全 文 ：·综述与专论· 2013年第9期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2012 年是转基因作物商业化的第 17 年，转基
因作物种植面积持续增加［1］。大部分商业化的转基
因作物表达新的蛋白，这些蛋白赋予了作物新的特
性。例如，抗虫性、抗除草剂特性、提高营养水平
等。然而人们无法预测将基因转入一个新的遗传背
景中会产生什么样的作用，故而对其后果存在着疑
虑。而消除这一疑虑的有效途径就是进行转基因作
物的风险性评价。也就是说要经过合理的试验设计
和严密科学的试验程序，积累足够的数据，人们根
据这些数据可以判断转基因作物是否会影响人和动
物的健康，是否会对环境造成不利的影响［2，3］。
转基因作物的风险性研究通常需要多至数十克
到几百克的纯化蛋白，但是人们很难从转基因作物
收稿日期 ：2013-04-12
基金项目 ：国家转基因生物新品种培育重大专项（2011ZX08003-001）
作者简介 ：崔浩然，男，硕士，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：81ndchr@163.com
通讯作者 ：黄大昉，男，研究员，研究方向 ：农业微生物与植物基因工程 ；E-mail ：dfhuang@mail.caas.net.cn
微生物蛋白与转基因作物蛋白等同性比较
崔浩然  郎志宏  朱莉  汪海  黄大昉
（中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）
摘 要 ： 转基因作物的风险性评估一般需要大量的转基因蛋白，但是人们很难从转基因作物中表达纯化出足够量的蛋白。
然而，人们可以通过微生物过表达系统获得大量的纯化蛋白，如果可以用微生物蛋白来代替转基因蛋白进行风险性研究，就可以
解决这一难题，但是微生物蛋白与转基因蛋白必须在生化特性与功能特性上具有等同性。简要介绍一套典型的比较微生物蛋白和
转基因蛋白等同性的方法，为利用微生物蛋白进行转基因作物的风险性评估提供参考。
关键词 ： 风险性评估 等同性 完整性 免疫反应 蛋白序列 糖基化修饰 生物活性
Comparison of Equivalence for Micro-Produced Protein with
Transgenic Protein
Cui Haoran Lang Zhihong Zhu Li Wang Hai Huang Dafang
（Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract:  The studies for risk assessment of transgenic crops require amounts of transgenic protein, but it is extremely difficult to prepare
the required amount of purified protein from transgenic plants. Nevertheless, ample protein of high purity may be produced by over-expressing
the protein in microbes. Using microbial proteins in a study for risk assessment can solve this problem, but the microbial proteins must be
equivalent with transgenic plant proteins. In this article, we describe a typical set of methods used to compare the equivalence for micro-protein
with transgenic protein, which for the purposes of providing reference for the risk assessment using micro-proteins instead of trans-proteins.
