有伪足，做变形虫运动迁移到
间充质组织中，这类 PGCs 称为组织 PGCs。 在发育
第 12 期的胚胎中， 除性腺外，PGCs 还存在于头部
等器官中 [3，5]。
1.2.3 PGCs 的安置期 血液中的 PGCs 随血液循
环到达性腺部位， 穿过血管进入到性腺原基中，此
时性腺由增厚的中胚层和 PGCs 组成 。 PGCs 于第
17 期（孵化 62h）大量迁移至胚体后端的生殖嵴处，
迁移过程一直持续到孵化的第 4d。到孵化的第 5d，
PGCs 在性腺中的分布呈现 2 种情况 ：（1）PGCs 排
列在性腺靠近远侧部， 即生殖上皮中；（2）PGCs 在
性腺中，集中靠近侧部排列，这种情况可能是雌雄
性腺开始分化的标志 [5]。
2 PGCs的分离与培养
原始生殖细胞在饲养层细胞和多种生长因子
的共同作用下，可发展为长期增殖并维持不分化状
态的胚胎性干细胞，即 EG 细胞。 EG 细胞的许多特
性与 ES 细胞类似，包括形态、多能性以及囊胚注射
后形成嵌合体的能力等。
2.1 PGCs 的分离
通常在以下 3 个阶段进行 PGCs 的分离： 一是
从 5 期胚的生殖新月区提取；二是从 10~13 期胚的
血液中提取；三是从生殖腺中提取。据研究，生殖新
月区以 10 期胚的 PGCs 含量最高， 为 150~250 个。
但由于难以避免的上下胚层以及卵黄的污染，使该
阶段 PGCs 的分离纯化非常困难 [7]。 目前也有不少
以密度梯度离心法从鸡胚血液中提取纯化 PGCs 的
报道，但所提取的数量较少。 而鸡胚原始生殖腺中
PGCs 相对集中， 且已大量增殖， 是进行体外分离
PGCs 的很好来源。李碧春等 [8]比较了 3 个发育时期
鸡 PGCs 在体内聚集情况， 结果表明鸡胚孵化的第
19 期，PGCs 大量聚集在肢体后端的生殖峭原基处，
较容易收集，具有较强的可操作性。在分离方法上，
酶解离法与 Ficoll 密度梯度离心法相比，所获得的
PGCs 的相对数量较多，存活时间也较长 [9]。
2.2 PGCs 的培养
体外培养 PGCs， 刺激其在体外生长并传代来
获得大量可用的 PGCs， 为制备嵌合体及转基因鸡
的研究提供基础。 ES 细胞培养过程中的关键是维
持 ES 细胞的未分化状态。 胚胎及机体发育过程中
分化和分裂增殖一般同时进行， 而 ES 细胞的建系
要求 ES 细胞既能快速无限增殖又能呈未分化状
张艳艳等：禽类胚胎生殖细胞的研究 41
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
态，因此必须筛选适宜的培养体系。
2.2.1 饲养层细胞 胚胎干细胞培养过程中的关
键技术是维持其未分化状态，饲养层细胞在其中起
了重要作用。饲养层细胞是一些细胞（如颗粒细胞、
成纤维细胞等易在体外培养的细胞）经有丝分裂剂
（如丝裂霉素-c）处理后得到的细胞单层，能促进胚
胎干细胞的生长增殖并抑制其分化。现在常用的饲
养层细胞有小鼠胚胎成纤维细胞株（STO）、小鼠胚
胎原代成纤维细胞（PMEF）以及同源动物胚胎成纤
维细胞等。
Matsui 等 [10]研究发现，同源同龄胎儿成纤维细
胞所模拟的体外培养条件与 PGCs 细胞在体内生长
的环境最为接近， 更有利于 ES 细胞的生长， 促进
PGCs 的增殖及保持未分化核型。 刘永刚等 [11]研究
认为，以 hELF（人胚胎肺成纤维细胞 ）作为饲养层
来培养 hEG 比 STO 饲养层更具优势。 王娟等 [12]认
为在鸡 PGCs 原代培养不宜使用饲养层， 适于与性
腺基质细胞共培养，这说明不加任何饲养层而保持
细胞生长的原始环境更适合原代 PGCs 的生长。 传
代培养的类 EG 细胞则需要使用饲养层。
由于丝裂霉素的处理，胚胎原代成纤维细胞存
活时间较短，一般 4~6d，死亡的成纤维细胞可能释
放一些 DNA 片段或溶酶体的酶从而影响 ES 的生
长及二倍体的维持，并且随着传代次数的增加其分
泌 LIF 的能力逐渐下降，因此一般选用 3~6 代的细
胞制作饲养层。
2.2.2 培养基与条件培养基 目前 ，ES 细胞的培
养多用 DMEM （Dulbeccos Modified Eagle Medium，
DMEM）培养基。 DMEM 最早是为肿瘤细胞的培养
而设计的， 适用于生长速度快和贴壁性差的细胞，
