全 文 ：·特约综述· 2015, 31(4):82-91
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ： 2015-02-11
基金项目 ：“973”重大科学问题导向项目（2011CBA01006），国家自然科学基金项目（31371457）
作者简介 ：薛冰华，女，博士研究生，研究方向 ：多能性干细胞 ；E-mail ：xuebinghua123@126.com
通讯作者 ：刘忠华，男，博士，教授，研究方向 ：发育生物学 ；E-mail ：liu86@126.com
干细胞是一类能够自我更新，功能还未特化的
细胞群，在特定的条件下，该类细胞可以分化为执
行机体特殊功能的效应细胞，它们广泛存在于机体
生长发育过程中的多数组织和器官中。这些特性使
得干细胞被广泛应用于临床疾病治疗中，它可以为
细胞治疗和再生医学提供种子细胞 ；其次，由于药
物筛选和安全检验不能直接以人为试验对象，所以
干细胞也是药物研究的理想模型 ；最后，干细胞也
在基础研究、物种繁育等方面有着独特的应用前景
和优越性。然而，由于伦理道德、免疫排斥和生物
安全性等问题，人的干细胞无法直接应用于临床治
疗，这就要求科研工作者必需寻找合适的动物来代
替人进行临床前研究。
猪在免疫学、形态学和生理结构上与人有着诸
多类似的特点，饲养和繁殖也较为简单，因此被作
为动物疾病模型广泛地应用于人类疾病的临床研究
中。同时，猪作为大型家畜在畜牧业生产上有着举
足轻重的地位，这都使得猪的干细胞、特别是多能
干细胞的建立尤为重要。然而，由于诸多因素的限
制，猪多能性干细胞的建立虽然取得了较大的进展，
猪多能性干细胞研究进展与前瞻
薛冰华  刘忠华
（东北农业大学胚胎工程实验室，哈尔滨 150030）
摘 要 ： 多能干细胞具有能够分化为多种特定细胞类型的能力，主要包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞和诱导多能干细胞。
猪因其在免疫学、形态学和生理结构上与人有着诸多类似的特点，正逐渐成为人类异种移植、细胞治疗和再生医学研究的理想生
物学模型。然而，目前对猪多能干细胞的来源、特征及机制认识的不足直接阻碍了该研究领域的发展。因此，将对猪多能性干细
胞的种类、鉴定标准、研究进展、亟待解决的问题进行详细地阐述，并在此基础上对猪多能性干细胞的研究进行了展望，希望为
该研究领域的科研人员提供参考。
关键词 ： 猪 ；多能干细胞 ；胚胎干细胞 ；诱导多能干细胞 ；胚胎生殖细胞
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.009
Porcine Pluripotent Stem Cells ：Facts，Challenges and Hopes
Xue Binghua Liu Zhonghua
（Lab of Embryo Biotechnology，Northeast Agriculture University，Harbin 150030）
Abstract: Pluripotent stem cells, including embryonic stem cells, embryonic germ cells and induced pluripotent stem cells, have the
ability to differentiate into a variety of specific cell lines. Swine is considered as a kind of ideal model for pre-clinical development of human
xenotransplantation, therapeutic approaches and regenerative medicine due to its morphological and functional affinity with man. However, a
number of open questions need to be addressed since we know little about the sorting, derivation, characterization and mechanisms of porcine
pluripotent stem cells. In this review, we elaborated the latest progresses on the derivation of porcine pluripotent stem cells, the evaluation criteria
of stemness, scientific and technique questions encountere, and we also provide our perspectives on the future study ofporcine pluripotentstem
cells research, in the hope of sharing experimence of exploring this field with other researchers.