Key words:  Risk assessment Equivalence Intactness Immune-reactivity Protein sequence Glycosylation Bioactivity
中纯化出这么多目的蛋白。通常，人们可以通过微
生物过表达系统很容易地获得大量的纯化蛋白，如
果用微生物蛋白代替转基因蛋白进行风险性研究能
解决这一难题，但是必须先确定微生物蛋白是否与
转基因蛋白在生化特性和功能上具有等同性。本文
主要概述微生物蛋白与转基因作物蛋白等同性的比
较，介绍两者等同性比较的研究方法，旨为利用微
生物蛋白进行转基因作物的风险性研究提供依据。
1 一般准则
目前虽有很多微生物蛋白和转基因蛋白之间特
性比较的研究报道，但是其研究手段各有不同，还
没有一套典型的标准来确定两种蛋白的等同性。等
同性并非指两者完全相同，而是两者在相关的生化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期14
特性和功能上足够相似，这需通过多种研究结果比
较决定，如表 1 所列。只有通过对这些研究手段的
结果进行分析，才能确定在微生物蛋白和转基因蛋
白之间是否具有等同性，是否可以用微生物蛋白来
表 1 比较微生物蛋白与植物蛋白等同性的方法［4］
比较参数 方法 等同性评价要点 结果说明
完整性 Western blot，质谱分析法 由插入、缺失及降解导致的序列差异 ；蛋白修饰如糖
基化。质谱分析法比 Western blot 有更高准确度和精度
插入、缩短或修饰表明物理化学性质改变，
包括功能活性
免疫反应 Western blot 在免疫反应上潜在的不同 结合抗体不同表明蛋白结构不同
蛋白序列 N 端测序，C 端测序 氨基酸序列不同的检测 氨基酸序列决定蛋白质结构和功能
糖基化 免疫杂交分析 蛋白不同糖基化修饰的检测 糖基化影响蛋白质的许多特性，包括稳定
性、功能和变应原性
功能活性 酶活性检测，抗虫性检测 检测酶活力（酶）的不同杀虫活性（杀虫蛋白） 活性检测可以确定蛋白的折叠
提供转基因作物风险性研究的可靠信息。
2 蛋白的等同性鉴定
2.1 完整性和免疫反应
一般通过测定蛋白的分子量可以确定蛋白的完
整性，分子量还可以确定蛋白是否有修饰作用，如
糖基化、氨基酸插入或者丢失 ；免疫反应是指蛋白
结合特殊抗体的能力，免疫反应的缺失表明蛋白发
生了修饰，从而使其生化和功能特性发生改变。
Western blot 分析也称为蛋白免疫杂交分析，是
一种常用的检测蛋白样品完整性和免疫反应的方
法。 在 Western blot 中， 样 品 通 过 SDS-PAGE 进 行
分离，然后进行第二次电泳将蛋白从凝胶转移到膜
上，通过目的蛋白与特异抗体的结合，从而检测目
的蛋白，通过一个分子量 Marker 来显示目的蛋白的
分子量。由于蛋白质修饰上的不同会导致迁移率的
不同，因此如果不同来源的蛋白质具有相同的分子
量，可以证明这些蛋白具有等同性。徐海滨等［5］对
转 Bt cry1Ie 基因抗虫玉米的等同性进行了相关研究。
他们通过 Western blot 试验证实，转 Cry1Ie 玉米叶
片中提取的 Cry1Ie 蛋白和大肠杆菌纯化的 Cry1Ie 蛋
白在 66-97 kD 区域同一位置出现明显的电泳条带
（图 1），显示两者具有相同的免疫反应性［5］。通过
Western blot 检测得到的蛋白分子量一般不太准确［6］，
而通过质谱分析法（MS）得到蛋白完整性的精确
数据。一般有两种质谱分析法 ：电喷雾电离质谱分
析法（Q-TOF）和基质辅助激光解析电离质谱分析
（MALDI-MS）。在分析微生物蛋白时最好用 Q-TOF，
因 Q-TOF 比 MALDI-TOF 的 准 确 率 更 高［7］。Q-TOF
分析仪能识别蛋白之间小到单个氨基酸的替换，甚
至能识别低分子量的修饰，如甲硫氨酸发生氧化。
检测植物表达蛋白原则上用 Q-TOF 和 MALDI-TOF