而 ES 细胞体外的生长特性与肿瘤细胞有许多相似
之处。 DMEM 又分为高糖和低糖 2 种类型，早期胚
胎的培养对能量的要求很高 ， 一般选用高糖
DMEM， 而 ES 细胞的传代培养中对葡萄糖含量的
要求则相对较低。 除 DMEM 外还有 TC-199 或 F-12
培养基，可与 DMEM 联合使用。
由于饲养层细胞要用丝裂霉素-C 处理， 若丝
裂霉素-C 清洗不净会对 ES 细胞产生毒害作用，且
饲养层细胞死亡时释放的细胞碎片和废物也会影
响 ES 细胞的生长， 不易获得纯的 ES 细胞进行遗
传操作。 为排除这种影响，研究者利用能合成和分
泌 LIF 的 细 胞 制 作 了 条 件 培 养 基 （Conditioned
Media，CM）。 如用 Buffalo 大鼠肝细胞（BRL）和人膀
胱癌细胞系 5637 制作的条件培养基、 用大鼠心脏
细胞制作的条件培养基。 但 CM 只能在短期传代中
维持 ES 细胞全能性及核型正常。
2.2.3 细胞因子及各种添加物 虽然饲养层细胞
可分泌一些促生长因子和分化抑制因子， 对 ES 细
胞的生长有一定作用， 但其分泌的量要维持 ES 细
胞的无限增殖及抑制其分化的状态是远远不够的，
必须另外添加许多细胞生长因子。从 1992 年开始，
己陆续发现一些维持 PGCs 体外存活、 增殖及保持
发育全能性和未分化状态的必需生长因子，主要有
白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、干
细胞生长因子（stem cell factor，SCF）、成纤维细胞生
长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等。 研究
表明， 细胞因子对于鸡 PGCs 的增殖及保持未分化
状态是必需的 [13]。 而秦洁等 [14]认为生长因子联合使
用则更能促进鸡 PGCs 的增殖。
除以上细胞因子之外 ，ES 培养基中还需添加
其他的成分，常用的包括谷氨酰胺、丙酮酸钠、β-巯
基乙醇、非必需氨基酸和硒酸钠等。
3 PGCs的鉴定
3.1 PGCs 的形态学鉴定
PGCs 较体细胞体积大，直径约为 15~25μm，细
胞核为圆形，位置稍偏离中央，细胞核内缘有少量
的异染色质 ， 常染色质则均匀分布 ，PGCs 通常有
1~2 个核仁。 不同发育时期其形态、大小及内容物
略有不同。 当 PGCs 处于生殖新月区时， 细胞呈圆
形或卵圆形，直径约为 12~20μm，细胞内含有大量
的卵黄颗粒、核糖体和线粒体。 随着 PGCs 的发育，
卵黄和脂滴减少，糖原增加，当 PGCs 在迁移时，糖
原再次下降，到达生殖嵴时，糖原含量大量减少，定
居在性腺后，糖原大量崩解。
体外培养时，鸡胚胎生殖细胞的形态与其它动
物略有不同，几乎所有的克隆都均匀围绕但不贴附
于饲养层细胞上，细胞排列并不紧凑成巢状，且其
核比其它动物明显。
3.2 过碘酸希夫氏 （periodic acid-schiff，PAS）特
异性染色检测
42
2008年第 6期
由于 PGCs 的细胞质中含有大量的糖元颗粒 ，
容易发生 PAS 染色反应， 在光学显微镜下很容易
识别。其染色特征是，细胞核不着色，而细胞质呈碱
性品红色。
3.3 碱性磷酸酶 （alkaline phosphatase，AKP）活性
检测
AKP 的存在是检测干细胞是否保持末分化状
态的一个重要指标。 在早期胚胎及 ES 细胞中 AKP
活性很高，而在己分化的 ES 细胞中活性明显下降，
活性检测呈弱阳性或阴性。 大多数哺乳动物 ES 细
胞均表达较高的 AKP 活性， 而且表达端粒酶活性
较高。 其染色特征为： 未分化的 PGCs 呈红色或淡
紫色，已分化的 PGCs 及饲养层呈黄色或不着色。
3.4 核型分析
PGCs 具有正常的二倍体核型，这是进行 PGCs
体外操作的一个重要前提条件。 如 PGCs 在体外培
养或其他操作过程中失去了二倍体特征 ，PGCs 的
特性也将改变。 所以，需要经常鉴定所培养的 PGCs
细胞的核型，以确定其是否发生了染色体畸变。
3.5 时期专一性胚胎表面抗原（SSEA-1）的检测
SSEA-1 是一个细胞糖类抗原 ， 它与细胞的粘
附、细胞的迁移和细胞的分化相关联，是处于未分
