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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
阿维菌素（avermectins，AVM）是从阿维链霉
菌的发酵产物中分离出来的一种具有杀虫、杀螨、
杀线虫活性的十六元大环内酯二糖苷类化合物，属
生物源农药。适用作物有蔬菜、果树、棉花和花卉等，
主要防治对象为螨类、斑潜蝇、小菜蛾和棉铃虫等
农作物害虫，目前包括中国在内的很多国家已在登
记使用。
收稿日期 : 2012-03-08
基金项目 : 贵州省科技工业攻关项目［黔科合 GY 字（2006）3011, 贵州大学引进人才基金项目］, 贵州大学创新基金项目（2012033）
作者简介 : 胡秀虹 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 天然产物与仿生农药 ; E-mail: huxiuhong-123@163.com
通讯作者 : 黄剑 , 男 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 农药毒理学和天然产物化学 ; E-mail: jhuang66@163.com
一株阿维菌素降解菌 AW1-18的筛选与分类鉴定
胡秀虹 李景壮 叶胜蓝 徐刚 黄剑
（贵州大学精细化工研究开发中心 教育部绿色农药与农业工程重点实验室，贵阳 550025）
摘 要： 利用富集培养法从长期施用阿维菌素农药的菜豆土壤中分离出 18株能利用阿维菌素为唯一碳源和氮源生长的细
菌。采用紫外分光光度法对菌株的阿维菌素降解能力进行测定，结果有 4株菌有较好的降解率，其中降解率最好的菌株命名为
AW1-18。通过高效液相色谱法对 AW1-18的降解能力进行测定，结果表明，当接种量为 2.5%时，该菌株在含 100 mg/L的阿维
菌素无机盐基础培养液中，30℃，150 r/min，pH7的条件下培养 6 d后，对阿维菌素的降解率达 75%以上。用 16S rRNA通用引
物，经 PCR扩增、测序得到 AW1-18的 16S rRNA序列（GenBank登录号为 JQ316540），在 NCBI中通过 BLAST后发现与不动杆菌
属（Acinetobacter）的 16S rRNA序列相似性达到 99%，结合形态特征和生理生化特性分析结果，确定菌株 AW1-18为 Acinetobacter
tandoii。
关键词： 阿维菌素 生物降解 分离 鉴定 不动杆菌
Screening and Identification of Avermectin-degrading Bacterium
Strain AW1-18
Hu Xiuhong Li Jingzhuang Ye Shenglan Xu Gang Huang Jian
（Research and Development Center of Fine Chemicals，Guizhou University，Key Laboratory of Green Pesticide and Bioengineering，Ministry of
Education，Guiyang 550025）
Abstract: In this paper, 18 bacteria were isolated from a soil in which avermectin（AVM）was used for a long time by enrichment
culture, these bacteria can use AVM as sole source of carbon and nitrogen. Ultraviolet spectrophotometry method was used to test the AVM-
degradation ratio of these strains, four showed a better rate of degradation, and the best was named AW1-18. Degradation ability of the AW1-18
was tested by high performance liquid chromatography method, the results indicated that the AVM-degrading rate is up to 75% on the condition of
100 mg/L AVM, pH7, 30℃ and sharking culture with 150 r/min after 6 d. Using the universal primers, the 16S rRNA of AW1-18 was amplified
by PCR and sequenced. Compared with the published nucleotide sequence of 16S rRNA in GenBank（Accession number ：JQ316540）, the
16S rRNA of AW1-18 showed 99% homology with Acinetobacter tandoii. According to the morphological, physiobiochemical characteristics, the
strain AW1-18 was identified as Acinetobacter tandoii.