MS 都 可 以， 而 目 前 大 多 数 情 况 下 用 MALDI-TOF
MS，因为在检测从大量植物样品中获得的少量目的
蛋白时，这种方法有更高的灵敏度［8］。但用 MS 方
法分析植物蛋白分子量时有较大困难 ：从植物中很
难分离纯化出目的蛋白 ；目的蛋白的纯度必须要高 ；
蛋白的分离方法不能影响目的蛋白的结构。
2.2 蛋白质序列
蛋白质的氨基酸序列决定其结构和功能，因此
氨基酸序列比对可以用来鉴定微生物和植物蛋白的
生化和功能等同性。一般确定蛋白质的序列的方法
为 N 端测序和串联质谱测序。
微 生 物 和 植 物 目 的 蛋 白 的 N 端 测 序 一 般 用
Edman 测序法［9］。目的蛋白通过和异硫氰酸苯酯作
用转变为苯胺基硫甲酰蛋白，这种修饰了的 N 端氨
基酸通过和三氟乙酸作用发生裂解后转变成可以在
色谱分析或者电泳中分离识别的乙内酰苯硫脲。由
于这种转化不可能反应完全，所以获得的序列数量
97
kD
1 2 3 4 5
66
43
31
1 ：未诱导的 BL21/pETIe 菌液 ；2 ：诱导的 BL21/pETIe 菌液 ；3 ：玉米叶中
提取的浓缩 Cry1Ie 蛋白 ；4 ：从大肠杆菌纯化的 Cry1Ie 蛋白 ；5 ：诱导的
BL21/pETIe 包涵体
图 1 免疫反应活性 Western blot 结果［5］
2013年第9期 15崔浩然等 ：微生物蛋白与转基因作物蛋白等同性比较
有限。但是微生物蛋白中的前 10 个氨基酸残留序列
可以检测出来，并能与获得的植物蛋白序列直接进
行序列比对。Edman 法得到的数据是半定量的，并
且可以检测出混合样品中的 N 端形式。Edman 化学
降解测序法虽可靠、有效，但仍有其无法避免的局
限性，如 N 端封闭的、环状的蛋白不能测定 ；被修
饰的蛋白不能给出确切的信号 ；要求蛋白或多肽的
纯度在 95% 以上 ；测序速度较慢，灵敏度较低，耗
费大等。采用钠升喷雾（Nano）技术和碰撞诱导解
离（CID collision inducd dissociation）方法，在电喷雾-
四极杆-飞行时间质谱（ES1-Q-TOF electrspectrometry
ionizationquadrupole-time of flight） 上， 可 以 对 两 种
序列部分未知的天然多肽进行从头测序（de novo
sequence）。 例 如， 刘 清 萍 等［10］ 利 用 钠 升 电 喷 雾
串联质谱法对从 Sigma 公司购买的标准肽（GLU1）-
FIBRINOPEPTIDE B（Glu-fib）进行了测序，采用钠
喷针进样，TOFMS 扫描，得到 Glu-fib 的（M+2H）2+
的 离 子 峰（ 图 2）， 用 Micromass 的 专 用 解 谱 软 件
MasSeq 直接解析其序列为 EGVNDNEEGFFAR，与
Glu-fib 的序列完全吻合。这种方法可以方便有效的
解决传统的 Edman 降解法测序中常见的实际问题，
如末位残基的丢失，赖氨酸和亮氨酸难鉴定等，此
方法的建立是对 Edman 降解测序法很好地补充。
般为 Asn-Xxx-Ser/Thr 序列形式或较少见的 Asn-Xxx-
Cys 序列形式（其中 Xxx 是除了 Pro 以外任意的氨基
酸）。一般情况下，糖基化情况不同会导致蛋白生理
化学性质的改变。在转基因植物中蛋白一般不会特
异地进行糖基化，且大肠杆菌中表达的重组体蛋白
也没有糖基化［13］。因此，如果能证明两种蛋白都不
存在糖基化，也能证明两种蛋白在功能上具有等同
性。典型的植物 N-糖基化形式较复杂，并且每个糖
基化基团增加 1-2 kD 的质量［14］。通常检测植物蛋
白糖基化基团的方法有 ：Western blot 免疫杂交分析、
氨基酸序列分析、蛋白高效液相色谱分析、红外光
谱（FT-IR）分析、电镜扫描图谱（SEM 分析）等。
图 3 就是一张从重组大肠杆菌和转基因玉米 GA21
叶片提取液中得到的 mEPSPS 蛋白的糖基化免疫杂
交图［4］，结果证明两种 mEPSPS 蛋白都没有糖基化，
因此通过 Western blot 检测可以获得比较植物蛋白和
微生物蛋白糖基化状态的证据。