化状态的 PGCs 的胚胎阶段特异性细胞表面抗原，
可被一些特异性抗体识别。 SSEA-1 检测是一种间
接免疫荧光法，根据细胞有无出现荧光来判断是否
是 PGCs。
3.6 体内分化试验
把 PGCs 按一定浓度 （一般为 106~107 个/mL）
注射到裸鼠（即免疫缺陷鼠）的皮下或睾丸胞膜下
看是否能形成组织瘤。然后通过常规方法制作组织
切片， 染色并观察其最终分化结果， 以了解 PGCs
的未分化状态和多能性。形成的组织瘤通常来源于
肠上皮、软骨和骨、神经上皮、平滑肌、横纹肌和腺
状上皮等胚层组织。
3.7 体外分化试验
PGCs 在无饲养层无分化抑制物的条件下培
养，能自发分化为纤维样细胞、神经元细胞、自律细
胞等多种细胞类型。 悬浮培养条件下，PGCs 还能形
成类胚体 （embryoid bodies，EB），EB 中也含有来自
3 个胚层的细胞，但种类没有组织瘤的多。 也可在
培养液中人工添加相应的分化诱导因子，使其向特
定的方向分化。这是体外鉴定胚胎干细胞分化能力
的常用方法。
3.8 嵌合体试验
能否参与胚胎发育并最终形成包括生殖系在
内的嵌合体是衡量胚胎干细胞全能性的另一个重
要指标。 将胚胎干细胞注入受体胚胎，如果该细胞
具有全能性就会得到嵌合体动物。嵌合体动物可以
通过皮毛颜色、蛋白质、DNA 指纹和同工酶等方法
进行检测。
4 EG细胞的应用前景
自 1981 年 Evans 和 Kaufman 建立小鼠 ES 细胞
系以来 ，ES 细胞在医学乃至整个生命科学中显示
出了巨大的发展潜力和应用价值，极大地推动了科
学和生产的发展。EG 细胞具有与 ES 细胞相似的分
化潜能和正常的二倍体核型 ， 可应用于发育生物
学、遗传学等方面，为研究生殖细胞发育分化和成
熟的调节机制提供丰富的材料。并且可在体外诱导
分化为多种细胞类型， 可以作为细胞替代疗法、组
织器官移植及胚系分化模型的良好试验材料。 EG
细胞也具有多能性， 定向整合和较高的嵌合能力，
因此是转基因的高效载体，并使外源基因整合表达
的筛选工作由个体水平上升到了细胞水平，可借助
基因打靶和转基因技术进行畜禽改良及生物反应
器的开发研制。因此，EG 细胞的研究有着重要的应
用价值和广阔的利用前景。
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中后仍然具有转录和表达活性 [15]。 除了这个转座子
外， 在 Trichoplusia ni 细胞中还发现了 II 类的转座
子 [16]，该转座子整合在 CpGV 基因组的非编码区 ，
转座子特征性的整合在 TA 双核昔酸位点。 另外在
CPGV 中还发现了一个转座子 TCp3.2，该转座子中
也发现了一个与 Tel/mariner 超基因家族 Tel 类转
座子具有同源性的转座子基因，但该转座子具有一
个长约 750bp 的反向重复末端序列，研究表明该转
座子能够在宿主基因组与病毒间进行水平转移 [17]。
这些表明转座子可能是导致杆状病毒与宿主及其
它共生微生物间发生基因转移的一种途径，在杆状
病毒的进化历程中可能发挥了重要的作用。
2.3 与宿主共进化
迄今为止，关于杆状病毒与昆虫共进化的研究
极少。 宿主和病原体之间的共进化的一个例子是
T. ni 幼虫对 TnSNPV 有抗性的进化 [18]。 另一个例子
是在果园中用 C. pomonella granulovirus （CpGV）进
行生物防治时， 发现由于 C. pomonella 产生了抗性
而使得 CpG 杀虫效果下降 [19]，而且抗性与雌雄性别
有关，这些结果对于杆状病毒杀虫剂的应用具有重
要的意义 [20]，
3 展望
在杆状病毒进化史中，存在着普遍性的基因组
重排、基因获得及缺失。 随着越来越多的杆状病毒
基因组全序列的测定和计算机辅助分析成为可能，
比较杆状病毒基因组内容及各基因在基因组中顺
序和位置的研究成为可能，将基因序列、基因内容
及基因排列的比较结合起来，能够更清楚地阐明杆
状病毒的系统进化关系，这对进一步研究杆状病毒
生物学、杆状病毒与宿主相互作用的分子机理及病
毒基因的表达调控是十分必要的。
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唐平等：杆状病毒进化研究进展 51