Key words: swine ；pluripotent stem cells ；embryonic stem cells ；induced pluripotent stem cells ；embryonic germ cells
2015,31(4) 83薛冰华等：猪多能性干细胞研究进展与前瞻
但仍然面临着建系难度大、成功率较低、多能性较
差和分化能力弱等诸多问题，很多技术和理论问题
也仍需要进一步探索，如猪多能性干细胞最适的培
养体系、维持多能性的调控机制以及影响其获得核
移植和嵌合体动物的机理等。因此，本文将对猪多
能性干细胞的分类、鉴定标准、研究进展、目前存
在的问题及可能的解决办法进行详细论述。
1 多能性干细胞的定义和分类
来源于不同发育阶段和不同组织器官的干细胞
在基因表达调控、表观遗传状态、体外增殖和分化
潜能等方面都存在较大的差异。根据干细胞增殖能
力和分化潜能的不同，可以把干细胞分为全能干细
胞、多能干细胞和专能干细胞。全能干细胞是指除
了能够发育出构成机体的 3 个胚层的各类细胞外，
还能发育出支持胎儿在母体存在所必需的胎盘组织
和脐带，最原始的全能干细胞就是哺乳动物精子和
卵子结合后形成的受精卵，它在前几个分裂过程中
产生的卵裂球均为全能干细胞，提取这些卵裂球中
的任意一个移植到子宫，均可发育出一个完整的生
命体。多能干细胞是指能够无限增殖且具有分化潜
能的一类干细胞，它能够产生内胚层、中胚层和外
胚层来源的各种类型细胞，多能干细胞主要包括来
源于囊胚内细胞团的胚胎干细胞、来源于原始生殖
细胞的胚胎生殖细胞、来源于畸胎癌的胚胎肿瘤细
胞和体外重编程得到的诱导多能性干细胞。专能干
细胞是指只能分化为一种或密切相关的几种类型的
细胞的干细胞，主要包括造血干细胞、骨髓间充质
干细胞和表皮干细胞在内的各类成体干细胞［1］。
胚胎干细胞、胚胎生殖细胞和诱导多能性干细
胞这三种干细胞在生物学特性、免疫学、多能性和
发育潜能等方面拥有相似的特征，均具有形成生殖
系嵌合体的能力，这使得多能性干细胞在基础研究
领域（包括基因功能研究、细胞分化和机体发育机
制的研究等）、临床治疗（包括药物研发和再生医学
领域的研究等）和动物生产方面（包括核移植、嵌
合体和转基因动物的生产与研究等）具有独特的应
用前景和优越性。因此，后文将重点论述这三种多
能性干细胞在猪中的研究现状。
胚 胎 干 细 胞（Embryonic stem cells，ESCs） 最
早是在 1981 年由 Evans［2］和 Martin［3］两家实验室
首次从植入前的小鼠囊胚内细胞团中分离培养获得，
其后对其它物种相继建立了 ESCs。Thomson 等［4，5］
在 1995 年和 1998 年分别建立了第一株非人灵长类
的 ESCs 和人的 ESCs，所获得的 ESCs 可在免疫缺
陷鼠体内形成畸胎瘤。Li 等［6-8］三家实验室在 2008
年同时宣布他们通过使用大鼠源的 Lif（Leukemia
inhibitory factor）、添加小分子抑制 GSK3 和 MEK 途
径以及使用一种来源于成年大鼠皮下连接组织的 L
细胞系作为饲养层可高效而稳定的得到大鼠 ESCs。
在各物种 ESCs 建立的同时，胚胎生殖细胞和诱导多
能性干细胞也随着 ESCs 培养条件的成熟逐渐被建立
起来。胚胎生殖细胞（Embryonic germ cells，EGCs）
最早是在 1992 年由 Resnick 等［9］和 Matsui 等［10］通
过体外培养小鼠的原始生殖细胞（Primordial germ
cells，PGCs）分离得到的，该细胞系有着与小鼠胚
胎干细胞类似的生物学特性，其多能性及生殖系嵌
合能力后被 Stewart 等［11］ 证实。诱导多能性干细
胞（Induced pluripotent stem cells，iPSCs）最早是在
2006 年由 Takahashi 和 Yamanaka［12］首次将 4 个与
多能性相关的基因（Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4）利
用逆转录病毒载体导入到小鼠成纤维细胞中，通过
筛选 Fbx15（多能性标志分子）阳性的细胞最终获
得的具有小鼠胚胎干细胞某些特性的多能性干细胞
系，Yamanaka 将其命名为“诱导性多能干细胞”（图
1）。iPSCs 技术的诞生深化了人们对细胞多能性和