Key words: Avermectin Bacterium biodegradation Isolation Identification Acinetobacter tandoii
张卫等［1］通过模拟农药飘移和流失评价发现，
阿维菌素在土壤环境中半衰期为 20-47 d，而灭菌
土壤中不会发生阿维菌素的代谢。对阿维菌素与土
壤结合能力的研究表明，阿维菌素与土壤颗粒紧密
结合，使之成为环境中的非流动性农药，在土壤中
易形成结合态残留［2］。阿维菌素的长期大量使用已
带来了环境污染及农副产品农药残留等问题，而减
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期224
少或解除阿维菌素在土壤中污染的途径主要有光解
和微生物降解［3］。微生物的降解作用是环境中农药
分解与转化的重要途径，利用微生物治理农药污染
是一种行之有效的方法，已显示出良好的应用前景。
本研究从长期使用阿维菌素的菜豆田土壤中，分离
筛选出 4 株能有效降解阿维菌素的微生物，并对其
中降解率最好的一株降解菌进行鉴定，综合形态、
生理生化特性和 16S rRNA 序列分析确定其分类学和
系统发育地位 , 旨在丰富阿维菌素降解菌株的多样
性，也为农药污染土壤的生物修复提供了菌株资源。
1 材料与方法
1.1 材料
土壤来源及处理 ：土样是从贵州省贵阳市花溪
区多年使用阿维菌素农药的菜豆地里集，土样取至
5-10 cm 深度，经风干后碾碎，除去砂砾和植株残物，
过 40 目筛后装瓶于 4℃冰箱中保存备用。阿维菌素
原药（Bla 96%）：由陕西标正作物科学有限公司
提供。
相关培养基按文献配制：无机盐基础培养基［4］；
富集培养基 ：在无机盐基础培养基中添加一定量浓
度的阿维菌素 ；LB 培养基［4］；1/10 LB 培养基［4］；
牛肉膏蛋白胨培养基 ［5］；固体培养基 ：在各液体培
养基中添加 20 g/L 琼脂，所有培养基均需在 121℃
高温灭菌 30 min。
1.2 方法
1.2.1 菌株的富集与分离 在 50 mL 含 50 mg/L 阿
维菌素的富集培养基中加入 1 g 土样，于 30℃，150
r/min 条件下摇床培养 7 d 后，吸取 5 mL 转接至新的
富集培养基中，每次培养基中阿维菌素浓度提高 50
mg/L，至阿维菌素浓度增为150 mg/L。如此驯化3周，
于含 100 mg/L 阿维菌素的 1/10 LB 培养基固体平板
上梯度稀释涂布，30℃培养，待平板上出现单菌落后，
再挑取单菌落在相同浓度的 1/10 LB 培养基平板上
划线培养，直至纯化。选择生长良好的菌株在斜面
培养基上培养 24 h 后，4℃保存。
1.2.2 降解菌株的筛选及分析方法
1.2.2.1 菌悬母液的配制 将目标菌株无菌操作条
件下接种至 LB 培养基中，于 30℃、150 r/min 恒温
摇床上培养 24 h。按文献［6］的具体方法配制菌悬
母液。
1.2.2.2 阿维菌素降解率的测定 取目标菌株菌悬
液按 2.5% 的量接于含 100 mg/L 阿维菌素的无机盐
培养基中，滴几滴 Tween 80 乳化剂，30℃，150 r/min
摇床培养，同时设不接菌的空白对照，每个平行 3
次重复。定期取样做前处理后测定阿维菌素的含量，
按公式计算阿维菌素的降解率。
降解率 =（Cck － Cx）/Cck × 100%
式中，Cck 为不接菌对照培养液中阿维菌素浓度
（mg/L）；Cx 为接菌培养液中阿维菌素浓度（mg/L）。
1.2.2.3 紫外分光光度分析法 阿维菌素降解菌初
筛的分析方法采用紫外分光光度分析法（UV 法）。
按 1.2.2.1 和 1.2.2.2 操作，得到的样品前处理方法如
下 ：取样 1 mL 加入 4 mL 二氯甲烷，充分振荡混合
提取 2 min，静置分层，弃去上层水相，有机相过
无水硫酸钠柱，用二氯甲烷稀释至 10 mL，采用 UV
1900 双光束紫外可见分光光度计，在最大波长下进
行阿维菌素含量的测定。计算菌株对阿维菌素的降
解率，保留有降解能力的菌株作为复筛的候选菌株。
1.2.2.4 高效液相色谱测定法 阿维菌素降解菌复
筛的分析方法采用高效液相色谱分析法（HPLC 法）。
高效液相色谱仪为 Agilent 1100，使用紫外检测器，
检测波长为 246 nm，色谱柱为 ZORBAX SB-C18（4.6
mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇 / 水（92 8，V/V），
流量为 1 mL/min，进样量为20 μL。按1.2.2.1和1.2.2.2
操作，得到的样品前处理方法如下 ：取样 2 mL 加入
4 mL 乙腈溶液，加入 1.5 g NaCl，涡旋混合 2 min，
静置 30-60 min，上清液经 0.45 μm 有机系微孔滤膜
过滤，滤液用于 HPLC 分析，计算复筛候选菌株降
解率。
1.2.3 降解菌株的鉴定
1.2.3.1 降解菌株的形态观察及生理生化鉴定 将
降解菌采用平板涂布法接种，30℃恒温培养 24 h 后
观察菌落形态，用光学显微镜和电子显微镜观察菌
体形态，参照《常见细菌系统鉴定手册》对其进行
生理生化特性试验［5］。
1.2.3.2 降解菌株 16S rRNA 基因序列测定 菌株在
LB 培养基中 30℃振荡培养至对数期，4 000 r/min 离
心收集菌体。按照细菌基因组 DNA 提取试剂盒方法
（北京三博远志生物技术有限公司）分离纯化菌株基
2012年第10期 225胡秀虹等 ：一株阿维菌素降解菌 AW1-18 的筛选与分类鉴定
2 结果
2.1 菌株的富集与分离
在 LB 培养基平板上，菌落数量众多，大小颜
色形态不一。经多次划线分离纯化，得到 18 株细菌，
编号由 AW1-1 到 AW1-18。
2.2 降解菌株的筛选与分析
将获得的所有菌株通过 UV 法测定其对阿维菌
素的降解能力。对阿维菌素-二氯甲烷溶液的最大吸
收波长进行了测定，结果见图 1；UV 法测定 AVM 的
标准曲线，见图 2。研究表明，有 4 株菌对 AVM 有
较好的降解能力，分别为 AW1-1、AW1-5、AW1-12
和 AW1-18，在含 100 mg/L 阿维菌素的无机盐基础
培养液中，这些菌株培养至第 3 天的降解率均大于
因组 DNA。根据原核生物 16S rRNA 保守序列通用
引 物［7］：27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）
和 1492R（5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3），
以 AW1-18 的基因组 DNA 为模板，对该菌株的 16S
rRNA 进行 PCR 扩增，采用 50 μL 反应体系，反应
条件为 ：94℃ 5 min ；94℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃
1 min，30 个循环 ；72℃ 10 min。PCR 扩增产物送
北京三博远志生物技术有限公司测序，测序结果在
NCBI 用 Blast 软件与 GenBank 中已知的相关属种的
16S rRNA 序列进行同源性分析，采用 Clustal X1.83
软件进行多序列比对［8］，用 MEGA 5.0 软件包中
Kimura 2-Parameter Distance 模型进行多序列匹配排
列［9］，用 Neighbor-Joining 法构建系统发育树［10］。
图 1 UV法扫描图谱 图 2 UV法标准曲线
30%，其中菌株 AW1-18 的降解率最大，为 35%。
HPLC 法 测 定 AVM 的 标 准 曲 线 见 图 3。 经
HPLC 法研究表明，AW1-18 对阿维菌素有降解
性，与培养时间相关。培养至第 3 天其降解率仅为
26.8%，到第 6 天其降解率直线上升为 75.0%，再到
图 3 HPLC法标准曲线
第 9 天其降解率达 75.6%，曲线基本趋于平行，结
果见图 4。
2.3 降解菌株的形态及生理生化特性鉴定
AW1-18 的电镜，如图 5 所示。该菌株在生长
过程中具有明显的球杆变化，培养初期为杆状（图
图 4 AW1-18降解阿维菌素的曲线图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期226
5-A），随着时间的增加，逐渐变短，到了生长稳定
期时呈球状（图 5-B）。其部分形态学特征和生理生
化特性指标，分别见表 1 和表 2。
2.4 基于16S rRNA基因序列的系统发育分析和分
子鉴定
经测序，AW1-18 的序列长度为 1 415 bp，Gen-
Bank 登录号为 ：JQ316540。将其与数据库中同源性