0
50
100
[M+H]+
N-EGVNDNEEGFFSAR-C
0
y1
y2
y5
y3
y4
y6
y7
y8
y9
y10
y12 y13b12b11
b10b9
b8
b7
b6
b5
b4b3
b2
y11
200 400 600 800
m/z
1000 1200 1400 1600
图 2 标准肽 Glu-fib 的 MS/MS 图谱［10］
Transferrin
1 2 3 4 5 6 7 8
97
kD
64
51
39
28
19
mEPSPS
1-3 ：100 ng、50 ng 和 25 ng 转 铁 蛋 白 ；4 ：2 000 ng 肌 酸 酶 ；5 ：分 子 量
Marker SeeBlue® Plus2（Invitrogen）；6 ：732 ng 微生物表达 mEPSPS 蛋白 ；7，
8 ：732 ng 和 1 463 ng 植物表达 mEPSPS 蛋白。mEPSPS 蛋白可能的分子量在
凝胶右侧用箭头表示
图 3 重组大肠杆菌和转基因玉米 GA21 表达的 mEPSPS
蛋白的糖基化分析［4］
2.4 生物活性
2.4.1 酶蛋白活性 许多转基因蛋白都是酶类，证
明转基因蛋白和微生物蛋白的活性具有等同性非常
重要。酶的活力用酶单位表示，一般经常用酶联免
疫吸附试验（ELISA）来检测酶活力。但是，ELISA
试验不能区别活性蛋白和非活性蛋白，从而使酶活
力结果不准确。因此，为了提高检测的准确性，在
分离纯化转基因植物表达蛋白时用原始的植物提取
液来进行试验。另外，需要考虑的是植物样品中的
2.3 糖基化修饰
植物中超过一半的蛋白质是糖基化形式。糖基
化修饰能改变蛋白质的生理化学特性，如耐热性、
功能活性、蛋白折叠、转运和半衰期等。在植物蛋
白中 N-糖基化是一种常见的糖基化形式［11， 12］，一
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期16
蛋白酶和次级代谢产物，以及提取过程中 pH 的迅
速改变等，这些因素都会影响酶的活力。
在比较微生物和植物蛋白酶活力时，最好用原
始的转基因植物提取液与混合了非转基因植物提取
液的微生物蛋白进行研究。例如，草甘膦抑制 5-烯
醇式丙酮蟒草酸 -3-磷酸合成酶（EPSPS）的活性，
这种酶可以催化莽草酸合成芳香族氨基酸过程。在
转基因玉米 GA21 中表达一个经过改造的 mEPSPS，
其 中 由 于 两 个 氨 基 酸 的 替 换， 降 低 了 草 甘 膦 和
mEPSPS 的结合能力，从而产生草甘膦抗性［15］。微
生物表达的 mEPSPS 蛋白酶活力是植物酶的 9 倍（表
2）。然而，当微生物表达的酶和非转基因玉米提取
液混合时，酶活力只是植物酶的 2 倍，表明玉米提
取液抑制了 mEPSPS 的活性。这为利用微生物表达
的 mEPSPS 是否适合代替植物表达的 EPSPS 来进行
风险性研究提供了重要的信息。
表 2 不同来源的 mEPSPS 蛋白酶活力的比较［16］
样品 平均酶活力（U/mg mEPSPS）±SD
微生物 mEPSPS 6 700±32
GA21 玉米 mEPSPS 734±16
微生物 mEPSPS+ 非转基
因玉米提取液
1 560±21
1 U 的 mEPSP 蛋白活性的定义是在标准试验条件下每分钟裂解 1 nmol 磷酸
盐的酶量［17］
2.4.2 杀虫蛋白活性 杀虫蛋白的活性由一定时间
内杀死给定试验幼虫的毒蛋白浓度或者剂量来衡量，
一般由 LC50 来表示，即在一定时间内杀死暴露在毒
蛋白中 50% 敏感幼虫的毒蛋白浓度。由于不同幼虫
个体间会有些许不同，因此生物活性检测的结果也
会不同。为了降低外来因素的干扰，植物和微生物
杀虫蛋白的杀虫活力检测应当在统一的条件下进行，
并且幼虫的来源也要统一，且随机分配到不同处理
中。徐海滨等［5］证实大肠杆菌表达的 Cry1Ie 蛋白杀
虫活性较强，与宋福平等［18］的试验结果大体一致（表
3）；纯化 Cry1Ie 蛋白对玉米螟的生长抑制明显，与
转 cry1Ie 玉米叶片所进行玉米螟虫试结果有良好的
一致性，表明纯化 Cry1Ie 蛋白与转 cry1Ie 玉米表达