基因组重编程的认知，并且为解决临床治疗引起的
免疫排斥问题和人胚胎干细胞基础研究所面临的伦
理学困境带来了曙光，因此该技术自诞生就引发了
iPSCs 研究的热潮，各实验组迅速围绕 iPSCs 建系过
程中的筛选标记、载体系统、转录因子、源头细胞
类型和促进效率提高的化合物筛选等方面展开广泛
的研究。
2 猪类胚胎干细胞的研究进展
猪 ESCs 建系的研究始于 1990 年，建系过程主
要依赖于小鼠等物种 ESCs 建系的经验，所获得的干
细胞系均无法与小鼠 ESCs 媲美，主要表现是体内形
成畸胎瘤的能力、体外自发或诱导向三胚层分化的
能力以及生殖系嵌合的能力均较弱。因此，猪 ESCs
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.484
多被命名为“猪类胚胎干细胞”（猪类 ESCs）。本文
将从猪类 ESCs 的来源、培养体系和其它影响建系的
因素三方面对猪类 ESCs 研究进展进行阐述（表 1）。
首先，细胞来源方面主要包括以下三部分内
容。第一，关于猪类 ESCs 建系所使用的源头细胞
的种类 ：猪类 ESCs 主要来源于囊胚内细胞团，虽
然 Li 等［13］和 Chen 等［14］分别用 4-8 细胞阶段的胚
胎和桑葚胚作为材料进行建系，但由于胚胎贴壁率
低、原代克隆无法形成等原因均未获得稳定传代的
猪类 ESCs。所以，迄今为止的猪类 ESCs 均来源于
囊胚。第二，关于猪类 ESCs 建系所使用的囊胚的种
类 ：2000 年以前的研究主要使用体内囊胚作为实验
材料，在这之后开始使用体外受精囊胚、孤雌囊胚
和核移植囊胚作为实验材料［15-17］。Miyoshi 等［18］用
体外受精囊胚分离得到上皮样的猪类 ESCs，该细胞
系用做核移植供体细胞后，能支持重构胚发育到囊
胚阶段。Telugu 等［19］和 Haraguchi 等［20］利用 iPSCs
技术和小分子体系成功地从体外受精囊胚中分离得
到能够稳定传代的内细胞团样的猪类 ESCs。Kim
等［21］、Park 等［22］和 Jung 等［23］用孤雌囊胚得到了
类 ESCs。Tan 等［24］用不同天数的核移植胚胎获得
了类 ESCs，但所获得细胞系多能性状态较差。第
三，关于猪类 ESCs 建系所使用的囊胚的时期 ：从猪
囊胚中分离 ESCs 的最佳时期并不确定，前期研究主
要集中在 5.5-9 d，各时期的囊胚均能够分离得到类
ESCs。Chen 等［14］对比了不同发育阶段胚胎的建系
效率，结果表明早期孵化囊胚更适合建系，建系效
率达 21%，这与笔者实验室的研究结果相符（结果
暂未发表）。对此，笔者认为将胚胎按照天数划分不
能够充分反应胚胎的发育状况，各实验室对胚胎天
数的计算也存在差异。这种最佳时间的不确定性是
真正制约猪 ESCs 分离的原因之一，只有对猪胚胎早
期发育时程进行系统地研究和划分，找到最适于多
能性干细胞分离的时期才有可能分离得到真正的猪
ESCs。
其次，培养体系方面。早期研究中使用的培养
体系大多源于小鼠 ESCs 的培养体系，主要成分包括
基础培养液 DMEM、谷氨酰胺、巯基乙醇、非必需
氨基酸、抗生素和胎牛或新生牛血清［25-29］。Moore
等［30，31］在培养体系中添加了 Lif，但其最终研究
结果表明人源 Lif 无法维持猪类 ESCs 的多能性状
态。近期研究中，各实验组不约而同地将 bFGF 添
加到猪 ESCs 培养体系中，Hall 等［32］ 的研究也表
明 bFGF 更利于猪类 ESCs 的分离培养。值得注意的
是，Telugu 等［19］ 和 Haraguchi 等［20］ 利 用 iPSCs 技
术和小分子体系分别建立了猪类 ESCs，所获得的细
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图 1 多能干细胞的起源（以小鼠为例）
2015,31(4) 85薛冰华等：猪多能性干细胞研究进展与前瞻
表 1 猪类胚胎干细胞研究进展
编号 囊胚类型 胎龄 /d 分离方法 培养液重要成分 饲养层 代次 鉴定方式 文献
1 IVF 2-5 全胚 DMEM；bFGF；hLIF；核苷酸；
FBS
MEF P4 形态 ；AP ；囊状 EB ［13］
2 Vivo 6-8
桑葚
全胚
免疫外科
ES 培养液 >P35 AP ；三胚层分化 ；核型 ；有毛色嵌合 ［14］