较高的 17 个模式菌株进行比较，构建系统发育进化
树（图 6）。发育树中 AW1-18 的 16S rRNA 序列与
不动杆菌属 Acinetobacter中的 A. tandoii DSM 14970
（GenBank 登 录 号 为 GU388181） 和 A. tandoii CCM
7199（GenBank 登录号为 HQ180189）在同一个分
支上，亲缘关系最近，序列相似性分别为 99.6% 和
99.7%。从图 6 可以看出，菌株 AW1-18 与 A. tandoii
聚为一簇的可信度为 99%。
图 5 菌株 AW1-18培养初期（5-A，5000×）和生长稳定
期（5-B，45000×）的扫描电镜照片
表 1 降解菌株 AW1-18的形态特征
菌落形态 菌体形态
形状 圆形 大小 （9.8-15.7）μm×（3.6-4.7）μm
颜色 浅黄色 形状 杆状
透明度 不透明 革兰氏染色 阴性
表面状态 光滑湿润黏稠 芽孢 -
边缘 整齐 纤毛 -
隆起度 略有隆起 荚膜 -
“－”表示没有
表 2 降解菌株 AW1-18的生理生化特性
实验名称 结果 试验名称 结果
葡萄糖发酵（产酸） + 吲哚试验 -
果糖发酵（产酸） + 乙酰甲基甲醇试验 +
乳糖发酵（产酸） + 明胶液化试验 +
蔗糖发酵（产酸） + 过氧化氢酶试验 +
阿拉伯糖发酵（产酸） + 淀粉水解试验 +
棉籽糖发酵（产酸） + 甲基红试验 +
甘露糖发酵（产酸） + Tween80 试验 -
甘露醇发酵（产酸） + 硝酸盐还原试验 +
肌醇发酵（产酸） + 柠檬酸盐利用试验 +
木糖发酵（产酸） + 硫化氢产生试验 +
葡萄糖发酵（产气） - 脲酶试验 +
棉子糖发酵（产气） + 氧化酶试验 -
甘露糖发酵（产气） + 果糖发酵（产气） -
甘露醇发酵（产气） + 阿拉伯糖发酵（产气） +
“+”：阳性反应 ；“－”：阴性反应
3 讨论
近年来阿维菌素在我国已成为甲胺磷等高毒农
药的替代品，其单剂和混剂产品在害虫防治工作中
发挥着重大的作用。随着阿维菌素在农业上的大规
模使用，其在农田生态系统中的残留不断增加，因
此对土壤和水体造成了一定的污染。目前国外报道
的关于阿维菌素的研究主要集中在光解动态和环境
中阿维菌素残留的检测技术等方面［11，12］，有关阿
维菌素微生物降解动态与机理方面的研究报道较少，
国内有张卫等［13］做过一定研究。至今，国内已报
道的可降解阿维菌素的微生物主要有嗜麦芽寡养单
胞菌、伯克霍尔德氏菌属［4］、蜡样芽孢杆菌［14］。不
动杆菌属作为土壤中常见微生物，其对农药和有机
污染物的降解研究国内已有报道［15-19］，而有关不动
杆菌属细菌对生物源农药阿维菌素有降解作用的报
道本研究尚属首次。
在降解菌株的降解率测定过程中，本试验采用
UV 法先初筛，然后再用 HPLC 法复筛，经过多次检
测验证，避免了筛选到的目标菌株为假降解菌株的
可能。综合运用形态特征、生理生化特性以及 16S
rRNA 序列分析对菌株 AW1-18 进行分类鉴定，菌株
AW1-18 鉴定为 A. tandoii。
不动杆菌 AW1-18 在实验室条件下对阿维菌素
2012年第10期 227胡秀虹等 ：一株阿维菌素降解菌 AW1-18 的筛选与分类鉴定
有较高的降解能力，但该菌株是否能够降解土壤中
的阿维菌素尚需将其回接至污染土壤中，借助高效
液相色谱法分析阿维菌素浓度和残留产物，才能准
确判定该菌株的实际修复能力。另外，还应进一步
研究降解菌株的降解机理和对其他农药的降解谱，
并通过菌株诱导，生长条件的优化获得更高降解率
的菌株，为将微生物应用到农药污染土壤的实际生
物修复中提供有力的科学依据。
4 结论
从长期施用阿维菌素的菜豆土壤中分离筛选出
4 株降解效果较好的细菌，其中降解率最好的是菌
株 AW1-18，在含 100 mg/L 的阿维菌素无机盐基础
培养液中，当接种量为 2.5% 时，30℃，150 r/min，
pH7的条件下培养6 d后，该菌株降解率达75%以上。
根据菌株的形态、生理生化特性及 16S rRNA 分析，
菌株 AW1-18 为不动杆菌属的 Acinetobacter tandoii，
菌株号为 A. tandoii AW1-18。
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（责任编辑 狄艳红）