的抗虫蛋白在生物活性上具有相似性。
目前，大部分商业化的转基因作物以表达酶类
或者毒素蛋白为主，检测这些蛋白活性的方法相对
较简单，但转基因作物新的特性需要检测方法不断
改进更新。例如，一种增加玉米水利用效率的方法
是在玉米中表达一种来自于枯草芽胞杆菌的冷休克
蛋 白（CSPB），CSPB 结 合 到 单 链 DNA 或 RNA 上，
由于这种蛋白可打开 DNA 双链，其结合活性可通过
一个标记的双链探针发射出的荧光检测［19］。这种方
法已用来测定微生物和植物表达的 CSPB 蛋白的等
同性。微生物蛋白与转基因植物蛋白等同性的确定
是为了利用微生物蛋白进行转基因作物的风险性评
估。例如，杨辉等［20］在进行转基因表达蛋白的急
性毒性试验时，一般以啮齿类动物（通常是小鼠）
一次性高浓度经口暴露，观察时间为 14 d，对于
EPA 和 OECD，建议在急性经口毒性试验中采用的
剂量分别为 2 000 和 5 000 mg/kg。显然，从转基因
植物中获得如此高的纯化蛋白是不可能的，而当确
定微生物蛋白和植物蛋白具有等同性之后，通过微
生物表达蛋白就可以达到目的。本研究室与其他相
关实验室合作，开展了微生物蛋白的纯化工作，通
过构建 Cry1Ie 蛋白表达载体，在大肠杆菌表达菌株
BL21 中大量表达纯化 Cry1Ie 蛋白，以证明 Cry1Ie
蛋白在转基因玉米中的安全性，同时做好安全性评
价工作。
3 结语
随着现代生物技术的发展，转基因作物越来越
多，利用微生物蛋白进行转基因作物风险性评估的
有效性不仅取决于上述试验要素，更重要的是微生
物蛋白必须能达到试验的目的。
等同性并不意味着微生物蛋白和植物蛋白必须
完全相同，而是在相关的特性上足够相似。但凡以
微生物表达的蛋白代替转基因植物中的蛋白进行风
险性研究需要符合以下的等同性鉴定标准 ：第一，
两者在凝胶电泳中表现一致，即完整性 ；第二，具
有相同的结合单克隆或者多克隆抗体的免疫反应活
性；第三，具有相同的翻译后修饰特征（如糖基化）；
第四，具有相似的氨基酸序列 ；第五，具有相似的
生物学活性。但因蛋白功能上的变化、研究目的的
不同以及评价者对蛋白间特殊差异选择的不同，很
难确定出一套等同性的研究标准。因此，可以根据
不同的试验目的设计试验来证明微生物蛋白是否适
用于研究该转基因产品的风险性。随着生物技术的
2013年第9期 17崔浩然等 ：微生物蛋白与转基因作物蛋白等同性比较
发展，相信会有更好的标准来鉴定微生物蛋白与转
基因植物蛋白的等同性，以便利用微生物蛋白进行
转基因作物的风险性评估。
参 考 文 献
［1］ James C. 2012 年全球生物技术 / 转基因作物商业化发展态势［J］.
中国生物工程杂志 , 2013, 33（2）：1-8.
［2］ 王国英 . 转基因植物的安全性评价［J］. 农业生物技术学报 ,
2001, 9（3）：205-207.
［3］ Sanvido O, Romeis J, Gathmann A, et al. Evaluating environmental
risks of genetically modified crops ：ecological harm criteria for regu-
latory decision-making［J］. Environ Sci Policy, 2012, 15 ：82-91.
［4］ Raybould A, Killby P, Graser G. Characterising microbial protein test
substances and establishing their equivalence with plant-produced
proteins for use in risk assessments of transgenic crops［J］.
Transgenic Res, 2012, 22（2）：445-460
［5］ 徐海滨 , 张晓霞 , 李芳 , 等 . Cry1Ie 基因在大肠杆菌中的表达及
等同性鉴定［J］. 卫生研究 , 2007, 36（1）：45-48.