3 IVF
PA
6 免疫外科 DMEM（低糖）/F10 ；mLIF ；
FCS ；KOSR
STO 未知 Oct4 ；Nanog ；SSEA-4 ；AP ；TRA-1-82
自发分化为神经细胞，EB
［15］
4 Vivo
IVF
8 全胚
免疫外科
DMEM（低糖）/F10 ；FBS ；
SCF ；bFGF ；Lif
STO >56 AP ；Oct4 ；Nanog ；EB ；自发分化 ［16］
5 IVF
PA
6-7 免疫外科 各种培养液 STO >45 形态 ；AP ；Oct4 ；Nanog ；EB ；端粒酶
活性
［17］
6 IVF 7-8 全胚 BLR 条件培养基 ；FCS；核苷
酸 ；LIF ；bFGF
STO
无饲养层
>P30 形态 ；做核移植供体细胞 ；重组胚胎发
育到囊胚
［18］
7 IVF 5.5 免疫外科 DMEM/F12 ；KOSR ；hLif ；
KP+CH
MEF >50 AP ；Oct4 ；Nanog ；Sox2 ；倍增时间 ；
转录谱 ；Western ；分化 ；畸胎瘤 ；
核型
［19］
8 IVF 7 机械法 KO-DMEM ；FBS ；hLif ；
2ME ；FGF ；Y27632 ；PD+CH
MEF >100 AP ；Oct4 ；Nanog ；Sox2 ；表达 Nestin
和 Gata4 ；核型 ；免疫荧光
［20］
9 IVF
NT
7-9 免疫外科 DMEM /F10/NCSU-23 ；hLIF ；
NEAA ；FBS
MEF ；STO
PUE
P5 AP ；EB ；自发分化 ［21］
10 各类 未提 全胚 DMEM（低糖）/F10 ；FBS ；
L-GLU ；SCF ；bFGF ；肝素
MEF >41 AP ；Oct4 ；Nanog ；Sox2 ；SSEA4 ；TRA
1-60 ；TRA 1-81 ；EB 三胚层分化
［22］
11 PA 7 机械法 DMEM（低糖）/F10 ；FBS ；
bFGF ；hLif ；SCF
MEF 未提 AP ；Oct4 ；Nnaog ；SSEA4 ；EB ；畸胎瘤 ；［23］
12 Vivo 7-9 全胚
分离的 ICM
DMEM ；FCS STO >1 年 形态 ；体外向三胚层细胞的分化 ；将转
基因操作后的细胞注射到囊胚中得到转
基因嵌合体
［25］
13 Vivo 7-8 全胚
免疫外科
DMEM ；FBS STO ；PEF
PUEC
>P32 形态 ；囊状 EB ［26］
14 Vivo 9-10 未提及 DMEM ；FCS ；NCS ；
核苷酸 ；胰岛素
PUE ；STO P5 形态 ［27］
15 Vivo 6-10 免疫外科 DMEM ；FBS STO >P10 形态 ；囊胚注射 ；未拿到嵌合猪 ［29］
16 Vivo 7 免疫外科 DMEM（高 / 低糖）/F10 ；
FBS ；hLif ；其他造血因子
明胶 4 d AP ；检测 CK8.13 表达情况 ；电镜下观
察超微结构
［30，
31］
17 Vivo 5-6
10-11
全胚
机械法
DMEM ；FCS ；hLIF ；hSCF ；
EGF ；PDGF ；TGF-β
PEF
无饲养层
P11 形态 ；EB ；畸胎瘤 ［33］
18 Vivo 7-8 三步法 DMEM/M199 ；FCS ；hLIF STO >P80 形态 ；神经元 ；肌肉细胞 ；上皮细胞等
（形态判断）
［35］
19 Vivo 7-9 胰酶消化
免疫外科
DMEM ；FBS ；bFGF ；
hLIF ；核苷酸
MEF ；PEF
STO
P9 AP ；体外分化为 ；成纤维状细胞，平
滑肌样细胞 ；上皮样细胞 ；神经元
［36，
37］
20 Vivo 7，11 免疫外科 DMEM ；FCS ；hLIF PEF P2 SSEA-1 ；分化为 CK8/18 和 LN 阳性的
细胞
［52］
注 ：PA ：孤雌胚胎 ；NT ：核移植胚胎 ；IVF ：体外受精胚胎 ；Vivo ：体内胚胎 ；PEF ：猪胎儿成纤维细胞 ；MEF ：小鼠胎儿成纤细胞 ；STO ：永生化细胞系 ；
FBS ：胎牛血清 ；EB ：拟胚体 ；PUE ：猪子宫上皮细胞 ；P ：传代代次 ；各培养液几乎均含谷氨酰胺、非必须氨基酸，双抗和 β- 巯基乙醇
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.486