［6］ Sadeghi M, Hajivandi M, Bogoev R, et al. Molecular weight
estimation of proteins by gel electrophoresis revisited［J］. Focus,
2003, 25 ：35-39.
［7］ Sundqvist G, Stenvall M, Berglund H, et al. A general, robust method
for the quality control of intact proteins using LC-ESI MS［J］. J
Chromatogr B, 2007, 852 ：188-194.
［8］ Herouet C, Esdaile DJ, Mallyon BA, et al. Safety evaluation of the
phosphinothricin acetyltransferase proteins encoded by the pat
and bar sequences that confer tolerance to glufosinate-ammonium
herbicide in transgenic plants［J］. Regul Toxicol Pharmacol, 2005,
41 ：134-149.
［9］ Edman P, Begg G. A protein sequenator［J］. Eur J Biochem, 1967,
1 ：80-91.
［10］ 刘清萍 , 刘中华 , 唐新科 , 等 . 串联质谱在多肽测序中的应
用［J］. 生命科学研究 , 2004, 8（2）：112-116.
［11］ Solá RJ, Rodríguez-Martínez JA, Griebenow K. Modulation of protein
biophysical properties by chemical glycosylation ：biochemical
insights and biomedical implications［J］. Cell Mol Life Sci, 2007,
64 ：2133-2152.
［12］ Strasser R, Altmann F, Gossl J, et al. Unaltered complex N-glycan
profiles in Nicotiana benthamiana despite drastic reduction of β1,
2-N-acetylglucosaminyltransferase I activity［J］. Glycoconjugate J,
2004, 21 ：275-282.
［13］ Nagels B, Weterings K, Callewaert N, et al. Production of plant
made pharmaceuticals ：from plant host to functional protein［J］.
Crit Rev Plant Sci, 2012, 31 ：148-180.
［14］ Baneyx F, Mujacic M. Recombinant protein folding and misfolding
in Escherichia coli.［J］. Nat Biotechnol, 2004, 22 ：1399-1408.
［15］ Wilson IBH, Zeleny R, Kolarich D, et al. Analysis of Asn-linked
glycans from vegetables foodstuffs ：widespread occurrence of Lewis
a, core linked α1, 3-linked fucose and xylose substitutions［J］.
Glycobiology, 2001, 11 ：261-274.
［16］ Dill GM. Glyphosate-resistant crops ：history, status and future
［J］. Pest Manag Sci, 2005, 61 ：219-224.
［17］ Padgette SR, Huynh QK, Borgmeyer J, et al. Bacterial expression and
isolation of Petunia hybrid 5-enolpyruvylshikimate- 3-phosphate
synthase［J］. Arch Bio-chem Biophys, 1987, 258 ：564-573.
［18］ 宋福平 , 张杰 , 韩岚岚 , 等 . 对鳞翅目害虫有活性的 crylC 基因
的克隆和表达［J］. 植物保护学报 , 2003, 30（2）：161-165.
［19］ Castiglioni P, Warner D, Bensen RJ, et al. Bacterial RNA
chaperones confer abiotic stress tolerance in plants and improved
grain yield in maize under water-limited conditions［J］. Plant
Physiol, 2008, 147 ：446-455.
［20］ 杨辉 , 向钱 , 李宁 . 食品中转基因表达蛋白的危险性评估［J］.
中国食品卫生杂志 . 2010, 22（2）：173-178.
（责任编辑 狄艳红）
表 3 纯化 Cry1Ie 表达蛋白对玉米螟虫杀虫活性的影响［5］
受试物 重复（次）
昆虫数
平均虫重（mg） 平均死亡率（%）
接虫数 活虫数
缓冲溶液 3 144 131 0.27±0.03 9.0
载体菌液纯化 Cry1Ie 表达蛋白（×10-6，mg/kg） 3 150 135 0.36±0.09 10.0
0.5 3 144 106 0.27±0.03（1） 26.2（1）
5.0 3 144 121 0.03±0.05（1） 16.0
250.0 3 144 38 0.13±0.10（1） 18.7（1）
（1）缓冲溶液和载体菌液比较 P ＜ 0.01