胞系可以在体外长期培养并有一定的分化能力，两
个实验组的培养体系中添加的细胞因子分别是 Lif 和
bFGF，这表明所获得的细胞系完全依赖着两条不同
的细胞信号通路，即 LIF-STAT3 和 FGF-MEK。
最后，影响建系因素方面。影响猪类 ESCs 建系
的主要因素包括饲养层细胞的类型、胚胎接种方式
和传代方法。第一，饲养层细胞的选择，目前被广
泛使用的是小鼠胎儿成纤维细胞（Mouse embryonic
fibroblasts，MEF）和 STO（永生化的小鼠胚胎成纤
维细胞系）细胞系，此外，很多实验室也使用猪胎
儿成纤维细胞（Porcine embryonic fibroblasts，PEF）
和猪子宫上皮细胞（Porcine uterus epithelial，PUE）
作为饲养层细胞。第二，胚胎接种方式，ESCs 建
系过程中胚胎的接种形式包括内细胞接种和全胚
接种［18，21，33］ 两种方法，内细胞团的分离方法主
要有免疫外科手术法［16，34］、三步法［35］和酶消化
法［36，37］。第三，传代方法，各实验组主要使用的是
胰酶消化或机械切割的方法进行传代，但由于已建
成的猪类 ESCs 在形态上更接近人 ESCs，胰酶并不
适合此类细胞的消化，因此在人 ESCs 传代过程中使
用的胶原酶和 Dispase 被逐渐应用在猪 ESCs 的分离
和传代上，同时笔者前期研究结果显示将机械切割
法和胶原酶消化法结合起来更适于猪类 ESCs 的分离
和培养（结果暂未发表）。
笔者认为，目前的研究结果显示猪的多能性调
控基因和调控网络与小鼠、大鼠以及人可能是不同
的，简单地照搬其它物种的 ESCs 建系经验是不可行
的。在诸多影响猪 ESCs 建系的因素中，能够维持
猪 ESCs 多能性状态的培养液和细胞信号通路是两个
主要因素，这就要求我们必需解析猪早期胚胎发育
过程中关键基因的表达模式及相关基因的调控网络，
以便发现猪多潜能调控与小鼠等物种的区别，从而
促进真正的猪多能性干细胞的建立。
3 猪诱导多能干细胞的研究进展
猪胚胎干细胞建系进展缓慢，因此，猪 iPSCs
的诞生和发展迅速地推动了猪在药物研发、疾病临
床研究以及转基因动物生产中的应用，本文对猪
iPSCs 的起源、转录因子、提高效率的化合物、载体
系统和源头细胞的研究进展做详细论述（表 2）。
3.1 关于猪iPSCs的起源
猪 iPSCs 最早建于 2009 年，Wu 等［38］ 以猪耳
缘成纤维细胞和骨髓间充质细胞作为源头细胞，应
用可诱导（Tet-on/off 系统）慢病毒表达系统向源头
细胞内转入人源六因子（Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、
Nanog 和 Lin28）成功地将猪体细胞重编程为 iPSCs。
同年，Esteban 等［39］和 Ezashi 等［40］分别使用经典
四因子（Oct3/4、Sox2、Klf4 和 c-Myc）逆转录病毒
诱导体系和慢病毒诱导体系成功地建立猪 iPSCs。三
个实验组所获得的 iPSCs 细胞系呈碱性磷酸酶阳性、
表达多能性基因、核型正常、能够形成拟胚体和畸
胎瘤，但成瘤时间存在较大差异。值得注意的是，
所获得的细胞系细胞形态存在较大差异，表达不同
的细胞表面标记物，Wu 等［38］的 iPSCs 表达 SSEA-3
和 SSEA-4，Ezashi 等［40］ 的 iPSCs 表达 SSEA-1，这
可能是由不同的转录因子和培养体系导致的。
3.2 猪iPSCs转录因子的筛选
2012 年，Liu 等［41-43］三个实验组分别利用猪源
两因子（Oct4 和 Klf4）和鼠源经典四因子在添加 Lif
的条件下诱导获得了猪 iPSCs，所获得的细胞系形态
和多能性都更倾向于小鼠 ESCs，能够向三胚层分化，
这暗示了 Naïve 状态的猪 iPSCs 细胞系依赖的信号通
路可能与小鼠胚胎干细胞依赖的信号通路一样，即
均依赖 LIF-STAT 信号通路。同年，Montserrat 等［44］
报道了在无饲养层的条件下利用三因子（Sox2、Klf4
和 c-Myc）将猪成纤维细胞重编程为 iPSCs。另外，
笔者实验室［45］发现，在我们现有的培养体系下［46］，
Tbx3 和 Nr5a2 在猪 iPSCs 诱导的过程中起到了重要
作用，这两因子不仅能提高重编程的效率，甚至单
独过表达 Nr5a2 因子就能使猪胎儿成纤维细胞重编
成为猪 iPSCs，这提示我们必需重新审视各转录因子
在猪体细胞重编程及胚胎发育过程中是否起到至关
重要的作用。
3.3 在猪iPSCs提高效率的化合物筛选方面
Liu 等［41］获得的两因子猪 iPSCs 需要添加组蛋
白去乙酰化抑制剂（Sodium Butyrate）、TGF-β 信号
通路抑制剂（SB431542）、ERK/MAPK 信号通路抑
制 剂（PD0325901）、GSK3-β 抑 制 剂（CHIR99021）
和 cAMP 信号通路促进剂（Forskolin）这 5 个小分
2015,31(4) 87薛冰华等：猪多能性干细胞研究进展与前瞻
表 2 猪诱导多能性干细胞研究进展
编号 重编程因子 载体 细胞 饲养层 特殊培养条件 分化潜能 多能性标记物 文献
1 hOSKMNL 四环素诱导
的慢病毒
PFF
BMC
MEF DOX ；KSR 畸胎瘤 ；克
隆猪 ；EB
AP ；Oct4 ；Sox2 ；Nanog ；Rex1 ；
CDH1 ；SSEA-3 ；SSEA-4 ；Tra-1-
60 ；Tra-1-81
［38］
2 mOSKM
hOSKM
逆转录病毒 PFF MEF bFGF ；PD0325901 ；mLIF ；
CHIR99021
畸胎瘤 AP ；Oct4 ；Sox2 ；Nanog ；Rex1 ；
Klf4 ；c-Myc ；SSEA-4 ；Lin28
［39］
3 hOSKM 慢病毒 PFF MEF bFGF 畸胎瘤 ；EB AP ；Oct4 ；Sox2 ；Nanog ；SSEA-1 ［40］
4 pOK 逆转录病毒 MSC MEF KSR ；NaB ；SB431542 ；
PD0325901 ；Forskolin ；
CHIR99021 ；hLif
畸胎瘤 ；EB AP；Oct4；Nanog；Klf4；c-MycBmp4；
bFgf
［41］
5 mOSKM 逆转录病毒 PEF MEF hLif ；hFGF2 ； 畸胎瘤 ；EB AP ；Oct4 ；Sox2 ；Nanog ；SSEA-4 ；
STAT3 ；SOCS3
［42］
6 mOSKM 逆转录病毒 PFF MEF bFGF ；Lif ；VPA 嵌合胚胎
核移植胚胎
AP ；Oct4 ；Sox2 ；Nanog ；SSEA-
4 ；TRA-1-60 ；SSEA-1 ；TRA-1-81 ；
TERT
［43］
7 mSKM 逆转录病毒 PFF MEF
明胶
bFGF ；mLIF 畸胎瘤 ；EB AP ；Oct4 ；Sox2 ；Nanog ；SSEA-4 ；
TRA-1-81 ；TRA-1-60
［44］
8 mOSKMTN 逆转录病毒 PEF MEF KSR ；bFGF ；hLIF ；BSA 畸胎瘤 ；EB AP ；Oct4 ；Sox2 ；Nanog ；Rex1 ［45］
9 mOSKMTN 逆转录病毒 PEF MEF KSR ；bFGF ；hLIF ；BSA 畸胎瘤 ；EB AP ；Oct4 ；Sox2 ；Nanog ；Rex1 ；
SSEA-4 ；TRA-1-60 ；SSEA-1
［46］
10 hOSKM 四环素诱导
的慢病毒
ADSC MEF KSR ；PD0325901 ；
CHIR99021 ；hLif
畸胎瘤 ；EB AP ；Oct4 ；Sox2 ；Nanog ；
SSEA-3 ；SSEA-4 ；Lin28 ；
Esrrb ；Utf ；Dppa5，
［47］
11 pOSKMLN 睡美人转座
子
PFF MEF KSR ；PD0325901 ；
CHIR99021 ；hLif
无 AP ；Oct4 ；Sox2 ；Rex1 ；UTF1 ；
Stella ；TDH ；CHD1
［48］
12 mOSKM 睡美人转座
子
PFF MEF
SNL
KSR ；bFGF 畸胎瘤 ；EB AP ；Oct4 ；Sox2 ；Nanog ；Rex1 ；
ESRRB ；DPPA5 ；UTF1
［50］
13 hOSKMNL 慢病毒 PMSC MEF KSR ；bFGF ；TeSR1 嵌合体 ；EB AP ；Oct4 ；Sox2 ［53，54］
14 hOSKM 逆转录病毒 PEF MEF pLIF ；Forskolin 嵌合体 ；EB AP ；Oct4 ；Sox2 ；Nanog ；Lin28 ；
Stella ；Eras ；SSEA-1
［55］
注 ：OSKMNL 分别代表 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog 和 Lin28 六种转录因子 ；前缀 m，p，h 分别代表鼠源、猪源、人源 ；SNL ：表达白血病抑制因子
的小鼠成纤维细胞 ；PFF ：猪成体成纤维细胞 ；PEF ：猪胎儿成纤维细胞 ；MEF ：小鼠胎儿成纤维细胞 ；BMC ：骨髓间充质细胞 ；PMSC ：骨膜间质干细胞 ；
ADSC ：脂肪干细胞 ；EB ：拟胚体
子化合物才能维持多能性状态，但此时，iPSCs 外源
基因仍然不沉默，同时我们可以发现当诱导因子减
少时则需要更多的外部条件来维持猪 iPSCs 的多能
性。Telugu 等［19］和 Zhang 等［47］分别用内细胞团和
脂肪干细胞作为源头细胞，在持续表达外源基因的
同时添加小分子（Kenpaullone，KP 和 CHIR99021）
才能维持猪 iPSCs 的多能性。Gu 等［46］通过改善基
础培养液的配方，在添加小分子的基础上获得了能
够长期传代的形态类似于小鼠 ESCs 的猪 iPSCs，转
换后的猪 iPSCs 两条 X 染色体处于激活状态，能够
获得畸胎瘤。以上团队所得到的实验结果均表明添
加小分子化合物可以促进猪 iPSCs 的获得，但 2014
年 Petkov 等［48］发现在猪 iPSCs 建立过程中添加 2i
（PD0325901，PD 和 CHIR99021，CH）会降低猪 iP-
SCs 的建系效率和多能性，这与 Rodriguez 等［49］在
猪植入前胚胎的研究结果相近，说明曾在鼠类建系
过程中起到重要作用的小分子抑制剂（PD 和 CH）
是否真的适用于猪 iPSCs 的建立还有待进一步考证。
3.4 猪iPSCs载体系统和源头细胞优化
Kues 等［50］对猪 iPSCs 诱导载体进行探索，他
们使用 Sleeping Beauty 转座子质粒共表达鼠源经典
四因子，将猪的成纤维细胞诱导为猪 iPSCs，该诱导
载体进入细胞后，游离在宿主细胞基因组外，这极
大地降低了病毒感染过程中病毒重激活的频率，为
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.488
猪 iPSCs 后期临床应用和畜牧生产的安全性带来了
新的希望。笔者实验室［51］研究结果还发现猪 iPSCs
诱导效率和其源头细胞的核移植囊胚率呈正相关，
不同来源的猪 iPSCs 细胞系具有相似的、较低的核
移植囊胚率，这与之前报道的猪 iPSCs 核移植效率
低并且不能获得核移植后代的结果相符。
现今，小鼠、大鼠、人、猕猴、猪、牛、羊和
兔子等物种均成功建立 iPSCs。虽然 iPSCs 已朝着诱
导效率高和生物安全性高的方向快速发展，但目前
iPSCs 产生的具体分子机制仍然未知，其临床应用的
安全性也依然有待评估。同样，猪 iPSCs 面临着外
源基因不沉默、内源基因激活不足、自我更新需要
外源基因持续表达、无法得到发育到期的核移植胎
儿等问题，这都说明我们所获得的猪 iPSCs 多能性
存在缺陷。针对上述问题，猪 iPSCs 的后续工作应
主要集中在非病毒载体和减少因子诱导猪 iPSCs、改
变猪 iPSCs 的多能性状态和获得猪 iPSCs 的嵌合体
后代三个方向。
4 猪类胚胎生殖细胞的研究进展
胚 胎 生 殖 细 胞（EGCs） 是 胎 儿 原 始 生 殖 细
胞（PGCs）在体外建系培养得到的。哺乳动物中，
PGCs 最早于原条尾部形成，后随原条细胞内卷而到
达尿囊附近的卵黄囊背侧内胚层，接着 PGCs 以阿
米巴运动，沿胚胎后肠和肠系膜迁移到中肾腹侧的
生殖嵴内，在此 PGCs 经历表观遗传重编程并最终
形成配子。将从胎儿生殖嵴分离的 PGCs 培养在含
有血清和某些特定生长因子的条件下就会阻断其向
生殖细胞的特化，最终被重编程为 EGCs，由于 EGC
与小鼠 ESCs 具有相似的生物学特性，PGCs 也就为
多能性干细胞的分离提供了一个新的来源。在对猪
的研究中，与内细胞团相比，PGCs 具有易获得、数
量大、发育时辰长和种间差异小等优点，更适于猪
多能性干细胞系的建立。
猪的 EGC 最早建系于 1997 年，Shim 等［56］以
24-25 日龄猪的生殖嵴为原材料建立了猪 EGCs，该
细 胞 系 可 以 产 生 嵌 合 体 猪 ；Piedrahita 等［57］ 成 功
地对 EGCs 进行转基因操作，获得了转基因嵌合体
猪。目前已有包括笔者实验室［58］在内的多个实验
组报道了他们对猪 EGCs 的研究工作，但所获得的
猪 EGCs 只是部分符合 ESCs 的鉴定标准，真正具有
生殖系嵌合能力的猪 EGCs 还未被建立，这些所获
得的猪 EGCs 也只能被称为“猪类胚胎生殖细胞”（猪
类 EGCs）。
虽然已有研究者对猪 EGCs 培养体系进行了探
索，例如，基础培养基和血清的选择［59］、饲养层细
胞的比较［60］、猪 EGCs 建系最适胚胎日龄的选择［58］
以及细胞因子和小分子的使用等［61］，但是这都无
法从根本上解决猪 EGCs 建系难的问题。笔者认为，
只有立足于猪 PGCs 本身生物学特性、深入了解
PGCs 多能性维持的机制和积极探索生殖系标志基因
表达模式才能够有效地促进猪 EGCs 的最终建立。
5 猪多能性干细胞的鉴定标准
多能性干细胞的鉴定主要包括以下几个内容 ：
碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）的活性检
测，细胞表面标记物及多能性因子的检测，体外定
向分化或自发分化潜能的检测，畸胎瘤和嵌合体的
检测、生殖系嵌合能力以及四倍体补偿能力的检测。
另外，核型检测、启动子甲基化分析、X 染色体状
态分析、端粒酶活性分析和基因图谱分析等均可作
为多能性鉴定的辅助指标。在所有鉴定指标中，最
严格的检测标准是生殖系嵌合能力和四倍体补偿能
力的检测，这也是多能干细胞鉴定的“黄金标准”。
猪类 ESCs 和猪类 EGCs 早期的鉴定指标主要是
形态学观察和拟胚体（Embryonic body，EB）分化
实验。猪类 ESCs 根据形态可被分为两类，分别是
内细胞团样的克隆和上皮样的克隆，这两类克隆均
能在体外长期培养并形成 EB，说明细胞形态和分化
潜能并无直接关联，这促进了分子检测和细胞水平
上筛选纯化的发展。分子检测始于 1993 年，主要是
碱性磷酸酶和阶段特异性胚胎抗原 -1（Stage specific
embryonic antigen-1，SSEA-1）的表达被作为多能性
的标记［35，52］。近年来的研究中已将核型分析、干细
胞的定向分化、转录因子启动子甲基化状态分析、X
染色体激活状态分析、端粒酶活性分析和畸胎瘤分
化分析应用到猪类 ESCs 的建系过程中［17，22，23，62］，
生殖系嵌合能力虽然已被作为检查指标，但一直没
有细胞系能够获得具有生殖系嵌合能力的嵌合体动
物。所以总的来看，已建成的猪类 ESCs 都只能在某
2015,31(4) 89薛冰华等：猪多能性干细胞研究进展与前瞻
一方面达到真正 ESCs 的要求。猪类 EGCs 的鉴定标
准以及发展进程与此相似，此处不做赘述。
猪 iPSCs 的鉴定指标较为完善，主要是依循小
鼠 ESCs 的鉴定标准，除了小鼠 ESCs 的“黄金标准”
外，其余各鉴定指标猪 iPSCs 均可满足。值得注意
的是，West 等［53，54］和 Fujishiro 等［55］报道他们诱
导培养得到了能够生产嵌合体猪的 iPSCs 细胞系，
所获得的胎猪或仔猪中并没有明显肿瘤的形成，在
West 等的研究结果中，共有 4 头妊娠个体发育到期，
出生仔猪数为 36 头（34 活，2 死），成活个体中 29
头为嵌合体（85.3%），但作为嵌合体的判断依据仅
有外源基因的 RT-PCR 结果，所以此结果的准确性
有待商榷。
猪多能性干细胞的研究领域仍然存在许多问题
有待解决，例如，如何高效地获得各类猪多能性干
细胞，如何维持其自我更新和分化的能力，如何得
到发育到期的核移植和嵌合体胎儿，如何提高其在
科研应用中的安全性，如何定向诱导猪多能性干细
胞向某一特定类型的细胞分化并将其作为医学治疗
的临床前研究工具等，这些问题的解决有待于从根
本上阐明体细胞重编程、猪多能性干细胞自我更新
和定向分化的分子调控机制。猪基因组图谱的公布
使得人们更易于找到维持猪多能性干细胞状态的细
胞信号通路，通过筛选相应的细胞因子和小分子超
激活或抑制该信号通路，剔除可能诱使猪多能性干
细胞遗传物质发生改变的因素，使得建立真正的猪
多能性干细胞系成为可能。
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